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1、(10)申请公布号 CN 103898158 A (43)申请公布日 2014.07.02 CN 103898158 A (21)申请号 201410075547.8 (22)申请日 2014.03.04 C12N 15/85(2006.01) C12N 15/66(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) C12N 5/10(2006.01) (71)申请人 上海中医药大学附属曙光医院 地址 201203 上海市浦东新区张衡路 528 号 申请人 上海中医药大学附属市中医医院 (72)发明人 李琦 任建琳 季青 刘宣 隋华 周利红 刘宁宁 。
2、朱惠蓉 颜琳琳 冯媛媛 (74)专利代理机构 上海卓阳知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 31262 代理人 巫蓓丽 (54) 发明名称 一种含有 MALAT1 启动子序列和报告基因的 载体及其构建方法和用途 (57) 摘要 本发明涉及一种含有 MALAT1 启动子序列和 报告基因的载体及其构建方法和用途。 具体地， 将 MALAT1 的启动子序列 （1100bp） 插入 pGL3-Basic 载体， 构建获得含 MALAT1 启动子和报告基因 luc+ 的重组质粒 pGL3-Basic-MALAT1-promoter。该重 组质粒与海肾萤光素酶报告基因载体 pRL-SV40 共转染肿瘤细。
3、胞， 添加候选抗肿瘤药物作用细胞， 然后通过检测双荧光素酶活性可以反映各药物对 MALAT1 基因启动子转录活性的影响， 从而应用于 靶向MALAT1基因的抗肿瘤药物筛选。 该方法特别 适合大规模针对 MALAT1 基因的抗肿瘤药物的筛 选， 方法简单， 直观和快速， 靶向性强， 无放射性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图5页 (10)申请公布号 CN 103898158 A CN 103898158 A 1/1 页 2 1. 一种。
4、含有 MALAT1 启动子序列和报告基因的载体， 其特征在于， 所述的载体是在 pGL3-Basic 载体的多克隆位点内插入 SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列。 2.根据权利要求1所述的载体， 其特征在于， 所述的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列插 入在 pGL3-Basic 载体的 NheI 和 Bgl 酶切位点之间。 3.权利要求1所述的含有MALAT1启动子序列和报告基因的载体的构建方法， 其特征在 于， 包括以下步骤 ： a） 获得 SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列 ； b） 将 SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列连接到 pGL3-Basic 载体的 Nhe。
5、I 和 Bgl 酶切位 点之间。 4. 权利要求 1 所述的含有 MALAT1 启动子序列和报告基因的载体的用途， 其特征在于， 用于筛选针对 MALAT1 基因的抗肿瘤药物， 或比较针对 MALAT1 基因的抗肿瘤药物的活性大 小。 5. 一种细胞株， 其特征在于， 它含有权利要求 1 或 2 所述的载体以及 pRL-SV40 内参质 粒。 6. 根据权利要求 5 所述的细胞株， 其特征在于， 所述的细胞株是人肿瘤细胞株。 7. 一种筛选针对 MALAT1 基因的抗肿瘤药物或比较针对 MALAT1 基因的抗肿瘤药物的 活性大小的方法， 其特征在于， 所述的方法是将待选化合物作用权利要求5或6。
6、所述的细胞 株， 然后检测双荧光素酶活性。 权 利 要 求 书 CN 103898158 A 2 1/4 页 3 一种含有 MALAT1 启动子序列和报告基因的载体及其构建 方法和用途 0001 【技术领域】 本发明涉及分子生物学技术领域， 具体地说， 是一种含有 MALAT1 启动子序列和报告基 因的载体及其构建方法和用途。 0002 【背景技术】 肿瘤的发生是一个涉及多种癌基因如原癌基因及抑癌基因的多阶段过程， 是多基因协 同作用的结果。当癌基因与抑癌基因之间的平衡被打破， 控制细胞增殖的癌基因持续或过 高表达， 同时抑癌基因不表达或失活时， 便会使癌变细胞逃避机体免疫机制的控制， 形成肿。
7、 瘤， 进而导致细胞的恶化及转移。 0003 长链非编码 RNA（long noncoding RNA， lncRNA） 是一类转录本长度超过 200nt 的 RNA， 它们本身并不编码蛋白， 而是以 RNA 的形式在多种层面上调控基因的表达水平。随着 近年来 lncRNA 不断的被发现， 人们越来越多的关注 lncRNA 在各种生物学过程以及疾病中 的功能。 0004 LncRNA-MALAT1 （Metastasis Associated in Lung Adenocarcinoma Transcript 1） 于 2003 年被首次发现， 其在非小细胞癌患者组织中显著高表达， 随后该基因。
8、在其它很多 肿瘤如肝癌、 胰腺癌、 前列腺癌、 肠癌、 乳癌等癌组织中也发现过表达。 0005 目前国内外刚刚开始致力于长链非编码 RNA 的研究， 其在肿瘤领域的研究相比于 microRNA 还处于初步阶段。MALAT1 基因跟多种肿瘤的侵袭转移密切相关， 而针对该基因进 行的抗肿瘤药物的筛选也没有建立标准而有效的方法， 极大的限制了针对 MALAT1 基因进 行药物治疗的研究。 0006 【发明内容】 本发明的目的是针对现有技术中的不足， 提供一种含有 MALAT1 启动子序列和报告基 因的载体。 0007 本发明的再一的目的是， 提供上述载体的构建方法。 0008 本发明的另一的目的是，。
9、 提供上述载体的用途。 0009 本发明的第四个目的是， 提供一种细胞株。 0010 本发明的第五个目的是， 提供一种筛选针对 MALAT1 基因的抗肿瘤药物或比较针 对 MALAT1 基因的抗肿瘤药物的活性大小的方法。 0011 为实现上述第一个目的， 本发明采取的技术方案是 ： 一种含有 MALAT1 启动子序列和报告基因的载体， 所述的载体是在 pGL3-Basic 载体的 多克隆位点内插入 SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列。 0012 优选地， 所述的 SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列插入在 pGL3-Basic 载体的 NheI 和 Bgl 酶切位点之间。 0013 。
10、为实现上述第二个目的， 本发明采取的技术方案是 ： 如上所述的含有 MALAT1 启动子序列和报告基因的载体的构建方法， 包括以下步骤 ： a） 获得 SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列 ； 说 明 书 CN 103898158 A 3 2/4 页 4 b） 将 SEQ ID NO.1 所示的核苷酸序列连接到 pGL3-Basic 载体的 NheI 和 Bgl 酶切位 点之间。 0014 为实现上述第三个目的， 本发明采取的技术方案是 ： 如上所述的含有 MALAT1 启动子序列和报告基因的载体的用途， 用于筛选针对 MALAT1 基因的抗肿瘤药物， 或比较针对 MALAT1 基因的抗肿。
11、瘤药物的活性大小。 0015 为实现上述第四个目的， 本发明采取的技术方案是 ： 一种细胞株， 它含有如上任一所述的载体以及 pRL-SV40 内参质粒。 0016 作为本发明的一种实施方式， 所述的细胞株是人肿瘤细胞株。 0017 为实现上述第五个目的， 本发明采取的技术方案是 ： 一种筛选针对MALAT1基因的抗肿瘤药物或比较针对MALAT1基因的抗肿瘤药物的活性 大小的方法， 所述的方法是将待选化合物作用如上任一所述的细胞株， 然后检测双荧光素 酶活性。 0018 本发明优点在于 ： 本发明首先提取人结肠癌细胞的全基因组， 然后 RT-PCR 获得合适长度的 MALAT1 的 启动子序列。
12、 （片段的长短对最终载体功能的实现有很大影响， 太长的片段不太容易 PCR 扩 增， 且很可能会影响载体中荧光素酶的活性 ； 片段太短则可能失去 MALAT1 启动子的活性） ， 经过测序验证正确后， 将其插入 pGL3-Basic 载体， 构建获得含 MALAT1 启动子和报告基因 luc+的重组质粒pGL3-Basic-MALAT1-promoter。 该重组质粒与海肾萤光素酶报告基因载体 pRL-SV40 共转染肿瘤细胞， 添加候选抗肿瘤药物作用细胞， 然后通过检测双荧光素酶活性 可以反映各药物对 MALAT1 基因启动子转录活性的影响， 从而应用于靶向 MALAT1 基因的抗 肿瘤药物。
13、筛选。该方法特别适合大规模针对 MALAT1 基因的抗肿瘤药物的筛选， 方法简单， 直观和快速， 靶向性强， 无放射性。 0019 【附图说明】 图 1 是 MALAT1 基因启动子的 PCR 扩增产物。其中 1 为 Marker （DL2000） ， 2 为 MALAT1 启动子 PCR 扩增产物， 大小为 1100bp。 0020 图 2 是 PCR 产物的测序比对结果。 0021 图3是pGL3-Basic-MALAT1-promoter重组质粒的PCR鉴定图谱。 其中1为Marker， 2、 3、 4 为任意挑取的 3 个克隆， 经 PCR 鉴定均正确 （1100bp） 。 0022 。
14、图4是pGL3-Basic-MALAT1-promoter重组质粒的NheI和Bgl双酶切鉴定结果。 其中 1 为 Marker, 2 和 3 为图 3 中经 PCR 鉴定正确的克隆 2 和 3 抽质粒的双酶切鉴定结果 （4818bp+1100bp） 。 0023 图 5 是 pGL3-Basic-MALAT1-promoter 重组质粒的构建流程图。 0024 图 6 是 pGL3-Basic-MALAT1-promoter 重 组 质 粒 和 pRL-SV40 内 参 质 粒 共 转 染 LoVo 细胞后的荧光活性检测结果。其中 Blank 组 ： pRL-SV40 内参质粒 ； Basi。
15、c 组 ： pGL3-Basic+ pRL-SV40 ； MALAT1 组 ： pGL3-Basic-MALAT1-promoter+ pRL-SV40 ； SV40 组 ： pGL3-Basic-SV40-promoter+ pRL-SV40。 0025 图7是22种候选抗肿瘤药物对pGL3-Basic-MALAT1-promoter重组质粒中MALAT1 启动子转录活性的影响， 以候选药物对 MALAT1 启动子活性的抑制率作为纵坐标作图。 0026 【具体实施方式】 说 明 书 CN 103898158 A 4 3/4 页 5 下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。 0027。
16、 本发明的技术路线为 ： 重组载体构建的技术路线如下 ：（1）从结肠癌 LoVo 细胞中提取基因组 DNA ；（2）采 用 RT-PCR 的方法以基因组为模板扩增出 MALAT1 基因的启动子片段 ；（3） 将测序正确的 RT-PCR 扩增产物和 pGL3-Basic 载体分别经过限制性内切酶 NheI 和 Bgl 消化 ；（4） 经过 限制性内切酶 NheI 和 Bgl 消化的 RT-PCR 扩增产物和 pGL3-Basic 载体进行连接， 转化， 筛选， PCR 鉴定和双酶切鉴定获得重组载体。 0028 以 MALAT1 基因启动子为靶点的抗肿瘤药物的筛选 ：（1） 将含萤火虫萤光素酶的 。
17、pGL3-Basic-MALAT1-promoter 重组质粒和含海肾萤光素酶的 pRL-SV40 内参质粒共转染人 肿瘤细胞株， 获得表达 MALAT1 启动子的转染细胞株 ；（2） 建立合适的双荧光素检测系统 ； （3） 将待选化合物作用上述细胞株， 进行以 MALAT1 启动子为靶点的抗肿瘤药物筛选。其原 理是 ： 将待筛选化合物作用转染细胞， 24-48h 后检测 Luc 的活性， 如果待筛选化合物能够 使细胞内的 Luc 活性降低， 就说明此化合物可以直接抑制 MALAT1 基因启动子的转录活性， 从而抑制 MALAT1 基因的表达， 降低肿瘤细胞的侵袭转移性能， 因此是一种潜在的抗。
18、肿瘤药 物。 0029 本发明所涉及的肿瘤细胞如 LoVo， 含萤火虫萤光素酶报告基因的 pGL3-Basic 质 粒载体， 以及实验中所用试剂及药物均可市购。 0030 实施例 1 构建含人 MALAT1 启动子序列和 Luc 报告基因序列的重组质粒 （1） 从结肠癌 LoVo 细胞中提取基因组 DNA， 采用 RT-PCR 的方法以基因组为模板扩增出 MALAT1基因的启动子片段 （1100bP， SEQ ID NO.1） ， 无非特异性扩增， 条带清晰， 大小与目的 片段相符 （图 1） 。PCR 产物直接测序， 测序结果提示该片段为 MALAT1 基因启动子区域片段， 未发现碱基突变，。
19、 测序比对结果见图 2。 0031 （2）将测序正确的 RT-PCR 扩增产物和 pGL3-Basic 载体 （购于美国 Promega 公 司， 其特征是含萤火虫萤光素酶报告基因 luc+、 多克隆位点、 氨苄青霉素抗性基因 - 内 酰胺酶， 载体大小为 4818 bp）分别经过限制性内切酶 NheI 和 Bgl 消化， 连接转化 到感受态大肠杆菌 DH5 中， 经过氨苄青霉素筛选， PCR 鉴定和双酶切获得重组载体 pGL3-Basic-MALAT1-promoter（图 3， 图 4） 。图 5 是重组质粒构建的流程图。结果提示， MALAT1 启动子荧光素酶报告载体构建成功。 0032。
20、 实施例 2 利用重组质粒 pGL3-Basic-MALAT1-promoter 进行以 MALAT1 基因启动 子为靶点的抗肿瘤药物的筛选 （1） 转染人肿瘤细胞株， 获得稳定表达 MALAT1 启动子和 Luc 报告基因的转染细胞株 按 照 5105 个 细 胞 / 孔 的 量 在 6 孔 板 中 接 种 指 数 生 长 期 的 LoVo 细 胞， 在 37 、 5 CO2 培 养 箱 中 过 夜 培 养， 直 到 细 胞 80 汇 合 后， 在 超 净 台 内 进 行 pGL3-Basic-MALAT1-promoter质粒的细胞转染。 具体是 ： 在 EP 管中配置 DNA/脂质体复 。
21、合物， 如下 ： 稀释质粒 DNA 至 1 mL F12K 无血清无抗生素培养液中， 在涡旋混合器上振荡 1 min， 然后加入脂质体悬液， 再次旋起混匀， 在室温温育 20 min， 使 DNA 与脂质体充分结 合 ； 去除细胞培养板中的培养液， 用 PBS 洗一次， 在每个孔中加入 DNA/脂质体混合物 1 mL， 于 37 5 CO2 培养箱中培养 5 h， 然后向孔中加入 F12K 完全培养液， 在 37 5 CO2 培养箱中培养 48 h。 说 明 书 CN 103898158 A 5 4/4 页 6 0033 （2） 建立合适的双荧光素检测系统 利用 Luciferase 试剂盒 。
22、（Promega） 及萤火虫荧光素酶测定仪 （Beahold） 测定每组萤 火虫荧光素酶活性， 各组设 3 个复孔。萤火虫荧光素酶活性检测用工作液 1 ： A 液 （2 mL） +B 液 （40 L） C 液 （10 L） ； 海肾荧光素酶活性检测用工作液 2 ： D 液 （2 mL） +E 液 （10 L） 进行。共转染报告质粒 pGL3-Basic-MALAT1-promoter（阴性对照组加空质粒 pGL3-Basic， 阳性对照组加质粒 pGL3-Basic-SV40-promoter( 购于美国 Promega 公司 )） 和内参质粒 pRL-SV40（购于美国 Promega 公司。
23、）的细胞 （前后比例 9 ： 1， 以 96 孔为例， 总 DNA 量 0.2 g） ， 经过一定时间的培养后收集。细胞的裂解 ： 取出培养基， 用 PBS 洗一次， 每孔加入裂解液 500 L， 室温摇动 15 min。取 20 L 细胞裂解液于 1.5 mL 的离心 管中。加入工作液 1， 设定延迟 2 sec， 发光仪测读 10 sec。加入工作液 2， 设定延迟 2 sec， 发光仪测读 10 sec， 进行检测。不同组质粒转染后的荧光检测结果见图 6， 表明构建 pGL3-Basic-MALAT1-promoter 质粒成功。 0034 （3） 将待选化合物作用上述细胞株， 进行以 。
24、MALAT1 启动子为靶点的抗肿瘤药物的 筛选 共转染报告质粒 pGL3-Basic-MALAT1-promoter 和内参质粒 pRL-SV40（比例 9 ： 1） 于 人结肠癌 LoVo 细胞， 然后将待选化合物作用上述细胞， 48h 后收集细胞， 用双荧光素酶活性 检测判断各候选抗肿瘤药物对 MALAT1 启动子活性的影响。我们将候选的 22 种抗肿瘤药物 单体分别加入上述转染细胞， 然后检测荧光素酶活性， 结果表明 A 样品 （白黎芦醇） 和 B 样品 （蛇床子素） 相对于其它候选抗肿瘤药物 （图 7） ， 对 MALAT1 启动子的转录活性有着非常明显 的抑制作用， 其可以成为潜在抗。
25、肿瘤药物进行深入的功能实验。 0035 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员， 在不脱离本发明方法的前提下， 还可以做出若干改进和补充， 这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。 说 明 书 CN 103898158 A 6 1/1 页 7 SEQUENCE LISTING 上海中医药大学附属曙光医院 上海中医药大学附属市中医医院 一种含有 MALAT1 启动子序列和报告基因的载体及其构建方法和用途 / 1 PatentIn version 3.3 1 1100 DNA human 1 aggcttaaaa ataaaaaaga aaagaaaaga。
26、 aaacaagaac agtttcacca gcgtcaattg 60 agaacagctg cttcaacagg ccctgcttta tgtgggcagg tggggacagg gagttggccc 120 agaaaacagg accctcattt cctggagccc ccagggcagc tccccaacac cgtacacaac 180 ctgcatcatt tacaggagcc aaaggagttt tagaaatcaa cttcatagag ttgctgtatc 240 attgtgttag ttttgccatc ctaacctata cagcgtcact aatctctcc。
27、c ctcggagttg 300 actgcctaaa aacaagccat ggatacaggt tccaaagacc cgggggtgag ggagcggaga 360 gggtgggtgt caccaccccg tccagctcca agctttgtgt gccctggaac tctccatttt 420 aggtcattgc ttcagtttct tttctaaaaa attaggctgc tgcaaggtca gcctgagacc 480 acttctgccc cgagaattct agactagtaa gacctggtga catacaaacg acgaagatat 540 ttt。
28、acaataa tgccatggcc cttgatagct acacgaggtt tgtgttctga ttttaaatta 600 atggatgacg tcgagactat atggaggaaa tgacaaagga caggagagag gtgggaaagg 660 aagacctaga ctgaaaatgg aagttgggca gcagctccac gaaagaaaga ccagccccca 720 agtgcagtga cagcgcagag tagcgaccga gaagttccca ggccagctgc caccccgccc 780 ccatgccatt ccccagaaca g。
29、gcacaggcg ttagggcggg gcgcgcgtgc gcagtcacgc 840 gctgcgccaa ccgccacagc tccgggaagg cggccaggac cggctagagc cggttagaac 900 cagtggcgcc cgcccacgag ccagcgcctc acaaagggag ggcggctcac ggccctcgcg 960 tatccctgcg cggcgctcgc gagccgcccc tcccccggcg tttgtccctg acgcagcccc 1020 accggttgcg cagtccctcc ccgcccccgc tctcccctcc gcagcctgca gcccgagact 1080 tctgtaaagg actggggccc 1100 序 列 表 CN 103898158 A 7 1/5 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 103898158 A 8 2/5 页 9 图 2 说 明 书 附 图 CN 103898158 A 9 3/5 页 10 图 3图 4 说 明 书 附 图 CN 103898158 A 10 4/5 页 11 图 5 说 明 书 附 图 CN 103898158 A 11 5/5 页 12 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 103898158 A 12 。