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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610311783.4 (22)申请日 2016.05.12 (71)申请人 常州英赞美科生物科技有限公司 地址 213000 江苏省常州市新北区河海西 路106号 (72)发明人 周亚萍于海燕朱钰峰曹利民 (74)专利代理机构 常州市维益专利事务所 32211 代理人 王凌霄 (51)Int.Cl. C12N 9/04(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C12Q 1/54(2006.01) C12Q 1/30(2006.01) C12Q 1/26(。
2、2006.01) (54)发明名称 吡喃糖氧化酶及其表达纯化方法和应用 (57)摘要 本发明涉及一种吡喃糖氧化酶， 利用基因工 程技术制备吡喃糖氧化酶多肽链， 构建重组质 粒、 重组表达并且纯化， 测定吡喃糖氧化酶的活 性， 然后配置试剂盒检测人血清中的葡萄糖含 量， 试剂盒包括试剂 和试剂两部分。 本发明的 有益效果是： 通过基因工程重组表达吡喃糖氧化 酶， 该酶产量高、 工艺简单、 稳定性好、 成本低； 利 用计算机软件分析了吡喃糖氧化酶的氨基酸序 列， 并根据大量文献研究， 选用了不同种属的吡 喃糖氧化酶中同源性高的多肽链， 表达了有功能 性的多肽， 既保证了吡喃糖氧化酶的活性， 又保 。
3、证重组蛋白的可溶性表达， 较容易表达纯化和使 用， 过程简单； 吡喃糖氧化酶法检测血糖的方法 简单、 稳定、 准确， 能较好地抗VC、 溶血、 乳糜、 黄 疸的干扰。 权利要求书3页 说明书10页 附图2页 CN 105861456 A 2016.08.17 CN 105861456 A 1.一种吡喃糖氧化酶， 其特征是： 所述的吡喃糖氧化酶的氨基酸序列如SEQIDNO： 1所 示； 编码吡喃糖氧化酶的基因如SEQIDNO： 2所示的核苷酸序列。 2.权利要求1所述的吡喃糖氧化酶的表达纯化方法， 其特征是： 所述的吡喃糖氧化酶的 表达方法是： 通过表达载体质粒在大肠杆菌菌株BL21中采用IPT。
4、G进行诱导表达， 采用裂解 法释放吡喃糖氧化酶后得到重组吡喃糖氧化酶。 3.权利要求1所述的吡喃糖氧化酶的表达纯化方法， 其特征是： 所述的吡喃糖氧化酶的 纯化方法是： 采用His-TrapFFcrude柱纯化吡喃糖氧化酶， 平衡柱子后加入蛋白粗提物， 洗脱吡喃糖氧化酶， 收集各步洗脱液， SDS-PAGE电泳分析蛋白纯化情况； 采用SephadexG- 25脱盐柱脱盐， 平衡柱子后加入纯化的蛋白， 脱盐液脱盐， 收集各步洗脱液， SDS-PAGE电泳 分析蛋白纯化情况， Bradford法测定蛋白浓度后备用。 4.根据权利要求3所述的吡喃糖氧化酶的表达纯化方法， 其特征是： 所述的吡喃糖氧化。
5、 酶的纯化过程中添加与吡喃糖氧化酶共价结合的辅助因子黄素腺嘌呤二核苷酸。 5.权利要求1所述的吡喃糖氧化酶的应用， 其特征是： 纯化的吡喃糖氧化酶检测人血清 中的葡萄糖， 检测方法是： 利用吡喃糖氧化酶将人血清中葡萄糖氧化生成过氧化氢， 过氧化 氢与4-氨基安替吡啉和苯酚类显色系统在过氧化酶催化下生成有色物质， 进行比色分析从 而测定人血清中葡萄糖的含量。 6.权利要求1所述的吡喃糖氧化酶的应用， 其特征是： 制备测定人血清中葡萄糖的含量 的试剂盒， 试剂盒包括试剂 和试剂两部分， 其中试剂 含有4-氨基安替吡啉、 过氧化氢 酶、 抗坏血酸氧化酶、 表面活性剂、 缓冲液、 防腐剂和稳定剂； 试。
6、剂含有吡喃糖氧化酶、 2- 羟基-3-间苯胺丙磺酸钠、 亚铁氰化钾、 牛血清白蛋白、 缓冲液、 防腐剂和稳定剂。 7.根据权利要求6所述的吡喃糖氧化酶的应用， 其特征是： 每升试剂 溶液中各组分的含量为： 每升试剂溶液中各组分的含量为： 权利要求书 1/3 页 2 CN 105861456 A 2 8.根据权利要求7所述的吡喃糖氧化酶的应用， 其特征是： 每升试剂 溶液中各组分的含量为： 每升试剂溶液中各组分的含量为： 9.根据权利要求6所述的吡喃糖氧化酶的应用， 其特征是： 所述的表面活性剂为曲拉通 权利要求书 2/3 页 3 CN 105861456 A 3 X-100、 B66、 吐温2。
7、0、 十二烷基苯磺酸钠、 甜菜碱、 十六烷基三甲基溴化铵中的一种或几种。 10.根据权利要求6所述的吡喃糖氧化酶的应用， 其特征是： 所述的稳定剂与防腐剂为 叠氮钠、 叠氮锂、 PC300、 苯甲酸钠、 山梨酸钾、 对羟基苯甲酸丙酯、 聚乙二醇、 聚乙烯醇、 乙二 胺四乙酸二钠中的一种或几种。 权利要求书 3/3 页 4 CN 105861456 A 4 吡喃糖氧化酶及其表达纯化方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及一种吡喃糖氧化酶及其表达纯化方法和应用。 背景技术 0002 血清中检测葡萄糖含量的方法主要包括葡萄糖氧化酶法和己糖激酶法。 葡萄糖氧 化酶法是利用葡萄糖氧化酶(GOD)催化D。
8、-葡萄糖的第一个碳原子形成葡萄糖酸内酯， 己糖 激酶法是利用己糖激酶(HK)催化葡萄糖和ATP发生磷酸化反应， 生成葡萄糖-6-磷酸与ADP。 这是目前临床上测定血清中葡萄糖含量的应用较多的方法。 吡喃糖氧化酶(PROD， EC 1.3.10)能催化一类碳水化合物在第二个碳原子上发生反应生成2-酮基类衍生物和过氧化 氢。 D-葡萄糖是吡喃糖氧化酶高度特异的底物， 具有较小的Km值(0.83mM-3.1mM)， 但是葡萄 糖氧化酶的Km值是33mM。 而且葡萄糖氧化酶和己糖激酶只能作用于 -D-葡萄糖， 而吡喃糖 氧化酶能作用于 -和 -D-葡萄糖， 这些特性使得吡喃糖氧化酶可直接可测定血清中或。
9、事物 中的葡萄糖， 不需要变旋酶的作用。 0003 近年来大量研究表明， 吡喃糖氧化酶能催化血清中的1,5-脱水-D-山梨醇(1,5- anhydro-D-glucitol， 1,5-AG)， 这是一个新的用于糖尿病诊断和监控的客观指标。 1,5-AG 水平的下降与血液中葡萄糖浓度存在密切关系。 目前我们通常采用空腹血糖、 糖化血红蛋 白、 果糖胺等葡萄糖相关物质作为代谢指标。 空腹血糖反映了即时的血糖水平。 果糖胺 (FMN)反映近2-3周的平均血糖水平， 糖化血红蛋白(HbA1c)反映2-3个月平均血糖水平， 1, 5-AG恰恰能反映近期内(1-数日)的平均血糖值， 特别是最近的尿糖排泄情。
10、况。 单独使用各 项指标时糖尿病的灵敏度是1,5-AGHbA1c空腹血糖FMN， 可见用一项指标诊断糖代谢 异常， 1,5-AG效果最好。 由此可见， 吡喃糖氧化酶在糖尿病诊断中的应用前景广阔。 0004 吡喃糖氧化酶是由担子菌纲的微生物产生的一类葡萄糖2位氧化酶， 在以D-葡萄 糖为底物， 分子氧作为电子受体时呈现最高活性， 在pH6.2和50时表现最大活性； 在pH 5.0-7.4之间稳定， 大于70时完全失去活性。 Ag+、 Cu2+和对氯高汞苯甲酸(PCMB)能抑制活 性。 PROD是已知酶中较大的含黄素蛋白的酶， 由623个氨基酸残基构成， 由共价结合的黄素 腺嘌呤二核苷酸(FAD)。
11、形成多肽链， 由相对分子质量为65103的相同的4个亚单位组成， 总 的相对分子质量为290103。 0005 目前吡喃糖氧化酶主要是通过真菌类微生物的提取获得， 但产量低、 纯化工艺繁 杂， 因此用基因工程方法构建更优良的PROD生产菌株一直受到高度重视。 发明内容 0006 本发明要解决的技术问题是： 基于上述问题， 本发明提供一种吡喃糖氧化酶及其 表达纯化方法和应用。 利用基因工程技术制备吡喃糖氧化酶多肽链， 构建重组质粒、 重组表 达并且纯化， 测定吡喃糖氧化酶的活性， 然后配置试剂盒， 检测人血清中的葡萄糖含量。 0007 本发明解决其技术问题所采用的一个技术方案是： 一种吡喃糖氧化。
12、酶， 吡喃糖氧 化酶的氨基酸序列如SEQIDNO： 1所示； 编码吡喃糖氧化酶的基因如SEQIDNO： 2所示的核 说明书 1/10 页 5 CN 105861456 A 5 苷酸序列。 0008 吡喃糖氧化酶的表达方法是： 通过表达载体质粒在大肠杆菌菌株BL21中采用IPTG 进行诱导表达， 采用裂解法释放吡喃糖氧化酶后得到重组吡喃糖氧化酶。 0009 吡喃糖氧化酶的纯化方法是： 采用His-TrapFFcrude柱纯化吡喃糖氧化酶， 平衡 柱子后加入蛋白粗提物， 洗脱吡喃糖氧化酶， 收集各步洗脱液， SDS-PAGE电泳分析蛋白纯化 情况； 采用SephadexG-25脱盐柱脱盐， 平衡柱。
13、子后加入纯化的蛋白， 脱盐液脱盐， 收集各步 洗脱液， SDS-PAGE电泳分析蛋白纯化情况， Bradford法测定蛋白浓度后备用。 0010 进一步地， 吡喃糖氧化酶的纯化过程中添加与吡喃糖氧化酶共价结合的辅助因子 黄素腺嘌呤二核苷酸。 0011 纯化的吡喃糖氧化酶检测人血清中的葡萄糖， 检测方法是： 利用吡喃糖氧化酶将 人血清中葡萄糖氧化生成过氧化氢， 过氧化氢与4-氨基安替吡啉和苯酚类显色系统在过氧 化酶催化下生成有色物质， 进行比色分析从而测定人血清中葡萄糖的含量。 0012 吡喃糖氧化酶制备测定人血清中葡萄糖的含量的试剂盒， 试剂盒包括试剂 和试 剂两部分， 其中试剂 含有4-氨基。
14、安替吡啉、 过氧化氢酶、 抗坏血酸氧化酶、 表面活性剂、 缓冲液、 防腐剂和稳定剂； 试剂含有吡喃糖氧化酶、 2-羟基-3-间苯胺丙磺酸钠、 亚铁氰化 钾、 牛血清白蛋白、 缓冲液、 防腐剂和稳定剂。 0013 进一步地， 每升试剂 溶液中各组分的含量为： 0014 0015 0016 每升试剂溶液中各组分的含量为： 说明书 2/10 页 6 CN 105861456 A 6 0017 0018 进一步地， 每升试剂 溶液中各组分的含量为： 0019 0020 每升试剂溶液中各组分的含量为： 0021 0022 0023 进一步地， 表面活性剂为曲拉通X-100、 B66、 吐温20、 十二烷。
15、基苯磺酸钠、 甜菜碱、 十六烷基三甲基溴化铵中的一种或几种。 说明书 3/10 页 7 CN 105861456 A 7 0024 进一步地， 稳定剂与防腐剂为叠氮钠、 叠氮锂、 PC300、 苯甲酸钠、 山梨酸钾、 对羟基 苯甲酸丙酯、 聚乙二醇、 聚乙烯醇、 乙二胺四乙酸二钠中的一种或几种。 0025 本发明的有益效果是： (1)本发明通过基因工程重组表达吡喃糖氧化酶， 该酶产量 高、 工艺简单、 稳定性好、 成本低； 0026 (2)本发明利用计算机软件分析了吡喃糖氧化酶的氨基酸序列， 并根据大量文献 研究， 选用了不同种属的吡喃糖氧化酶中同源性高的多肽链， 表达了有功能性的多肽， 既保。
16、 证了吡喃糖氧化酶的活性， 又保证重组蛋白的可溶性表达， 较容易表达纯化和使用， 过程简 单； 0027 (3)本发明对吡喃糖氧化酶进行了表达和纯化， 破碎后上清液经一步亲和层析纯 化得到蛋白， 可溶性蛋白占总蛋白量超过50， PROD的表达量达200mg/L； 使用Ni2+亲和层析 柱对重组蛋白进行纯化， 再通过SephadexG-25脱盐柱脱盐后， 蛋白纯度达到95以上； 在 整个纯化过程中通过添加与PROD共价结合的辅助因子黄素腺嘌呤二核苷酸， 保证了PROD的 良好活性； 0028 (4)建立了基于PROD催化反应产物葡萄糖生成过氧化氢反应测定PROD酶活性的方 法， 纯化后的PROD。
17、单位酶活为50U/mg； 0029 (5)吡喃糖氧化酶法检测血糖的方法简单、 稳定、 准确， 能较好地抗VC、 溶血、 乳糜、 黄疸的干扰。 附图说明 0030 下面结合附图对本发明进一步说明。 0031 图1是本发明的吡喃糖氧化酶的重组质粒的测序结果图； 0032 图2是本发明的试剂盒线性范围图； 0033 图3是本发明的试剂盒与血糖氧化酶法检测临床样本的相关性图； 0034 图4是本发明的试剂盒与血糖己糖激酶法检测临床样本的相关性图。 具体实施方式 0035 现在结合具体实施例对本发明作进一步说明， 以下实施例旨在说明本发明而不是 对本发明的进一步限定。 0036 一、 吡喃糖氧化酶及其表。
18、达纯化 0037 (1)吡喃糖氧化酶氨基酸序列的筛选 0038 利用DNATOOLS、 ANTHEPROT等生物信息软件， 通过计算机分析比对不同种属的吡喃 糖氧化酶的氨基酸序列， 得到同源性高的氨基酸序列。 再结合大量文献资料， 筛选得到以下 稳 定 性 好 、酶 活 性 高 的 吡 喃 糖 氧 化 酶 的 氨 基 酸 序 列 为 ： MSTSSSDPFFNFAKSSFRSAAAQKASASSLPPLPGPDKKVPGMDIKYDVVIVGSGPIGCTYARELVGAGYKVAMFDI GEIDSGLKIGAHKKNTVEYQKNIDKFVNVIQGQLVSVSVPVNTLVVDTLSPT。
19、SWQASTFFVRNGSNPEQDPLRNLSG QAVTRVVGGMSTHWTCATPRFDREQRPLLVKDDADADDAEWDRLYTKAESYFQTGTDQFKESIRHNLVLNKLAEEYK GQRDFQQIPLAATRRSPTFVEWSSANTVFDLQNRPNTDAPEERFNLFPAVACERVVRNASNSEIESLHIHDLISGDR FEIKADVYVLTAGAVHNTQLLVNSGFGQLMRPNPTNPPELLPSLGSYITEQSLVFCQTVMSTELIDSVKSDMTIRGT PGELTYSVTYTPGASTNKHPDWWNEKVKNHMMQHQEDPLP。
20、IPFEDPEPQVTTLFQPSHPWHTQIHRDAFSYGAVQQS 说明书 4/10 页 8 CN 105861456 A 8 IDSRLIVDWRFFGRTEPKEENKLWFSDKITDAYNMPQPTFDFRFPAGRTSKEAEDMMTDMCVMSAKIGGFLPGSLPQ FMEPGLVLHLGGTHRMGFDEKEDSCCVNTDSRVFGFKNLFLGGCGNIPTAYGANPTLTAMSLAIKSCEYIKQNFTPS PFTSEAQ 0039 相对应的吡喃糖氧化酶的DNA序列为： 0040 说明书 5/10 页 9 CN 105861456 A 9 0041 0042。
21、 (2)吡喃糖氧化酶的蛋白序列的基因克隆、 重组质粒的构建、 重组质粒的筛选与鉴 定均委托公司完成。 测序结果见图1。 0043 (3)融合蛋白的表达 0044 将由公司构建好而且鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)， 转化子接 种至含5mLLB培养基(含氨苄青霉素50 g/mL)的试管内， 37250rpm摇床培养过夜。 将过夜 培养的菌体按照1的比例转种于250mlLB培养液(含氨苄青霉素50 g/mL)。 37摇床培养 至OD600到0.6-0.8。 从重组菌中取10mL培养液作为未诱导对照， 在剩下的培养液中加IPTG 至终浓度0.1mmol/L， 37继续振荡培养诱导3。
22、h， 离心收集菌体进行SDS-PAGE检测， 重组子 表达分子量为大约71kD的融合蛋白， 蛋白纯度达到90以上， 而对照菌无此蛋白带。 0045 (4)表达融合蛋白的纯化和脱盐 0046 His-TrapFFcrude柱、 SephadexG-25柱由GEHealthcare公司产品， 其余试剂均 为国产或进口分析纯试剂。 0047 1、 将250ml诱导表达融合蛋白的工程菌离心(8000rpm、 10min、 4)收菌， 菌体重悬 于原培养液1/10体积的裂解液(PBSPH7.4、 500mmol/LNaCl、 20mmol/L咪唑、 50 mol/L黄素 腺嘌呤二核苷酸(FAD)内， 冰。
23、浴超声破菌10min， 离心(12000rpm、 10min、 4)， 收集上清。 说明书 6/10 页 10 CN 105861456 A 10 0048 2、 His-TrapFFcrude柱纯化蛋白 0049 将His-TrapFFcrude柱连接到蠕动泵， 先用平衡液PBSpH7.4、 500mmol/LNaCl、 20mmol/L咪唑冲洗平衡， 然后将上步获得的裂解缓冲液经0.22微米滤器过滤后上样， 上样 流速为1mL/min。 上样结束后再用10倍柱床体积平衡液(PBSpH7.4、 500mmol/LNaCl、 20mmol/L咪唑)平衡， 流速为1.5ml/min， 最后用5倍。
24、柱床体积洗脱缓冲液(500mM咪唑、 PBS pH7.4、 500mmol/LNaClpH8.0)， 每管1ml收集洗脱液， 然后每管取15微升进行SDS-PAGE电 泳， 取含分子量为71kD目的蛋白量较多、 较纯的管， 备用。 0050 3、 SephadexG-25脱盐柱脱盐 0051 将5mlSephadexG-25S脱盐柱连接到蠕动泵， 先用平衡液50mmolTris-HCl、 150mmol/LNaCl、 50 mol/LFAD冲洗2-3倍柱体积平衡， 然后将上步纯化的蛋白经0.22微米 滤器过滤后上样1-1.5mL， 上样流速为1mL/min。 上样结束后再用2-3倍柱床体积脱盐。
25、液 (50mmolTris-HCl、 150mmol/LNaCl、 50 mol/LFAD)脱盐， 流速为1mL/min， 用试管收集前2- 2.5ml的目的蛋白。 然后取15微升进行SDS-PAGE电泳。 用Bradford法测定蛋白浓度后备用。 0052 (5)吡喃糖氧化酶活性的测定 0053 酶的活性检测在反应体系为3mL100mmol/LMES缓冲液， pH6.0中进行， 包含 131mmol/LD-葡萄糖、 0.2mmol/L4-氨基安替比林(4AA)、 0.3mmol/L2-羟基-3-间甲苯胺 丙磺酸钠(TOOS)和过氧化物酶(POD)。 37预孵育5min后， 加入适量酶液， 在。
26、546nm波长下连 续测定2-3分钟的吸光度值， 得到酶的每分钟吸光度值的变化(OD样本)， 以不加酶液的反 应液为对照， 得到空白样本的每分钟吸光度值的变化(OD空白)。 0054 按照计算公式： 酶活(U/ml)OD/min(OD样本-OD空白)1.89稀释倍数 (df)， 得到吡喃糖氧化酶(PROD)的酶活力。 0055 二、 吡喃糖氧化酶的应用 0056 (1)纯化的吡喃糖氧化酶检测人血清中的葡萄糖 0057 通过吡喃糖氧化酶(PROD)将样本中葡萄糖(GLU)氧化生成过氧化氢(H2O2),过氧化 氢再在过氧化酶(POD)催化下， 借4-氨基安替吡啉(4AA)和苯酚类显色系统， 生成有。
27、色物质， 在特定的波长下检测吸光度， 从而测定出样本中葡萄糖的含量。 0058 (2)制备测定人血清中葡萄糖的含量的试剂盒 0059 1、 检测试剂盒的用法： 0060 R1试剂： 在50mMpH8.0的TRIS-HCL缓冲液中， 添加1mmol/L4-AA、 2KU/LPOD、 1KU/ L抗坏血酸氧化酶(ASOD)、 0.01曲拉通X-100、 0.1叠氮钠， 搅拌均匀即为R1试剂。 0061 R2试剂： 在50mMpH8.0的TRIS-HCL缓冲液中， 添加10KU/LPROD、 2mmol/L2-羟基- 3-间苯胺丙磺酸钠(TOOS)、 0.01亚铁氰化钾、 1BSA、 0.75EDT。
28、A、 0.1叠氮钠， 搅拌均 匀即为R2试剂。 0062 葡萄糖校准品： 在12mmol/L的苯甲酸溶液中， 加入5mmol/L的葡萄糖。 0063 检测方法： 0064 以日立7080生化分析仪为例： 测定波长是546nm， 测定方法是2点终点法。 样品量 3uL， R1试剂210uL， R2试剂70ul， 校准方式是线性测定， 反应方向是向上。 校准品与R1混合 后， 在反应第16点读取吸光度值A1， 加入R2， 在31点读取吸光度值A2， 计算吸光度差值 A A 2 - A 1 。取 待 测 样 本 ，同 法 测 定 样 本 的 吸 光 度 差 值 ，将 其 代 入 公 式 说明书 7/。
29、10 页 11 CN 105861456 A 11 即可计算得出 待测样本中的GLU的含量。 0065 2、 灵敏度检测： 以蒸馏水作样本连续检测20次， 取其均值+3s作为最低检测限， 即 为该方法的灵敏度。 试验所得本法的灵敏度为： 0.054mmol/L。 0066 3、 线性范围检测： 取临床高值混合血清(39mmol/)用生理盐水进行倍比稀释， 得到 9个浓度的稀释血清， 每个浓度的稀释血清重复检测3次， 取其均值， 将实测值与理论值进行 直线回归分析。 如图2统计分析显示该方法的回归方程为： y0.991x+0.177R20.999P 0.05， 该方法在0.6139mmol/L内。
30、线性较好(见表1)。 0067 表1本发明试剂盒线性范围 0068 0069 0070 4、 重复性检测： 批内重复性试验： 取三份高(19.82mmol/L)、 中(7.61mmol/L)、 低 (3.02mmol/L)临床样本混合血清连续检测20次， 则其变异系数分别为0.55、 1、 0.87 (见表2)； 日间重复性试验： 每日检测临床生化高(21.6mmol/L)、 中(12.2mmol/L)、 低 (2.4mmol/L)质控血清一次， 连续检测20天， 则其变异系数分别为1.04、 2.16、 2.21 (见表3)。 0071 表2本发明试剂盒批内重复性检测(mmol/L) 007。
31、2 类别均值标准差CV 低值3.080.0260.87 中值7.580.0761.00 高值19.710.1080.55 0073 表3本发明试剂盒日间重复性(mmol/L) 0074 类别均值标准差CV 低值2.530.0562.21 中值12.620.0272.16 高值20.90.0221.04 0075 5、 回收试验： 向0.9ml临床低值样本中加入0.1ml生理盐水作为基础样本， 向0.9ml 说明书 8/10 页 12 CN 105861456 A 12 临床低值样本中分别加入0.1ml临床高、 中、 低值样本作为回收样本， 经该方法检测后计算 其回收率分别为102.4、 104。
32、.9、 97.1。 0076 6、 干扰试验： 基础样本： 向0.9ml临床中值样本中加入0.1ml生理盐水； 干扰样本： 向0.9ml临床中值样本中分别加入0.1ml系列稀释的干扰物VC(最大100mg/L)、 血红蛋白(最 大14.2g/L)、 脂肪乳(最大14g/L)及胆红素(最大14g/L)。 用本法分别测定基础样本及各干 扰样本， 可见在Vc含量100mg/dL时， 其干扰率为正干扰0.66(见表4)； 血红蛋白含量为 14.2g/L时， 其干扰率为正干扰1.45(见表5)； 甘油三脂在51.56mmol/L时， 其干扰率是负 干扰0.4(见表6)； 胆红素在545 mol/L时， 。
33、其干扰率是负干扰2.7(见表7)。 0077 表4本发明试剂盒维生素C干扰实验结果(mmol/L) 0078 0079 表5本发明试剂盒溶血干扰实验结果(mmol/L) 0080 0081 表6本发明试剂盒脂肪乳干扰实验结果(mmol/L) 0082 0083 表7本发明试剂盒胆红素干扰实验结果(mmol/L) 0084 0085 7、 本发明试剂盒与血糖氧化酶法和己糖激酶法试剂盒临床样本的相关性检测 0086 在0.6139mmol/L内选择50例临床样本， 分别用本法、 已糖激酶法(罗氏医学诊断 公司)及葡萄糖氧化酶法(罗氏医学诊断公司)检测， 得到本法与氧化酶法的回归方程为： y 0.9。
34、84x-0.061R20.996P0.05(见图3)， 本法与已糖激酶法的回归方程为： y0.970 x- 0.138R20.997P0.05(见图4)。 0087 我国目前血清中检测葡萄糖含量的方法主要包括葡萄糖氧化酶法和己糖激酶法。 这两种酶原料的生产主要是天然纯化， 产量低、 工艺繁杂、 稳定性差， 而且主要依赖进口厂 家生产。 吡喃糖氧化酶与葡萄糖氧化酶、 己糖激酶法相比， 对底物D-葡萄糖亲和力更高， 反 说明书 9/10 页 13 CN 105861456 A 13 应速率更快。 而且吡喃糖氧化酶能作用于 -和 -D-葡萄糖， 不需要另加变旋酶。 同时， 本发 明通过基因工程重组表。
35、达吡喃糖氧化酶， 该酶产量高、 工艺简单、 稳定性好、 成本低。 0088 本发明利用计算机软件分析了吡喃糖氧化酶的氨基酸序列， 并根据大量文献研 究， 选用了不同种属的吡喃糖氧化酶中同源性高的多肽链， 表达了有功能性的多肽， 既保证 了吡喃糖氧化酶的活性， 又保证重组蛋白的可溶性表达， 较容易表达纯化和使用， 过程简 单。 0089 本发明对吡喃糖氧化酶(PROD)进行了表达和纯化， 破碎后上清液经一步亲和层析 纯化得到蛋白， 可溶性蛋白占总蛋白量超过50， PROD的表达量达200mg/L。 使用Ni2+亲和层 析柱对重组蛋白进行纯化， 再通过SephadexG-25脱盐柱脱盐后， 蛋白纯。
36、度达到95以上。 在整个纯化过程中通过添加与PROD共价结合的辅助因子黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)， 保证 了PROD的良好活性。 建立了基于PROD催化反应产物葡萄糖生成过氧化氢反应测定PROD酶活 性的方法， 纯化后的PROD单位酶活为50U/mg。 0090 PROD配置的检测人血清中葡萄糖含量的试剂盒检测限是0.039mmol/L。 线性范围 0.6139mmol/L。 批内重复性变异系数CV 5， 日间重复性变异系数CV 5， 平均回收率 是101， 维生素C100mg/dL以下， 血红蛋白14.2g/L以下， 甘油三酯51.56mmol/L以下， 胆红 素545 mol/L以下无显。
37、著性干扰。 该方法与葡萄糖氧化酶法、 己糖激酶法相关性良好。 由此 可见， 吡喃糖氧化酶法检测血糖的方法简单、 稳定、 准确， 能较好地抗VC、 溶血、 乳糜、 黄疸的 干扰。 0091 以上述依据本发明的理想实施例为启示， 通过上述的说明内容， 相关工作人员完 全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内， 进行多样的变更以及修改。 本项发明的技术 性范围并不局限于说明书上的内容， 必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。 说明书 10/10 页 14 CN 105861456 A 14 图1 图2 说明书附图 1/2 页 15 CN 105861456 A 15 图3 图4 说明书附图 2/2 页 16 CN 105861456 A 16 。