技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株高产乳酸的乳酸菌及其发酵蛋壳制 备乳酸钙的方法。
背景技术
肠球菌（Enterococcus）是自然界及人和动物体内广泛分布的革兰氏阳性球 菌，蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii）是一种多被报道为产细菌素的肠球菌， 能杀灭或抑制一些病原菌的生长，其中Enterococcus mundtii ST4SA已被列为国 内保藏的益生菌菌种，蒙氏肠球菌产抗菌素和抗病毒肽的报道非常常见，有报 道用蒙氏肠球菌Enterococcus mundtii ST4SA和植物乳杆菌Lactobacillus plantarum423以婴儿奶粉配方为基质作为益生菌。肠球菌具有产乳酸的能力， 但目前尚无利用肠球菌发酵制备乳酸的报道。
近年来，蛋壳的综合利用研究在不断深入。将蛋壳的钙转化成易吸收的有 机钙是蛋壳综合利用的一个重要方面。其中乳酸钙因其具有钙含量高、溶解度 较大、吸收率高、安全性高、价格合理等优点而备受关注。在目前的研究中， 蛋壳制备乳酸钙主要采用化学方法，研究较多的为煅烧法，煅烧法耗能大，成 本高，煅烧产生大量的二氧化碳和粉尘，对环境造成了污染。水热法和直接中 和法避免了高温煅烧蛋壳所造成的环境污染，但这两种方法需大量购买乳酸， 成本较高。微生物法制备乳酸钙是一个可以减少污染且增加经济效益降低成本 的有效途径，目前还没有用微生物发酵的方法将蛋壳直接制备成乳酸钙的文献 报道。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一株高产乳酸菌。
本发明所提供的高产乳酸菌为蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii），命名为 HNMD-25，于2014年1月9日送交位于中国科学院微生物研究所内的中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO.8699。
本发明所提供的高产乳酸菌分离自长期深埋的废弃蛋壳土样中。
本发明所提供的高产乳酸菌获得方法为：
（1）采样。样品采自蛋品加工场地长期深埋蛋壳的土壤中。
（2）分离初筛。采用MRS培养基为底物，并进行厌氧培养，在MRS培养 基上反复划线分离纯化，观察菌落形态，选取针尖大小的乳白色透明、湿润且 具有光泽的菌落，进一步用显微镜镜检观察菌体形态，筛选出革兰氏阳性小球 菌X株继续进行划线分离，分别获得纯培养。
（3）复筛。在MC培养基上点样，挑选产乳酸并形成溶钙圈的菌株。
（4）诱变及高产乳酸菌株的获得。通过紫外（UV）和亚硝基胍（NTG） 诱变并以MC培养基中的溶钙圈为标准，得到乳酸高产菌株：将培养18-24h后 的菌液离心收集菌体并用无菌水洗涤几次后加无菌水制成菌悬液，以0.3mg/mL 加入NTG，于摇床上振荡处理40min，多次离心洗涤菌体，并制成菌悬液，取 0.1mL菌液涂布于MRS固体平板并厌氧培养18-24h后，将平板置于20W紫外 灯下诱变，照射距离为30cm，1.5min，继续厌氧培养18-24h后取菌体在MC平 板上点样，选取溶钙圈大于对照的菌落，进行传代，获得稳定的纯培养菌株， 将其命名为Enterococcus mundtii HNMD-25。
（5）鉴定。生理生化性质鉴定。糖发酵试验显示，菌株可以利用蔗糖、木 糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、棉籽糖、水杨苷、七叶苷、山梨醇发酵产酸，不 能利用纤维二糖，能部分利用松三糖和蜜二糖；石蕊牛奶试验、乙酰甲基甲醇 V-P试验、甲基红（M.R.）试验、柠檬酸盐试验显示为阳性，过氧化氢酶试验， 淀粉水解试验，酪素水解试验，明胶液化试验，厌氧硝酸盐产气试验，硫化氢 产生试验，吲哚试验等各生化性质均显示阴性；耐温度、酸碱、盐性试验显示 在43℃下仍能生长，在低盐和偏酸性环境下均能生长，但在10%的较高盐浓度 和pH4.3的较酸性环境不再生长。
菌株16S rDNA序列鉴定。采用CTAB法提取菌体总DNA并进行16S PCR 扩增，进行琼脂糖凝胶电泳纯化后切胶测序，将序列与GenBank中核酸数据 （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）进行blast比对，与一株蒙氏肠球菌ATCC 43186的同源性达到99%，结合生理生化性质结果与伯杰细菌鉴定手册、常见细 菌系统鉴定手册与乳酸细菌分离鉴定及实验方法等判断，最终确认分离获得的菌 株为蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii）。
（6）产乳酸能力。采用摇床液体培养发酵，发酵液中的乳酸含量可达 60.375-72.064g/L，葡萄糖转化率（被发酵的葡萄糖占葡萄糖总量的比例）为 66.4-79.3%。
本发明的另一个目的，是提供所述的高产乳酸菌在发酵钙源制备乳酸钙中 的应用，尤其是在发酵蛋壳制备乳酸钙中的应用。
本发明进一步提供了一种利用蛋壳制备乳酸钙的方法，该方法是向含有葡 萄糖和蛋壳粉的培养基中接种权利要求1所述的乳酸菌，进行发酵，然后精制 分离乳酸钙。
优选的，所述培养基中蛋壳粉和葡萄糖的重量比为0.2-1.5∶1。
最佳的，所述培养基中蛋壳粉和葡萄糖的重量比为0.6∶1。
进一步优选的，所述培养基由下述重量配比的成分组成：
蛋白胨0.5%，胰蛋白胨0.5%，酵母提取物1%，葡萄糖10%，蛋壳粉6%， CaCl20.008%，MgSO40.192%，K2HPO40.04%，KH2PO40.04%，NaHCO30.4%， NaCl0.08%，蒸馏水为余量。
优选的，每100g培养基中接种105-108cfu的乳酸菌。
优选的，在温度为32-37℃，摇床速度为150-200r/min的条件下发酵，发酵 时间为60-84h。
本发明的有益效果是：
1）本发明中分离获得的乳酸菌，其自然发酵产乳酸性能优于目前许多常见 菌株；且菌株易培养，繁殖速度快，耐性强。
2）本发明提供的乳酸钙制备方法，蛋壳利用率高，达到77.98%，每1kg 蛋壳可制备约2.5kg的五水乳酸钙；葡萄糖转化率高，最高可达79.3%，优于工 业常用菌种的葡萄糖转化率；乳酸钙纯度高，发酵产物经精制，乳酸钙纯度可 达到99%以上。
3）与中和法相比，本发明不需要购买乳酸，能节省成本，同时也克服了煅 烧法制备蛋壳源乳酸钙的环境污染和破坏蛋壳生物活性的问题。
附图说明
图1为初筛得到的M-25菌株在100倍油镜下镜检图片。
图2为复筛后M-25菌株在MC培养基中点样形成的溶钙圈。
图3是实施例2中不同紫外照射时间对溶钙圈大小的影响曲线图。
图4是实施例2中不同亚硝基胍处理时间对溶钙圈大小的影响曲线图。
图5为诱变后得到的HNMD-25菌株16S rDNA琼脂糖凝胶电泳图。
图6是HNMD-25菌株的16S rDNA序列。
图7是发酵时间对乳酸钙产量和残留葡萄糖的影响曲线图。
图8是发酵时间对葡萄糖转化率和蛋壳粉转化率的影响。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1菌株的分离
分离培养基为MRS培养基，培养基购自青岛海博生物科技有限公司，成分 含有：蛋白胨10.0g，牛肉粉8.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，乙酸钠5.0g，磷酸 氢二钾2.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，吐温801.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.04g，琼脂 14g，蒸馏水1000mL，pH值6.5±0.2（25℃）。使用时称取本品66.2g，加热溶解于 1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，备用。
乳酸菌复筛验证培养基MC培养基，购自青岛海博生物科技公司，成分含有： 大豆蛋白胨5.0g，牛肉浸粉3.0g，酵母浸粉3.0g，葡萄糖20.0g，乳糖20.0g，碳酸 钙10.0g，琼脂15.0g，中性红0.05g，蒸馏水1000mL，pH6.0（25℃）。使用时称 取本品80.0g，加热煮沸溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，备用。
1.1菌株初步分离纯化
分别取深埋蛋壳土壤样品每份样品约25g，加入225mL的生理盐水稀释，稀 释后的样品分别在MRS培养基上分别作涂布平板和划线两种方式处理，在37℃ 下厌氧培养48h，观察菌落形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度、菌落 及培养基的颜色等。
将上一步培养的菌挑取长势不同的典型单菌落进一步在MRS培养基上反复 划线分离培养，直到菌落形态一致，进一步观察菌落形态。
将分离培养基中长势不同的菌落取单菌落涂片并在载玻片上晾干固定后， 采用革兰氏染色法染色，并于显微镜下油镜镜检观察，验证菌体形态与革兰氏 性质。图1为分离得到的野生型菌株M-25的镜检结果。
1.2菌株复筛
将划线分离出的菌种用接种针在MC琼脂平板上点样，每皿点样5个点，于 37℃下厌氧培养48h，观察菌体颜色，观察是否溶钙并形成透明环，验证菌种是 否有溶钙特性。图2为经复筛后的野生型菌株M-25在MC培养基中点样形成的溶 钙圈。
实施例2菌株的诱变及鉴定
2.1分别研究紫外诱变和亚硝基胍诱变对乳酸产酸能力的影响：
2.1.1紫外（UV）诱变
取菌体斜面，加入无菌水10mL制成悬液，分别取0.1mL涂布于8个平板 上，在37℃下厌氧培养24h后置于20W紫外灯下诱变，照射距离为30cm，分 别照射0.5min、1.0min、1.5min、2.0min、2.5min、3min、3.5min，以未经紫外 照射的平皿为对照（CK），再以37℃厌氧培养24h。将培养物于MC固体平板 中点样，于37℃下厌氧培养42h，用游标卡尺测量溶钙圈的直径，测3个溶钙 圈，取平均值，比较不同诱变时间的溶钙圈大小。
结果：不同照射时间溶钙圈大小结果如图3，照射1.5min时溶钙圈最大。
2.1.2亚硝基胍（NTG）诱变
取在37℃下，180r/min培养36h的菌液30mL，6000r/min离心15min，收集 菌体，用8%的无菌生理盐水洗涤3次，再向菌体中加入适量的无菌水，振荡， 配制成浓度为108cfu/ml的菌体悬浮液。将NTG加入菌悬液的三角瓶中，使其浓 度为0.3mg/ml，以未添加NTG的菌体悬浮液为对照（CK）。将三角瓶置于37℃ 下180r/min的摇床上振荡处理不同时间（20min、30min、40min、50min、60min、 70min）后，用无菌生理盐水多次离心洗涤菌体，取菌体沉淀，加入无菌生理盐 水摇匀，适当稀释，取0.1ml菌液涂布于MRS固体培养基平板上37℃厌氧培养 48h后，用接种针在初筛MC固体平板上点样，置于37℃下厌氧培养42h，比较 不同作用时间的溶钙圈大小。
结果：亚硝基胍不同处理时间溶钙圈大小结果如图4，处理40min时，溶钙 圈直径最大。
2.1.3NTG和UV复合诱变
将经NTG诱变处理不同时间（20min、30min、40min、50min、60min）多 次离心洗涤后的菌悬液，取0.1ml菌液涂布于MRS固体培养基平板上37℃厌氧 培养24h后，置于紫外灯下不同时间（0.5min、1.0min、1.5min、2.0min、2.5min） 照射，再将两两组合诱变的菌体在初筛MC固体培养基上点样，置于37℃下厌 氧培养42h，比较溶钙圈大小。同时将菌株分别接入已装100mL PYG培养基的 250mL三角瓶中进行摇床培养，37℃，180r/min培养48h，测定菌株产乳酸含量。
结果：复合诱变采用亚硝基胍处理40min同时紫外照射1.5min时溶钙圈直 径最大，同时摇瓶乳酸含量最高，最终菌种采用复合诱变菌，将菌种编号为 HNMD-25。
2.2诱变菌株的生化性质鉴定
2.2.1糖发酵性质
实验将测定的糖或醇类等碳水化合物按质量体积比0.5%加入发酵培养基 中，分装于含10mL糖发酵培养基的试管中，糖发酵管成分为：牛肉膏5.0g，蛋 白胨5.0g，酵母浸膏5.0g，吐温800.5mL，琼脂1.5g，1.6%溴甲酚紫酒精溶液1.4mL， 蒸馏水1000mL，121℃高压灭菌15min。分别用接种针挑取被鉴定菌株穿刺接种 到灭菌后的碳水化合物培养基中37℃下160r/min振荡培养24h。本试验进行了以 下糖的发酵试验：蔗糖、木糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、纤维二糖、蜜二糖、 松三糖棉籽糖、水杨苷、七叶苷、山梨醇。结果：对纤维二糖不发酵呈阴性， 对松三糖和蜜二糖呈现部分发酵，对其余糖均发酵成阳性。
2.2.2其余生化性质及耐性试验
验证其他的生理生化性质及耐酸碱耐盐及耐温度试验。依据伯杰系统细菌 学手册，常见细菌系统鉴定手册和凌代文等(1999)的方法，主要进行以下的生 化性质鉴定：过氧化氢酶试验，淀粉水解试验，石蕊牛奶试验，酪素水解试验， 明胶液化试验，乙酰甲基甲醇V-P试验，甲基红（M.R.）试验，柠檬酸盐试验， 厌氧硝酸盐产气试验，硫化氢产生试验，吲哚试验。结果如下：
表1菌株生化性质结果
注：+表示生化反应阳性，-表示生化反应阴性。
2.2.3耐性试验
将分离的菌株分别验证耐酸碱耐温及耐盐性试验，操作如下：
配置MRS培养基，用平板划线法进行接种，然后分别在25℃、37℃、43℃、 57℃下厌氧培养，培养48h后观察菌种的生长情况。
配置含盐量分别为2%、5%、7%、10%的MRS培养基，用平板划线法进 行接种，然后在37℃下厌氧培养，培养48h后观察菌种的生长情况。
配置MRS培养基，用NaOH溶液和HCl溶液调PH至4.3、5.7、6.8、8.7，用平 板划线法进行接种，然后在37℃下厌氧培养，培养48h后观察菌种的生长情况。
结果如下：
表2菌株耐受性试验结果
注：+表示生化反应阳性，-表示生化反应阴性。
2.3诱变菌株的分子生物学鉴定
菌株的16S rDNA扩增和测序分析
2.3.1总DNA提取
抽提方法采用CTAB法，参考奥伯斯等（2005）的方法，具体操作如下：
（1）接一环菌于10mL PYG培养基中，37℃，厌氧培养24h。
（2）取1.5mL菌液于1.5mL Eppendorf离心管中，8000r/min离心5min，弃 去上清。
加入1.5ml TE缓冲液离心洗涤后，用567uL TE缓冲液溶解菌体，用移液器反 复吹打使之重悬。
（3）加入30uL10%的SDS和3uL20mg/mL的蛋白酶K，混匀，于37℃干式 恒温器中温育1h。
（4）加入100uL5mol/L无菌的NaCl溶液，充分混匀，再加入80uL CTAB/NaCl，混匀，于干式恒温器中65℃温育10min。
（5）加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)（0.8mL），混匀，12000r/min离心5min， 将上清液转入一个新管中。
（6）上清液新管中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)(0.8mL)， 混匀，12000r/min离心5min，将上清液转入一个新管中。
（7）加入0.48mL倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，12000r/min 离心15min，收集DNA沉淀，用75%乙醇(1mL)12000r/min离心5min洗涤DNA沉 淀，真空干燥0.5h。
（8）将沉淀重溶于100uL的TE缓冲液中，于-20℃保存备用。
2.3.2细菌16S rDNA的扩增和产物纯化
细菌16S rDNA PCR扩增的引物采用一对通用引物，由上海生工生物工程技术 服务有限公司合成。正向引物Eubac27F为5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’； 反向引物Eubac1492R为5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。将2*Taq PCR MasterMix与引物（正反向引物各1uL）、模板4uL混匀后加水补齐至20uL体系进 行PCR，PCR反应程序见表3。
表3PCR反应程序
将产物置于-20℃保存备用。
用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的DNA，用Gold View染色剂（5uL/100uL） 染色，每孔点样5uL，mark点样5uL，110V，电泳1小时。电泳后置于凝胶成像 系统中观察，结果如图5所示，（需介绍各泳道分别是什么样品，电泳结果如何）， 表明PCR成功。再切取清晰的条带，用琼脂糖凝胶回收试剂盒按照说明书的要求 回收产物，置于-20℃保存。
2.3.316S rDNA测序与序列比对
将保存的PCR后电泳纯化的产物送样测序，测序由上海生工生物工程技术 服务有限公司完成。利用ContigExpress的拼接程序将测得的正反向序列进行拼 接并修改错配碱基，然后利用BLAST程序，将拼接后的菌株的16S rDNA序列 与GenBank数据库中已知菌种的序列进行比对分析（http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/blast），寻找与目的基因序列同源性最高的已知菌种。结 果：发现分离菌株与蒙氏肠球菌的16S rDNA的相似性水平最高，达到99%以上， 结合菌株的形态学和生理学特征，确定分离的菌株为蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii）。菌株的16S rDNA序列见图6。
实施例3菌株产乳酸能力和发酵时间的研究
1.菌株的产酸能力
发酵培养基成分按如下配置：蛋白胨0.5g，胰蛋白胨0.5g，酵母提取物1.0g， 葡萄糖10g，CaCl20.008%，MgSO40.192%，K2HPO40.04%，KH2PO40.04%， NaHCO30.4%，NaCl0.08%，蒸馏水100mL。115℃灭菌20min。中和剂碳酸钙6g， 分开灭菌。以2%的接种量接入本发明所分离的乳酸菌对数期种子液，同时以目 前工业发酵生产乳酸最常用的菌种——保加利亚乳杆菌为对照。于35℃180r/min 摇床培养72h。置于85℃下30min，杀死菌体，过滤。取过滤后的发酵液1.0mL， 加入蒸馏水50mL，再加入lmol/L的NaOH溶液4.0mL与钙黄绿素指示剂20mg，滴 定采用0.05mol/L的EDTA·Na2溶液，滴定至背光观察黄绿色荧光转变为橙色时 停止，记录消耗的EDTA·Na2的体积(mL)，按下式计算乳酸含量：
W(g/L)=K×9.008×V
式中：W=乳酸含量(g/L)
V=滴定时消耗的EDTA·Na2的体积(mL)
K=[V+W-(Wl-W2)]/V
其中Wl表示：发酵初的重量；W2表示：发酵结束后的重量；W为：接种量； V为：最初装液量。
结果：本发明的菌株发酵葡萄糖的乳酸产量为60.375-72.064g/L，葡萄糖转 化率为66.4-79.3%，而保加利亚乳杆菌的乳酸产量为54.247-63.056g/L，葡萄糖的 转化率为57.5-69.4%。
2.菌株的发酵时间
分别设计不同发酵时间（36h，48h，60h，72h，84h），发酵完成后高温杀 死菌体，过滤，测定发酵液中的乳酸钙含量。
结果：乳酸钙产量及残糖含量和葡萄糖及蛋壳粉转化率如下图7、图8所示。 发酵至60h时已基本发酵完全已达76.741g/L，葡萄糖此时转化率为69.69%，发 酵至84h增加至82.196g/L，葡萄糖转化率达74.65%。因此发酵时间选择60-84h 为宜。
实施例4
一种利用保藏编号为CGMCC NO.8699的高产乳酸菌菌株发酵蛋壳制备乳 酸钙的方法，包括以下步骤：
1）蛋壳处理：将新鲜鸡蛋壳洗涤后干燥，用粉碎机粉碎，过200目筛。
2）发酵：向培养基中接种乳酸菌菌液，在温度为34℃，摇床速度为180r/min 的条件下发酵72h。
所述培养基由下述重量配比的成分组成：
蛋白胨0.5%，胰蛋白胨0.5%，酵母提取物1%，葡萄糖10%，蛋壳粉6%， CaCl20.008%，MgSO40.192%，K2HPO40.04%，KH2PO40.04%，NaHCO30.4%， NaCl0.08%，蒸馏水为余量。
接种后每100g培养基中含有107cfu的乳酸菌。
3）过滤及除杂：发酵完成后高温杀死菌体，过滤；滤液调整pH至10，于 94℃下反应15min，并以10g/L加入活性碳脱色，趁热抽滤，保留滤液。
4）结晶：将滤液置于80℃下浓缩至约2/5体积后，置于5℃下至结晶出白 色晶体，抽滤；将过滤后的白色晶体重溶于原发酵液体积的蒸馏水中，于80℃ 再次浓缩，浓缩后置于5℃下冷却重结晶，抽滤，重复以上重结晶过程2次，以 除去晶体中的培养液等杂质。
5）成品：将结晶后的白色晶体于70℃下烘干，即得到乳酸钙成品。纯度为 99.25%，蛋壳粉利用率为77.98%，每1kg蛋壳可制备约2.5kg五水乳酸钙。