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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610245599.4 (22)申请日 2016.04.20 (71)申请人 桂林理工大学 地址 541004 广西壮族自治区桂林市建干 路12号 (72)发明人 莫凌云李海翔蒋敏敏张欢 林华游少鸿张学洪 (51)Int.Cl. C12N 1/36(2006.01) (54)发明名称 一种砷还原微生物的驯化培养方法 (57)摘要 本发明公开了一种砷还原微生物的驯化培 养方法。 配制好培养基高压蒸汽灭菌， 生理盐水 瓶经过无菌水清洗后放入超净工作台紫外灭菌； 用注射器向生理盐。
2、水瓶中注入灭菌后的培养基， 并接种10%的厌氧活性污泥； 向瓶中充入氢气再 抽空， 反复操作46次， 最后充满氢气， 放入恒温 振荡器中培养， 每天向瓶中补足氢气； 培养几天 后， 从瓶中抽取10%的混合液注入新的生理盐水 瓶中， 并加入20 gAs()/L； 连续培养， 当As ()基本被去除后， 将混合液中As()的浓度增 加到50 gAs()/L， 重复补充As()、 碳源和氮 源， 直至瓶中产生大量微生物絮体并且As()的 去除率达到稳定， 即完成砷还原微生物的驯化培 养。 权利要求书1页 说明书3页 CN 105861409 A 2016.08.17 CN 105861409 A 1。
3、.一种砷还原微生物的驯化培养方法， 其特征在于具体步骤为： (1)将配制好的培养基溶液放入高压蒸汽灭菌锅内121灭菌2030min， 然后取出再放 入超净工作台冷却至室温备用； (2)用注射器将生理盐水瓶中的生理盐水抽尽， 然后注入无菌水清洗再抽出， 重复清洗 46次， 最后放入超净工作台中紫外灭菌2030min； (3)从生活污水处理厂中取回厌氧污泥， 倒入烧杯中静置， 形成固液临界面； (4)用注射器向步骤(2)处理后的生理盐水瓶中注入步骤(1)处理后的培养基溶液， 并 从步骤(3)静置烧杯中的固液临界面处吸取接种污泥也注入步骤(2)处理后的生理盐水瓶， 接种量为10%， 然后用注射器抽尽。
4、生理盐水瓶中上空空气， 将生理盐水瓶倒立从底部充入氢 气， 再抽空， 反复操作46次， 以排尽生理盐水瓶中的空气和混合液中的溶解氧， 最后充满氢 气， 放入恒温振荡器中连续培养， 设置条件为： 150r/min、 30； 每天向生理盐水瓶中补足消 耗掉的氢气， 连续培养24天， 制得混合液； (5)按照步骤(2)处理生理盐水瓶， 备用； (6)从步骤(4)的生理盐水瓶中抽取10%制得的混合液注入步骤(5)处理后的生理盐水 瓶中， 并向生理盐水瓶中加入浓度为20 gAs(V)/L的Na2HASO47H2O， 然后用注射器抽尽生 理盐水瓶中上空空气， 将生理盐水瓶倒立从底部充入氢气， 再抽空， 反。
5、复操作46次， 以排尽 生理盐水瓶中的空气和混合液中的溶解氧， 最后充满氢气， 放入恒温振荡器中连续培养， 设 置条件为： 150r/min、 30； 每天从生理盐水瓶中抽取10mL混合液经0.22 m滤膜过滤后测定 出混合液中As()的含量； (7)当As()被去除后， 重复步骤(6)并将混合液中As()的浓度增加到50 gAs()/ L， 每天监测As()的去除， 当As()被去除后， 重复补充As()、 碳源和氮源， 直至生理盐 水瓶中产生大量微生物絮体并且As()的去除率达到稳定， 即完成砷还原微生物的驯化培 养； 所述培养基溶液的成分为： 128mg/LKH2PO4、 434mg/L。
6、Na2HPO4、 80mg/LNaHCO3、 10mg/L NaNO3、 1mg/LCaCl22H2O、 1mg/LFeSO47H2O、 0.013mg/LZnSO47H2O、 0.004mg/L MnCl24H2O、 0.038mg/LH3BO3、 0.025mg/LCoCl26H2O、 0.001mg/LCuCl22H2O、 0.001mg/ LNiCl26H2O、 0.004mg/LNa2MoO42H2O和0.004mg/LNa2SeO3， 并以KH2PO4和Na2HPO4的混 合溶液为缓冲液调节其pH=7.2； 所述生理盐水瓶为药店销售的常规医用塑料注射瓶； 所有步骤中使用的注射器都是。
7、无 菌注射器； 所充氢气是纯度为99.999%的高纯氢气。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105861409 A 2 一种砷还原微生物的驯化培养方法 技术领域 0001 本发明属于环境微生物工程技术中的微生物培养驯化技术领域， 特别涉及一种砷 还原微生物的驯化培养方法， 具体是在厌氧条件下利用氢气作为电子供体驯化培养具有砷 还原能力的微生物的方法。 背景技术 0002 在我国的不少地区出现了严重的水体砷污染问题。 为了保障人们的健康， 世界卫 生组织、 欧盟、 日本、 美国等先后将饮用水中砷的标准定为10 g/L， 我国新的 生活饮用水卫 生标准 也将砷含量标准由50 g/L降低到10 g。
8、/L。 利用微生物法处理水体砷污染具有高效、 成本低廉和二次污染少等优势受到广泛的关注。 传统的微生物除砷技术主要是将As()预 氧化成As()再通过吸附作用去除， 能达到一定的处理效果， 但需要额外投加碳源， 运行费 用偏高还增加了有机物二次污染的风险， 如需达到更高的处理效果还需附加工艺。 针对上 述缺陷， 诞生了一种基于生物转化机理的新型氢自养微生物除砷技术， 能将As()还原成 As()后形成沉淀彻底的从水中去除， 其原理是氢自养微生物在厌氧条件下以氢气为电子 供体， 水中污染物As()为电子受体， 利用无机碳源进行新陈代谢过程， 将As()还原成As ()， As()与水中某些无机阴。
9、离子 （如： S2-） 形成沉淀从水中去除。 以氢气作为基质不需要 额外添加微生物生长所需的有机碳源， 具有清洁、 无残留、 成本低廉、 生物产量低、 无二次污 染等优点。 0003 然而， 在前期利用生物反应器培养驯化微生物过程中， 往往存在以下不足： (1)驯 化周期长， 驯化效果不稳定； (2)温度不宜控制； (3)氢气消耗量大， 运行成本高； (4)易受外 界因素影响。 发明内容 0004 本发明的目的在于克服现有技术的不足， 提供一种砷还原微生物的驯化培养方 法， 该方法能够快速稳定、 成本低廉的驯化培养微生物。 0005 本发明的思路： 首先进行厌氧菌纯化， 再进行砷还原菌驯化， 。
10、最后进行砷还原菌富 集， 即实现砷还原微生物的驯化培养。 0006 具体步骤为： (1)将配制好的培养基溶液放入高压蒸汽灭菌锅内121灭菌2030min， 然后取出再放 入超净工作台冷却至室温备用。 0007 (2)用注射器将生理盐水瓶中的生理盐水抽尽， 然后注入无菌水清洗再抽出， 重复 清洗46次， 最后放入超净工作台中紫外灭菌2030min。 0008 (3)从生活污水处理厂中取回厌氧污泥， 倒入烧杯中静置， 形成固液临界面。 0009 (4)用注射器向步骤(2)处理后的生理盐水瓶中注入步骤(1)处理后的培养基溶 液， 并从步骤(3)静置烧杯中的固液临界面处吸取接种污泥也注入步骤(2)处理。
11、后的生理盐 水瓶， 接种量为10%， 然后用注射器抽尽生理盐水瓶中上空空气， 将生理盐水瓶倒立从底部 说明书 1/3 页 3 CN 105861409 A 3 充入氢气， 再抽空， 反复操作46次， 以排尽生理盐水瓶中的空气和混合液中的溶解氧， 最后 充满氢气， 放入恒温振荡器中连续培养， 设置条件为： 150r/min、 30； 每天向生理盐水瓶中 补足消耗掉的氢气， 连续培养24天， 制得混合液。 0010 (5)按照步骤(2)处理生理盐水瓶， 备用。 0011 (6)从步骤(4)的生理盐水瓶中抽取10%制得的混合液注入步骤(5)处理后的生理 盐水瓶中， 并向生理盐水瓶中加入浓度为20 g。
12、As(V)/L的Na2HASO47H2O， 然后用注射器抽 尽生理盐水瓶中上空空气， 将生理盐水瓶倒立从底部充入氢气， 再抽空， 反复操作46次， 以 排尽生理盐水瓶中的空气和混合液中的溶解氧， 最后充满氢气， 放入恒温振荡器中连续培 养， 设置条件为： 150r/min、 30； 每天从生理盐水瓶中抽取10mL混合液经0.22 m滤膜过滤 后测定出混合液中As()的含量。 0012 (7)当As()被去除后， 重复步骤(6)并将混合液中As()的浓度增加到50 gAs ()/L， 每天监测As()的去除， 当As()被去除后， 重复补充As()、 碳源和氮源， 直至生 理盐水瓶中产生大量微生。
13、物絮体并且As()的去除率达到稳定， 即完成砷还原微生物的驯 化培养。 0013 所述培养基溶液的成分为： 128mg/LKH2PO4、 434mg/LNa2HPO4、 80mg/LNaHCO3、 10mg/LNaNO3、 1mg/LCaCl22H2O、 1mg/LFeSO47H2O、 0.013mg/LZnSO47H2O、 0.004mg/ LMnCl24H2O、 0.038mg/LH3BO3、 0.025mg/LCoCl26H2O、 0.001mg/LCuCl22H2O、 0.001mg/LNiCl26H2O、 0.004mg/LNa2MoO42H2O和0.004mg/LNa2SeO3， 。
14、并以KH2PO4和 Na2HPO4的混合溶液为缓冲液调节其pH=7.2。 0014 所述生理盐水瓶为药店销售的常规医用塑料注射瓶； 所有步骤中使用的注射器都 是无菌注射器； 所充氢气是纯度为99.999%的高纯氢气。 0015 本发明具有如下优点和有益效果： (1)无需借助厌氧设备。 0016 (2)操作方便快捷， 温度容易控制。 0017 (3)能够保证全程无菌。 0018 (4)驯化周期短， 驯化效果稳定。 0019 (5)氢气利用率高。 0020 (6)成本低廉。 具体实施方式 0021 实施例： 本实施例利用厌氧活性污泥驯化培养砷酸盐还原菌。 0022 (1)配制2000mL基本培养基。
15、， 成分如下 （mg/L） ： KH2PO4128、 Na2HPO4434、 NaHCO3 80、 NaNO310、 CaCl22H2O1、 FeSO47H2O1、 ZnSO47H2O0.013、 MnCl24H2O0.004、 H3BO3 0.038、 CoCl26H2O0.025、 CuCl22H2O0.001、 NiCl26H2O0.001、 Na2MoO42H2O0.004 和Na2SeO30.004， 以缓冲液 （KH2PO4+Na2HPO4） 调节pH=7.2。 配好培养基溶液后， 放入高压蒸 汽灭菌锅内121灭菌30min， 将培养基从高压灭菌锅中取出， 放入超净工作台冷却至室温。
16、 备用。 0023 (2)用注射器将500mL塑料生理盐水注射瓶中的生理盐水液抽尽， 然后注入无菌水 说明书 2/3 页 4 CN 105861409 A 4 清洗再抽出， 重复清洗5次， 放在超净工作台中紫外灭菌30min。 0024 (3)从桂林市七里店污水处理厂中取回厌氧污泥， 倒入烧杯中静置， 形成固液临界 面。 0025 (4)用注射器向步骤(2)处理后的生理盐水瓶中注入步骤(1)处理后的培养基 270mL， 并从步骤(3)静置烧杯中的固液临界面处吸取接种污泥30mL也注入步骤(2)处理后 的生理盐水瓶， 接种量为10%。 然后用注射器抽尽生理盐水瓶中上空空气， 将生理盐水瓶倒 立从。
17、底部充入氢气， 再抽空， 反复操作5次， 以排尽生理盐水瓶中的空气和混合液中的溶解 氧， 最后充满氢气， 放入恒温振荡器中连续培养， 设置条件为： 150r/min、 30； 每天向生理 盐水瓶中补足消耗掉的氢气， 连续培养3天， 制得混合液。 0026 (5)按照步骤(2)处理生理盐水瓶， 备用。 0027 (6)从步骤(4)的生理盐水瓶中抽取10%制得的混合液注入步骤(5)处理后的生理 盐水瓶中， 并向生理盐水瓶中加入浓度为20 gAs(V)/L的Na2HASO47H2O， 然后用注射器抽 尽生理盐水瓶中上空空气， 将生理盐水瓶倒立从底部充入氢气， 再抽空， 反复操作5次， 以排 尽生理盐。
18、水瓶中的空气和混合液中的溶解氧， 最后充满氢气， 放入恒温振荡器中连续培养， 设置条件为： 150r/min、 30； 每天从生理盐水瓶中抽取10mL混合液经0.22 m滤膜过滤后测 定出混合液中As()的含量。 0028 (7)4天后As()基本被去除， 重复步骤(6)并将混合液中As()的浓度增加到50 gAs()/L， 每天监测As()的去除， 当As()基本被去除后， 重复补充As()、 碳源和氮 源， 连续培养9天后瓶中产生大量微生物絮体， 并且As()的去除率达到稳定， 即此后每次 向瓶中新补充200 gAs()/L后24小时的去除率达到852%， 即完成砷还原微生物的驯化 培养。 说明书 3/3 页 5 CN 105861409 A 5 。