技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种CDKN1B基因 突变检测特异性引物和液相芯片。
背景技术
CDKN1B基因全称周期蛋白依赖激酶抑制因子1B（cyclin dependentkinase inhibitor 1B， CDKN1B），又称为p27，Kip1，定位于12号染色体12p13.1-p12短臂上，是一种调控细胞周期 并抑制细胞分裂的重要基因。CDKN1B基因编码的P27蛋白为细胞周期素(cyclin)依赖性蛋白 激酶抑制因子，其编码的蛋白质含有198个氨基酸，相对分子质量约27×103，由2个外显子和 2个内含子组成。P27蛋白质N端没有结构锌指的结构域，C端有2个分开的核定位信号。p27 主要与cyclin结合而发挥对cyclin2CDK的抑制作用,具有多种生物学功能：(1)可直接抑制 cyclin2CDK复合物的生物学活性，从而阻止细胞由G1期向S期的转变，同时还可作为细胞外 刺激信号的潜在媒介来调控细胞周期。(2)促进细胞分化，介导细胞间黏附及诱导细胞凋亡。 Gardner等发现，缺氧可诱导p27的产生，抑制CDK2的活性，从而阻滞细胞周期，如减少或 清除p27将清除缺氧所致的G1期阻滞，但也有p27抑制细胞凋亡的报道。p27诱导还可抑制 细胞凋亡，可能与细胞类型、生长状态及其恶性化与否有关。(3)与细胞衰老有关。Tsukiyama 等发现，CD4与CD8-的胸腺细胞和激活的成熟T细胞的p27表达下降，人为上调p27表达后， 可引起胸腺细胞发育障碍和成熟T细胞增殖能力下降，推测p27表达下降对T细胞的发育、增 殖及免疫反应是必需的。研究表明，pRb导致细胞衰老可因p27表达减弱而丧失，pRb可能通 过转录后的调节上调p27表达，并特异性地抑制CDK2活性来延长细胞周期阻滞，从而实现其 诱导衰老的作用。p27作为细胞周期的负性调节因子，被认为是一种抑癌基因。大量研究发现， p27基因多态性位点与甲状腺乳头状癌、心肌梗塞、子宫内膜癌、卵巢癌的发生呈现显著相关 性。
目前，CDKN1B基因突变检测方法主要有：PCR-RFLP技术、荧光定量PCR技术和 Affymetrix 芯片技术，PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如 位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电 泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该 法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。荧光定量PCR技术具有灵敏度高、特异性 强、自动化程度高的特点，但也存在样品易污染、假阳性率高的缺点，且每次只能检测一种 突变类型。虽然高通量是Affymetrix芯片技术比较成熟,然而该芯片技术对于中低密度的临 床诊断型芯片并不合适,很难在同一个反应体系中扩展检测众多生物学性状相关的SNP或标 签SNP。另外，Affymetrix芯片主要在表达谱芯片上比较强，物种较多，在SNP 芯片上相对 较弱，而且检测价格昂贵，并不能满足实际需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供CDKN1B基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单独或并 行检测CDKN1B基因三种常见基因型G-79A、G-838T和T326G的野生型和突变型。
实现上述目的的技术方案如下。
一种CDKN1B基因突变检测液相芯片，包括有：
（A）.针对CDKN1B基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每 条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特 异性引物序列为：针对G-79A位点的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8，针对G-838T位点的SEQ ID NO.9 及SEQ ID NO.10，和/或针对T326G位点的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12；所述tag序列选自 SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6；
（B）.有不同anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微 球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.18，且所 述anti-tag序列能相应地与（A）中所选的tag序列互补配对；
（C）.用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
在其中一个实施例中，所述扩增引物为：针对G-79A位点的SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20， 针对G-838T位点的SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22，和/或针对T326G位点的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24。
在其中一个实施例中，所述ASPE引物为：针对G-79A位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.7 组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.8组成的序列，针对G-838T位点的由SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO.9组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.10组成的序列，和/或针对T326G位 点的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.11组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.12组成的序列。
本发明的另一目的是提供用于CDKN1B基因突变检测的特异性引物。
实现上述目的技术方案如下。
用于CDKN1B基因突变检测的特异性引物，所述特异性引物序列为：针对G-79A位点 的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8，针对G-838T位点的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10，和/或针对 T326G位点的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12。
本发明的主要优点在于：
1.本发明所提供的CDKN1B基因突变检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100 ％。且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的 CDKN1B基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序 列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体 ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。
2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取 了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位 点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引 物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低 于3％；除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检 测效果一致。
3.本发明的检测方法步骤简单，3种突变位点检测可通过一步PCR即可完成3条含有突变位点 的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可 大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有 的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。 检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结 果更加准确可靠。
具体实施方式
实施例1CDKN1B基因突变检测液相芯片，主要包括有：
一、ASPE引物
针对CDKN1B基因三种常见基因型G-79A、G-838T和T326G的野生型和突变型，分别 设计特异性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表 所示：
表1CDKN1B基因的ASPE引物序列（tag序列+特异性引物序列）
每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’ 端为突变型或野生型特异的引物片段（如上述表1所示）。所有ASPE引物由上海生工生物工 程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL 的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序 列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的6种微球编号与微球上相 应的anti-tag序列如表2所示：
表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列
选择的6种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被于微球上。anti-tag序列与微球 之间连接有5－10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5－10个T的间隔臂序 列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌 ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将 anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序 列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括 多聚dT，即poly（dT），寡聚四聚乙二醇以及（CH2）n间隔臂（n≥3），如（CH2）12、（CH2） 18等。另外，如果存在poly（dA）干扰，还可以用poly（TTG）作为间隔臂。本发明间隔臂 优选为5－10个T，微球包被的过程如下：
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球（购自Luminex公司）悬浮于50ul 0.1mol/L的 MES溶液中（pH4.5），加入10ul合成的anti-tag分子（100nmol/ml）。配制10ng/ml的EDC（N- （3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide）（购自Pierce Chemical公司）工作液。往微球 悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30 分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后 的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris（pH8.0）]，1mmol/L EDTA中，2-8℃避光保存。
三、扩增出含有突变位点的目标序列的引物
针对CDKN1B基因三种常见基因型G-79A、G-838T和T326G，设计扩增引物对（见 表3），扩增出3条含有3个突变位点的目标序列。
表3扩增出具有突变位点的目标序列的引物
所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用 10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
实施例2运用实施例1所述的CDKN1B基因突变检测液相芯片对样本的检测
所述各种溶液的配方如下：
50mM的MES缓冲液（pH5.0）配方（250ml）：
2×Tm杂交缓冲液
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取：
参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法，得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
设计3对引物，多重PCR一步扩增出3条分别含CDKN1B基因三种常见基因型G-79A、 G-838T和T326G的目标序列，产物大小分别为242bp、380bp、283bp，引物序列（SEQ ID NO.19-24）见上述表3所示。
首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQ ID NO.19-24的引物贮存液100ul于1.5ml微 量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：
PCR扩增程序为：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min；4℃ 保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
1.取7.5ul PCR反应后的产物，加入1ul 10×SAP缓冲液、1ul SAP酶和0.5ul Exo-I酶；
2.37℃孵育15min，80℃孵育15min，灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的 ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应（ASPE）
利用实施例1中设计的ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的 dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液：分别取待检测基因相应的野生型和突变型ASPE引物 贮存液10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE 混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：
反应程序为：96℃2min；94℃30s，54℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物，每组选择相应的6种包被的微球（如实施例1所述），每种微球浓 度均为2.5×105个/ml；
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；
3.微球于≥10000g离心1-2min；
4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH2O；
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；
7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；
8.杂交后的微球于≥3000g离心2－5min；
9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；
10.微球于≥3000g离心2－5min；
11.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红 蛋白（SA-PE）；
12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。检测结果如表4、表5和表6所示。
对荧光值（MFI）和数据处理有以下要求：
1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI；
2.NET MFI=样品MFI－PCR阴性对照MFI（NET MFI小于0的以0表示）；
3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值：
突变比值＝突变型NET MFI÷（突变型NET MFI＋野生型NET MFI）
4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值（cut-off值），以划分野生型纯合子、杂合 子和突变型纯合子。
使用本方法检测20份样本的CDKN1B基因SNP位点，实验数据符合上述要求，因此可 计算得它们的突变比值。阈值（cut-off值）的设置如下：突变比值范围在0%-20%视为野生型 纯合子；30%-70%视为杂合子；80%-100%视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结 果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的 CDKN1B基因型检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的CDKN1B基 因SNP检测液相芯片能够准确地检测出CDKN1B的SNP类型，且结果稳定可靠。
表4样本检测结果（MFI）之一
表5样本CDKN1B基因突变比值（%）
表6样本CDKN1B基因突变类型分析结果
样本号 液相芯片检测结果 测序结果 1 野生型 野生型 2 野生型 野生型 3 野生型 野生型 4 野生型 野生型 5 野生型 野生型 6 野生型 野生型 7 野生型 野生型 8 326TG 326TG 9 野生型 野生型 10 野生型 野生型 11 野生型 野生型 12 野生型 野生型 13 -838TT -838TT 14 野生型 野生型 15 野生型 野生型 16 野生型 野生型 17 野生型 野生型 18 野生型 野生型 19 野生型 野生型 20 野生型 野生型
实施例3不同的ASPE引物的液相芯片对CDKN1B基因SNP位点的检测
一、液相芯片制备的设计（Tag序列及Anti-Tag序列的选择）
以CDKN1B基因G-79A、G-838T和T326G位点突变检测液相芯片为例，分别针对G-79A、 G-838T和T326G的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的 Tag序列则选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对 的anti-tag序列选自SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.18。具体设计如下表（表7）所示。ASPE引物 的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表7液相芯片制备的设计
一、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测 结果如下：
表8样本CDKN1B基因G-79A检测结果与基因多态性分析
表9样本CDKN1B基因G-838T检测结果与基因多态性分析
表10样本CDKN1B基因T326G检测结果与基因多态性分析
从上述实施例可见，其它针对不同突变位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的tag序列， 其结果依然稳定可靠，具体数据省略。而ASPE引物选用实施例1中tag序列与特异性引物序列 搭配时，效果更佳（信噪比更好），参见本实施例试验组1、试验组5和试验组9。其它不同tag 序列与特异性引物序列搭配，与实施例2和本实施例的结果相同，具体数据省略。
实施例4CDKN1B基因突变检测特异性引物序列的选择
一、液相芯片制备的设计（野生型和突变型特异性引物序列的选择）
以CDKN1B基因G-79A和T326G的多态性位点检测液相芯片为例，以该突变位点所 在目标序列的正向或反向互补序列为模板，分别针对G-79A和T326G的野生型和突变型设计 ASPE引物3’端的特异性引物序列，包括本发明实施例1中优选的特异性引物序列和2条备 选的特异性引物序列，如表11所示。其中，内碱基为多态性位点。
表11特异性引物序列
以CDKN1B基因G-79A和T326G的多态性位点检测液相芯片为例，针对G-79A和 T326G选用不同的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的tag序列则固定为实施例1中的最 佳效果序列，并选用与之相对应的anti-tag序列，具体设计如下表（表12）所示。ASPE引物 的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表12液相芯片制备的设计之二
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品41-60进行检测，检 测结果如下：
表13样本CDKN1B基因G-79A检测结果与基因多态性分析
表14样本CDKN1B基因T326G检测结果与基因多态性分析
由本实施例可见，ASPE引物选用实施例1中特异性引物序列与tag序列搭配时，效果更 佳（信噪比更好），参见本实施例试验组10和试验组13。其它来源于目标检测位点所在序 列的正向或反向互补序列的不同特异性引物序列与tag序列搭配，与实施例2和本实施例的 结果相同，即依然是实施例2中所述的特异性引物序列与不同的tag序列搭配效果更佳，具 体数据省略。
其它针对不同的SNP位点的多种特异性引物序列与tag序列搭配，与实施例2和本实施 例的结果相同，即实施例1所选择的特异性引物，具有更好的信噪比，检测效果也更好，具 体数据省略。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此 而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。