技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种大肠杆菌感受态细胞的制备 方法。
背景技术
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但人 工构建的质粒载体，缺乏此种转移所必须的mob基因，因此不能自行完成从一 个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受 体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外援DNA。
转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手 段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术,这是现 代分子生物学最基本的操作技术。受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞 膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。 转化效率直接影响前后实验的进展和工作效率，而感受态细胞的状态是影响转 化效率最直接、关键的因素之一。
通常实验室自己制备感受态细胞，常用的制备方法包括CaCl2法和Inoue法。 CaCl2法简便易行，但制备的感受态细胞转化效率较低，不能满足常规载体构建 的需要；Inoue法虽然感受态细胞的转化效率较高，但细菌的培养条件是18℃， 需要低温摇床，振荡19h～50h，摇菌的时间较长，并且过程相对繁琐。
发明内容
基于此，有必要提供一种转化效率高、操作简单实用的大肠杆菌感受态细 胞的制备方法
一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、将-80℃冷藏的大肠杆菌融化后画线接种于LB平板上，37℃培养 过夜后挑取单菌落于5mL的加入了MgCl2溶液的SOB培养基中，37℃振荡培养 12h～16h；
步骤二、取500μL步骤一中得到的培养液接种于50mL的加入了MgCl2溶 液的所述SOB培养基中，37℃培养约3h，使培养液的吸光值OD(A600)为0.4～0.6；
步骤三、将步骤二中得到的菌液转移至50mL无菌离心管，冰浴10min，接 着4℃下4000rpm离心10min；
步骤四、将步骤三得到的离心液去上清，将沉淀重悬于15mL预冷的TB转 化缓冲液中，在冰上放置10min，接着4℃下4000rpm离心10min；
步骤五、将步骤四得到离心液去上清，将沉淀重悬于4mL预冷的所述TB 转化缓冲液中，加入DMSO并轻摇混匀，使DMSO的体积浓度为7%；
步骤六、将步骤五得到的悬液在冰上放置10min后分装到预冷的无菌EP管 中，得到所述大肠杆菌感受态细胞。
在一个实施例中，所述SOB培养基的配制过程如下：
将2g胰蛋白胨、0.5g酵母膏、0.05g NaCl和0.0186g KCl溶解在双蒸水 中至100mL，调节pH为7.0后灭菌，得到所述SOB培养基。
在一个实施例中，每20mL的所述TB转化缓冲液由如下成分组成：
12.5mL的双蒸水、4mL的1mol/L的KCl、2.4mL的0.45mol/L的MnCl2、 0.5mol/L的CaCl20.6mL和0.5mL的0.5mol/L的K-MES缓冲液。
在一个实施例中，所述0.5mol/L的K-MES缓冲液的配制过程如下：
称取9.76g MES完全溶解于80mL的双蒸水中，用1mol/L的KOH调节pH 为6.3，补加双蒸水到100mL，过滤灭菌后保存于-20℃，得到所述0.5mol/L的 K-MES缓冲液。
在一个实施例中，步骤一中和步骤二中，每毫升的SOB培养基中加入2mol/L 的MgCl2溶液10μL。
在一个实施例中，所述冷藏的大肠杆菌保存于LB和DMSO的混合液中， DMSO的体积浓度为70%。
在一个实施例中，步骤一中，所述37℃振荡的操作中，转速为220rpm。
在一个实施例中，步骤四和步骤五中，所述TB转化缓冲液为新鲜配制的。
这种大肠杆菌感受态细胞的制备方法不需要低温培养，在普通37℃摇床中 培养即可，没有设备要求的限制，既适用于一般实验室的制备，也可用于商业 化生产。与传统的感受态细胞制备方法相比，转化效率高且操作简单实用。
附图说明
图1为一实施方式的大肠杆菌感受态细胞的制备方法的流程图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对 本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以 便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实 施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发 明不受下面公开的具体实施的限制。
一实施方式的大肠杆菌感受态细胞的制备方法，如图1所示，步骤如下。
S10、将-80℃冷藏的大肠杆菌融化后画线接种于LB平板上，37℃培养过夜 后挑取单菌落于5mL的加入了MgCl2溶液的SOB培养基中，37℃振荡培养 12h～16h。
-80℃冷藏的大肠杆菌保存于LB和DMSO的混合液中，DMSO的浓度为 70%。
SOB培养基的配制过程如下：将2g胰蛋白胨、0.5g酵母膏、0.05g NaCl 和0.0186g KCl溶解在双蒸水中至100mL，调节pH为7.0后灭菌，得到SOB 培养基。
每毫升的SOB培养基中加入2mol/L的MgCl2溶液10μL。
本实施方式中，5mL的SOB培养基中加入2mol/L的MgCl2溶液50μL。
37℃振荡的操作中，转速为220rpm。
S20、取500μL S10中得到的培养液接种于50mL的加入了MgCl2溶液的 SOB培养基中，37℃培养约3h，使培养液的吸光值OD(A600)为0.4～0.6。
本实施方式中，50mL的SOB培养基中加入2mol/L的MgCl2溶液500μL。
采用添加了Mg2+的SOB培养基代替传统的LB培养基培养细菌，由实验可 知，用SOB培养基比LB培养基能提高感受态细胞的转化效率。
将500μL培养液接种于含有50mL的SOB培养基中，1∶10体积充分保证 了培养基的溶氧量，保证细菌良好的生长状态，有利于提高制得的大肠杆菌感 受态细胞的转化效率。
S30、将S20中得到的菌液转移至50mL无菌离心管，冰浴10min，接着4℃ 下4000rpm离心10min。
S40、将S30得到的离心液去上清，将沉淀重悬于15mL预冷的TB转化缓 冲液中，在冰上放置10min，接着4℃下4000rpm离心10min。
每20mL的TB转化缓冲液由如下成分组成：
12.5mL的双蒸水、4mL的1mol/L的KCl、2.4mL的0.45mol/L的MnCl2、 0.5mol/L的CaCl20.6mL和0.5mL的0.5mol/L的K-MES缓冲液。
0.5mol/L的K-MES缓冲液的配制过程如下：
称取9.76g MES（2-(N-吗啡啉)乙磺酸）完全溶解于80mL的双蒸水中，用 1mol/L的KOH调节pH为6.3，补加双蒸水到100mL，过滤灭菌后保存于-20℃， 得到所述0.5mol/L的K-MES缓冲液。
TB转化缓冲液最好采用新鲜配制的，从而使得制得的大肠杆菌感受态细胞 转化效率较高。
S50、将S40得到离心液去上清，将沉淀重悬于4mL预冷的所述TB转化缓 冲液中，加入DMSO并轻摇混匀，使DMSO的体积浓度为7%。
加入了7%的DMSO，有利于提高制得的大肠杆菌感受态细胞的转化效率。
S60、将S50得到的悬液在冰上放置10min后分装到预冷的无菌EP管中， 得到大肠杆菌感受态细胞。
得到的大肠杆菌感受态细胞可以在液体氮中至少放置1h后保存于-80℃中。
这种大肠杆菌感受态细胞的制备方法不需要低温培养，在普通37℃摇床中 培养即可，没有设备要求的限制，既适用于一般实验室的制备，也可用于商业 化生产。与传统的感受态细胞制备方法相比，转化效率高且操作简单实用。
具体实施例。
实施例1
将-80℃冷藏的细胞（保存于LB+70％DMSO）融化后划线接种于LB平皿 中，37℃培养过夜；挑单菌落于5mL SOB培养基中，SOB培养基中加入2mol/L 的MgCl2溶液50μL，37℃，220rpm振荡培养12h～16h。
取500μL培养液接种于50mL SOB培养基中（500mL锥形瓶瓶），SOB培 养基中加入2mol/L的MgCl2溶液500μL（20mM），于37℃培养约3h，使培养 液的吸光值OD(A600)为0.4～0.6。
菌液转移至50mL无菌离心管，在冰上放置冰浴10min，于4℃，4000rpm 离心10min。
去上清，将沉淀重悬于15mL预冷的TB转化缓冲液中，在冰上放置10min， 4℃，4000rpm离心10min。
将沉淀重悬于4mL预冷的新配的TB转化缓冲液中，再加入280μL DMSO， 然后轻摇使混匀，使其体积浓度为7%。
冰上放置10min后分到约40个提前预冷的500μL无菌EP管中（100μL/ 个），得到大肠杆菌感受态细胞。
得到的大肠杆菌感受态细胞可以在液体氮中至少放置1h后保存于-80℃中。 本实施例制备的大肠杆菌感受态细胞保存半年后，转化效率为90%。
对比例1
CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。
将-80℃冷藏的细胞（保存于LB+70％DMSO）融化后划线接种于LB平皿 中，37℃培养过夜；挑取单克隆于含3mL LB液体培养基的试管中，于37℃、 220rpm振荡培养过夜。
取1mL菌液接种至含有100mL LB液体培养基的试管中，于37℃，220rpm 振荡培养至OD600为0.4～0.6。
取50mL菌液转入50mL离心管中，冰上放置10min。
于4℃，4000rmp离心10min收集菌体,弃培养基，用移液器吸尽培养基。
加入10mL冰预冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，于4℃，4000rmp离心10min， 收集菌体。
移液器吸尽CaCl2溶液，每管加入4mL冰预冷的0.1M CaCl2溶液重悬菌体， 得到大肠杆菌感受态细胞。
对比例2
RbCl/KCl法制备大肠杆菌感受态细胞.
首先配置两种缓冲液TFB I和TFB II。TFB I缓冲液含：30mmol/L KAc、 100mmol/L RbCl、10mmol/L CaCl2、50mmol/L MnCl2、15%甘油。TFB II缓冲 液含：10mmol/L MOPS、75mmol/L CaCl2、10mmol/L RbCl、15%甘油。
其具体制备方法如下：
将-80℃冷藏的细胞（保存于LB+70％DMSO）融化后划线接种于LB平皿 中，37℃培养过夜；挑取细菌单克隆于5mL LB培养基中，37℃，220rpm振荡 过夜培养。
按1∶100比例接种细菌培养液至100mL LB培养基中（含20mmol/L MgSO4）, 剧烈振荡2～3h，OD值约为0.4,于4℃，2800r/min离心15min收集细菌。
用40mL冰预冷的TFB I重悬细菌，冰上孵育25min,4℃、2800r/min离心 15min收集细菌。
用4mL冰预冷的TFB II重悬细菌,冰浴15～60min后,100μL/管分装, -80℃贮存备用，得到大肠杆菌感受态细胞。
对比例3
Inoue法制备大肠杆菌感受态细胞。
配制Inoue转化缓冲液，其配制方法为：100mL双蒸水中溶解PIPES 1.51g， MnCl·4H2O 1.088g，CaCl2 0.166g，KCl 1.865g，调节pH到6.7即可，过滤 灭菌。
将-80℃冷藏的细胞（保存于LB+70％DMSO）融化后划线接种于LB平皿 中，37℃培养过夜；从LB固体培养基上挑取单菌落，接种于5mL液体LB中， 于37℃、220rpm振荡培养24h左右；按1:100比例接种到300mL SOB培养液 中，于18℃、220rpm过夜培养，次日测细菌培养液OD600达到0.5-0.55即可。
菌液分装到50mL离心管，冰浴10min，于4℃、2500g离心10min收集菌 体。
弃上清，加5mL预冷的Inoue转化缓冲液重悬菌体，将重悬液合并至一支 50mL离心管中，添加Inoue转化缓冲液至50mL，冰浴5min，于4℃、2500g 离心10min。
弃去上清，加入24mL Inoue转化缓冲液和1.8mL DMSO重悬细菌，冰浴 10min，得到感受态细胞。
实施例2
转化效率对比试验。
分别取1μL的PUC19质粒DNA（本实验室保存）并分别加入100μL实 施例1、对比例1、对比例2和对比例3制备的大肠杆菌感受态细胞中，轻轻混 合后冰浴35min。
42℃热休克45s，然后迅速置冰浴冷却5min，加入900μL的LB培养基， 37℃，150rpm振荡培养45min，使大肠杆菌复苏并表达抗性蛋白。
取100μL菌液稀释1000倍后取100μl涂布于相应的LB琼脂培养基。37℃ 倒置培养12h～16h，待菌落长出后，菌落记数，计算转化效率。
本实施例重复三次，每次做3个转化，计算平均值，确定转化效率，结果 如下表所示：
由上表可知，实施例1制备的大肠杆菌感受态细胞的转化效率是CaCl2法的 12～15倍左右，是RuCl/KCl法的2倍左右，与Inoue法的转化效率相近。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和 改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附 权利要求为准。