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1、(10)授权公告号 CN 102766623 B (45)授权公告日 2013.12.18 CN 102766623 B *CN102766623B* (21)申请号 201210235665.1 (22)申请日 2012.07.06 C12N 15/11(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (73)专利权人 中国农业科学院作物科学研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12 号 专利权人 新疆农业科学院粮食作物研究所 (72)发明人 郝转芳 翁建峰 李明顺 梁晓玲 柳思思 阿布来提 邵红雨 韩登旭 杨杰 李新海 张世煌。
2、 (74)专利代理机构 北京维澳专利代理有限公司 11252 代理人 马佑平 CN 101942512 A,2010.08.25, 全文 . 王立静.玉米显性矮秆基因Dt的鉴定与精细 定位 .中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业 科技辑 .2010,( 第 03 期 ),D047-52. 李雪华 等， . 干旱条件下玉米耐旱相关性状 的 QTL 一致性图谱构建 . 中国农业科学 .2005, 第 38 卷 ( 第 5 期 ),882-890. Zhuanfang Hao， et al.Identification of Functional Genetic Variations Underly。
3、ing Drought Tolerance in Maize Using SNP Markers.Journal of Integrative Plant Biology .2011, 第 53 卷 ( 第 8 期 ),641652. (54) 发明名称 玉米耐旱种质鉴定和筛选 CAPS 标记及其检 测方法和应用 (57) 摘要 本发明提供了玉米耐旱种质鉴定的分子标 记， 所述分子标记包括dhnC397和rspC1090， 其中 所述分子标记 dhnC397 的核苷酸序列如 SEQ.ID No1 所示， 所述分子标记 rspC1090 的核苷酸序列 如 SEQ.ID No 2 所示。本发明提供。
4、的分子标记及 其方法用于耐旱标记辅助选择， 开辟了耐旱分子 标记应用于育种工作的先河。同时本发明提供的 分子标记也将大大提高育种中耐旱的选择效率， 具有很大的应用潜力和较高的经济价值。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 靳春鹏 权利要求书 1 页 说明书 11 页 序列表 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书11页 序列表3页 附图2页 (10)授权公告号 CN 102766623 B CN 102766623 B *CN102766623B* 1/1 页 2 1. 一种利用分子标记进行玉米耐旱种质鉴定和筛选的检测。
5、方法， 其特征在于， 具体步 骤为 ： 利用分子标记为 dhnC397 和 rspC1090 的引物扩增目标植物玉米基因组 DNA， 得到该 分子标记在目标植物玉米中的特征谱带， 所述携带目标等位基因型的玉米谱带所测得的核 苷酸序列如SEQ.ID No1和SEQ.ID No2所示 ； 其中， 所述分子标记dhnC397的核苷酸序列如 SEQ.ID No1所示， 所述分子标记rspC1090的核苷酸序列如SEQ.ID No2所示 ； 所述dhnC397 的引物序列如 SEQ.ID No3 和 SEQ.ID No4 所示， 所述 rspC1090 的引物序列如 SEQ.ID No5 和 SEQ.I。
6、D No6 所示 ； 所述分子标记的 PCR 扩增体系如下 ： 20L 反应体系包括正、 反向引 物各 0.5M， 0.2mM dNTPs， 2.5mM MgCl2,1X Taq buffer， 0.5units Taq 聚合酶， DNA 模板 100ng ； 所述 PCR 扩增的程序为 ： 94预变性 5min;94变性 30s,55 -60退火 45s,72 延伸 30-60s,37 个循环 ;72延伸 5-10min ； PCR 扩增后获得的 DNA 序列用 8的聚丙烯酰 胺凝胶电泳即可获得的所述的特征谱带。 2. 权利要求 1 所述方法在玉米耐旱种质鉴定和筛选及分子标记辅助育种中的应用。
7、。 权 利 要 求 书 CN 102766623 B 2 1/11 页 3 玉米耐旱种质鉴定和筛选 CAPS 标记及其检测方法和应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 特别涉及玉米耐旱种质鉴定和筛选的 CAPS（C1eaved Amplified Polymorphic Sequences） 标记及其检测方法和应用。 背景技术 0002 玉米目前已成为世界和我国播种面积最大的禾谷类作物。 随着全球畜牧业迅速发 展和应用玉米加工液体燃料乙醇工业的迅速攀升 , 对玉米的需求量大幅度增加。然而， 全 球性气候变化引发干旱发生周期越来越短， 程度越来越重， 对粮食生产构成严重威胁。 据统 。
8、计， 每年因干旱造成玉米减产约 20% 30%， 干旱已成为玉米产量的重要限制因素 （苏治军 等， 2010） 。尽管传统育种技术在作物遗传改良方面取得了显著成就， 但由于其选择效率较 低、 周期较长， 已不能满足当前玉米生产对优良品种的需求。 利用基因组学和生物信息学的 最新研究成果， 开展玉米分子标记育种研究， 构建实用、 经济、 高效的分子育种技术体系， 选 育高产优质多抗玉米新品种， 已经成为玉米育种的重要研究方向 （李建生等， 2007） 。 0003 耐旱性是一个非常复杂的数量性状。 分子数量遗传学的发展促进了分子标记的更 新和高密度遗传连锁图谱的构建， 发掘出大量与数量性状相关的。
9、 QTL （Quantitative Trait Loci） ， 同时也促进了MAS(Marker-assisted selection)在数量性状选择上的应用。 MAS是 通过利用与目标性状紧密连锁的 DNA 分子标记对目标性状进行间接选择的现代育种技术， 可以使育种家无需测定表型就能够追踪调控耐旱性状的遗传位点， 可免去多年多点的大量 田间测试工作， 提高选择效率。Bernier 等 （2009） 指出 QTL 效应在不同的群体和环境中缺 乏重复性是限制了 QTL 在 MAS 上应用的两个重要因素。此外， 验证耐旱基因和在基因内开 发有效的标记十分困难。因此， 一方面利用一致性耐旱 QTL。
10、 及其潜在的基因是解决辅助育 种一种有效途径 （Hao et al.,2010） 。另一方面使用功能基因内部引起表型性状变异的多 态性基序开发出来功能标记将更有效地固定群体中的优异等位基因， 并由此开发的功能标 记将在育种中有助于对不同背景遗传材料的性状选择 （Hao et al.,2011） 。 0004 酶切扩增多态性序列 （C1eavedAmplified Polymorphic Sequences， CAPS） 又称为 RFLP-PCR技术， 是根据EST或已发表的基因序列等设计特异引物， 将特异PCR与限制性酶切 相结合而检测多态性的一种技术， 即属于以 PCR 为基础的共显性的分子。
11、标记。它的基本原 理是先用已知位点的 DNA 序列去设计一套特异性的 PCR 引物 （1927bp） 。然后应用这些引 物去扩增该位点上的某一 DNA 片段 ； 接着用一种专一性的限制性内切酶切割所得的扩增带 并进行 RFLP 分析。与以杂交为基础的 RFLP 相比， 它具有如下优点 :（1） 引物与限制酶组 合非常多， 增加了揭示多态性的机会， 而且操作简便， 可用琼脂糖凝胶电泳分析 ；（2） 在真 核生物中， CAPS 标记呈共显性， 即可区分纯合基因型和杂合基因型 ；（3） 所需 DNA 量少 ；（4） 结果稳定可靠 ；（5） 操作快捷、 自动化程度高。 0005 CAPS 标记技术因具。
12、有共显性、 位点特异性、 操作简单、 成本低、 所需 DNA 样品量少 和对 DNA 的纯度要求不高等优点， 因此受到了科研人员的重视。目前已成为现代生物学研 究的一个非常重要的分子标记技术， 在种质鉴定、 辅助育种、 基因鉴定和图谱构建等领域得 说 明 书 CN 102766623 B 3 2/11 页 4 到相当广泛的应用。 发明内容 0006 为了解决上述问题， 本发明的目的在于筛选出玉米耐旱种质鉴定和筛选的 CAPS 标记。 0007 本发明的另一目的在于提供上述分子标记的检测方法。 0008 本发明的还一目的在于提供上述分子标记在耐旱基因检测以及标记辅助育种中 的应用。 0009 为。
13、了实现本发明目的， 本发明提供了一种玉米耐旱种质鉴定的分子标记， 所述分 子标记包括 dhnC397 和 rspC1090， 所述分子标记 dhnC397 的核苷酸序列如 SEQ.ID No1 所 示， 所述分子标记 rspC1090 的核苷酸序列如 SEQ.ID No2 所示。 0010 dhnC397 和 rspC1090 两个标记是基于玉米耐旱基因 dhn1 和 rsp41 基因多态性基 序开发的。其中， dhnC397 是基于 dhn1 基因中 G/A 碱基突变而开发的一种功能性分子标 记。根据 dhn1 基因序列信息设计特异性引物， 扩增出一段长度为 164bp 的片段。图 1 中，。
14、 在基因序列 397 位点处发生了 G 与 A 的变异 （CCAAGG/CCAAAG） ， 限制性内切酶 StyI 可以识 别 CCAAGG。PCR 产物经 StyI 酶切后， 含有 G 位点的目的片段被酶切成 131bp 和 33bp 的两 个片段， 而含有 A 位点的目的片段由于缺少 StyI 酶切识别位点， 因此不能被酶切。其中， rspC1090 是基于 rsp41 基因中 G/A 碱基突变而开发的一种功能性分子标记。根据 rsp41 基 因序列信息设计特异性引物， 扩增出一段长度为 286bp 的片段。图 2 中， 在基因序列 1090 位点处发生了 G 与 A 的变异 （CCGG/。
15、CCAG） ， 限制性内切酶 HpaII 可以识别 CCGG 位点。PCR 产物经 HpaII 酶切后， 含有 G 位点的目的片段被酶切成 225bp 和 61bp 的两个片段， 而还有 A 位点的目的片段由于缺少 HpaII 酶切识别位点， 因此不能被酶切。 0011 本发明还提供了扩增上述述分子标记的引物。 0012 所述 dhnC397 的引物序列如 SEQ.ID No3 和 SEQ.ID No4 所示， 所述 rspC1090 的引 物序列如 SEQ.ID No5 和 SEQ.ID No6 所示。 0013 本发明还提供了含有所述分子标记的载体。所述载体为植物、 组织或细胞等。 001。
16、4 一种利用分子标记进行玉米耐旱种质鉴定和筛选的检测方法， 该方法所用的分子 标记为 dhnC397 和 rspC1090。 0015 具体的， 上述检测方法的步骤为 ： 利用所述分子标记的引物扩增目标植物基因组 DNA， 得到该分子标记在目标植物中的特征谱带， 所述携带目标等位基因型的植株谱带所测 得的核苷酸序列为所述的分子标记的核苷酸序列。所述植物优选为玉米， 所述目标植物基 因组 DNA 优选为耐旱和不耐旱玉米基因组 DNA。 0016 优选的， 上述检测方法的步骤为 ： 利用上述分子标记的引物扩增耐旱和不耐旱基 因组 DNA， 得到该分子标记在玉米中的特征谱带， 该特征谱带分为耐旱优异。
17、等位基因型的植 株谱带和不耐旱等位基因型的植株谱带， 所述携带耐旱优异等位基因型的植株谱带所得到 的核苷酸序列为上述的分子标记的分子标记的核苷酸序列。 0017 上述方法中， PCR 反应扩增体系为 ： 0018 20L 反应体系包括正、 反向引物各 0.5M， 0.2mM dNTPs， 2.5mM MgCl2,1X Taq buffer， 0.5units Taq 聚合酶， DNA 模板 100ng。 说 明 书 CN 102766623 B 4 3/11 页 5 0019 上述方法中， PCR 扩增程序为 ： 94预变性 5min;94变性 30s,55或 60退火 45s,72延伸 30。
18、-60s,37 个循环 ;72延伸 5-10min。 0020 Sty I 酶切反应体系 ： 0021 0022 Hpa II 酶切反应体系 ： 0023 0024 37反应 12-16h， 然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 （8） 。 0025 本发明还提供了所述分子标记在玉米耐旱种质鉴定和筛选及分子标记辅助育种 中的应用 0026 本发明还提供了所述检测方法在玉米耐旱种质鉴定和筛选及分子标记辅助育种 中的应用。 0027 本发明具备的有益效果在于 ： 0028 1） 本发明的分子标记可用于耐旱种质检测和标记辅助育种。 本发明提供的分子标 记信息主要来源于一致性通用耐旱 QTL 或耐旱功能基因， 。
19、可靠性强。非常适合现代农业分 子育种的实现。 0029 2） 本发明开发的功能标记， 与耐旱基因功能多态性位点相关， 直接用于耐旱分子 标记辅助育种， 本发明为复杂数量性状功能标记的开发和应用提供了重要的理论基础和实 践经验。 0030 3） 本发明的提供的分子标记用于耐旱标记辅助选择， 集所有标记耐旱特征谱带的 材料将为耐旱材料， 为耐旱性分子标记引物应用于育种工作中开辟先河。并将大大提高育 种中耐旱的选择效率， 具有很大的应用潜力和较高的经济价值。 附图说明 0031 图 1 为本发明 dhnC397 功能标记扩展示意图。 0032 图 2 为本发明 rspC1090 功能标记扩展示意图。。
20、 说 明 书 CN 102766623 B 5 4/11 页 6 0033 图 3 为 dhnC397 功能标记在自交系中扩增的聚丙烯凝胶电泳图。 0034 图 4 为 rspC1090 功能标记在自交系中扩增的聚丙烯凝胶电泳图。 具体实施方式 0035 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明的保护范 围。 0036 若未特别指明， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 0037 实施例 1 利用功能基因多态性基序设计和开发 CAPS 功能标记 0038 材料:试。
21、验选用210份我国玉米生产和育种中的常用自交系 （Hao et al.,2011） 。 这些自交系分别来源于不同玉米生态区， 属于不同的杂种优势亚群， 具有广泛的遗传基础。 这些自交系来源于 BSSS、 PA、 PB、 Lan（兰卡斯特） 、 LRC（旅大红骨） 和 SPT（四平头） 这六个 亚群。 0039 玉米耐旱全基因组关联分析 ： 根据基因芯片技术， 利用 1536SNP（Single Nucleotide Polymorphism） 多态性信息。 采用TASSEL软件中混合线性模型 （Mixed Linear Model,MLM） 方法对关联数据进行分析发现， 在玉米 10 条染色体。
22、上 121 个多态性 SNPs 位点 与耐旱相关性状相关联。在这些显著关联位点中， 29 个 SNP 位点被认为与耐旱有关。因此， 它们被认为具有潜在的耐旱功能变异。本研究中， 选取了 2 个与多个耐旱性状密切相关的 SNP 位点， 分别为 PZA0355.1 和 PZA01671.1。PZA0355.1 是含有 A/G 位点变异， 位于 6 号染 色体， 与其相关的基因为 dhn1 ； PZA01671.1 位于 5 号染色体， 含有 A/G 碱基突变， 与 rsp41 基因有关联。这两个基因都被证实与作物的耐旱性有关 （Hao et al.， 2011） 。 0040 对现有的 SNP 相。
23、关 ID 序列信息， 根据自己的要求， 利用在线工具 （http:/helix. wustl.edu/dcaps/dcaps.html） 分析最佳酶切位点和选择限制性内切酶。而后利用 NCBI （http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 的 BLAST 功能寻找同源信息最高的序列信 息。然后用 DNAMAN 软件将下载的序列打开， 并与 SNP ID 序列 （100bp） 比对， 找出突变 SNP 位点两侧附近延伸碱基序列， 总长度约 500bp。再利用 Primer5.0 软件， 固定 SNP 位点一端 （带改变碱基的酶切位点） 的引物， 使突变位点为 。
24、PCR 扩增延伸的第一个碱基， 而后用该软件 需找另一端合适的引物 ； 要求， 退火温度 （Tm） 值约 60， 将上、 下游引物 TM 值调至相近， 产 物大小为 90-140bp 左右。将设计的引物下载， 并在其中固定的一条引物链中， 根据所选择 的限制性内切酶， 变化相应的1-2个碱基， 复查后合成引物。 CAPS标记引物则可根据序列信 息直接用 Primer5.0 软件设计引物。 0041 表 1 根据玉米耐旱基因 dhn1 和 rsp41 基因多态性基序开发的两个功能标记、 内切 酶、 引物序列和玉米基因组内扩增片段大小。 0042 说 明 书 CN 102766623 B 6 5/。
25、11 页 7 0043 对于已设计合成的引物， 要经过一系列 PCR 验证和酶切摸索分析。首先， 用芯片材 料对合成引物进行预扩产物效果验证， 判断扩增条带大小与设计的目的条带是否一致， 同 时验证引物设计的扩增效果 （条带清晰度和稳定性） 是否理想， 对于不理想的引物重新设计 和验证 ； 第二， 选择优良的引物扩增芯片材料条带， 进行相应的限制性酶切酶反应、 聚丙烯 酰胺凝胶电泳分析， 判断是否能清晰的区分 SNP 位点。第三， 标记的单克隆及鉴定分析， 通 过测序对 PCR 产物进行验证。 0044 实施例 2 利用 CAPS 功能标记进行耐旱检测和应用 0045 dhnC397CAPS 。
26、功能标记耐旱性鉴定分析 ： 通过对 210 份玉米自交系为试验材料进 行基因型验证， 除了M14、 B104、 新自218、 2002F22、 DP62-7和吉495外， 其余的204份自交系 在dhnI基因中都能扩增出大小为164bp片段。 图3显示了dhnC397功能标记在自交系中扩 增的聚丙烯凝胶电泳图。 对204份自交系进行田间耐旱鉴定， 有8份自交系没有获得田间数 据 （N28、 N528-1、 金黄 59、 早 8-3、 C28、 T8、 新自 153-2 和自 495） 根据综合选择标准值我们将 196 份自交系的耐旱程度分为 5 个等级， 分别为 HR （高耐旱 highly 。
27、drought tolerance） ， R （耐旱 drought tolerance） ， M（中度耐旱 middle drought tolerance） ， S（旱敏感 drought susceptible） ， HS（高感 highly drought susceptible） 。对具有田间耐旱表型数据的 196 份自交系经过 StyI 酶切后， 其中 55 份自交系被酶切成两条分别为 131bp 和 33bp 片段， 被 确定是 G 等位变异， 同时 141 份自交系由于缺少酶切识别位点并没有被切开， 被确定是 A 等 位变异。从扩增谱带中看出， 在 G 等位变异自交系中含有 7。
28、 份耐旱自交系 (HR+R) 和 24 份 旱敏感自交系 (HS+S) 分别占总比例的 12.7% 和 43.6% ； A 等位变异自交系中含 34 份耐旱自 交系和 53 份旱敏感自交系所占比例分别为 24.1% 和 37.6%。由此看出含 A 等位变异自交系 的耐旱性 （24.1%） 高于 G 等位变异自交系的耐旱性 （12.7%） （表 2） 。含 A 等位变异自交系 （0.01） 的耐旱选择指数高于旱 G 等位变异自交系 （-0.26） 的 0.27（表 4） 。 0046 表 2 玉米 dhnC397CAPS 功能标记检测的自交系耐旱性评价 0047 0048 rspC1090CAP。
29、S 功能标记耐旱性鉴定分析 ： 通过对 210 份玉米自交系为试验材料进 行基因型验证， 除了长 3、 铁 7922、 红玉米、 DP62-7 和 5022(B) 外， 其余的 205 份自交系在 rsp41 基因中都能扩增出大小为 286bp 的目的片段。对 205 份自交系进行田间耐旱表型鉴 定， 除去 9 份没有获得田间数据的自交系 （N28、 N528-1、 2002F22、 金黄 59、 早 8-3、 C28、 T8、 新自 153-2 和自 495） ， 剩余的 196 份自交系经过 HpaII 酶切后， 108 份自交系被酶切成两 说 明 书 CN 102766623 B 7 6。
30、/11 页 8 条分别为 225bp 和 61bp 片段， 同时 88 份自交系由于缺少酶切识别位点并没有被切开。图 4rspC1090 功能标记在自交系中扩增的聚丙烯凝胶电泳图。在 G 等位变异自交系中含有 30 份耐旱自交系和 31 份旱敏感自交系分别占总比例的 27.8% 和 28.7% ； A 等位变异自交系中 含 10 份耐旱自交系和 47 份旱敏感自交系所占比例分别为 11.4% 和 53.4%。由此看出含 A 等位变异自交系的耐旱性与含 G 等位变异自交系的相比， 其比较不耐旱 （53.4%28.7%） （表 4） 。 含G等位变异自交系 （0.19） 的耐旱选择指数高于含A等位。
31、变异自交系 （-0.37） 的0.56。 而同时选择两个标记的优势等位变异时， 自交系的耐旱选择指数将提高到 0.83（表 6） 。 0049 表 3 玉米 rspC1090CAPS 功能标记检测的自交系耐旱性评价 0050 0051 表 4210 份玉米自交系功能标记检测情况和耐旱性评价 0052 0053 说 明 书 CN 102766623 B 8 7/11 页 9 0054 说 明 书 CN 102766623 B 9 8/11 页 10 0055 说 明 书 CN 102766623 B 10 9/11 页 11 0056 说 明 书 CN 102766623 B 11 10/11 。
32、页 12 0057 说 明 书 CN 102766623 B 12 11/11 页 13 0058 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明技术原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。 说 明 书 CN 102766623 B 13 1/3 页 14 0001 0002 序 列 表 CN 102766623 B 14 2/3 页 15 0003 序 列 表 CN 102766623 B 15 3/3 页 16 序 列 表 CN 102766623 B 16 1/2 页 17 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102766623 B 17 2/2 页 18 图 4 说 明 书 附 图 CN 102766623 B 18 。