技术领域
本发明属于生物技术和植物学领域，更具体地，本发明涉及一种提高植物对氮的吸收利用能力的多肽、其编码核酸及其用途。
背景技术
氮素是植物生长中最重要的营养元素，氮肥的施加有助于粮食增产，但植物的氮肥利用率低已成为世界农业生产中的一个日益突出的问题。目前中国水稻氮肥的平均利用率仅为30-40％之间，其余未被利用的氮肥引起严重的环境污染和资源浪费，造成农民的经济损失。
面对农田氮素利用率低下所带来的危害，一种积极有效的措施就是选育氮高效植物品种，高效吸收利用土壤中的氮素，在一定的氮肥投入下获得较高的产量，从而增加经济效益和生态环境效益。因此，高效品种的选育是提高氮素利用率、减少资源浪费、发展持续农业的根本途径，研究发掘和利用氮高效或耐低氮植物种质资源具有十分重要的理论和实践意义。
但是，目前本领域中，对于氮高效利用涉及的关键理论问题，即植物体内氮素吸收运输的机制还知之甚少，尤其是氮素长途转运的分子机理研究较少。
因此，本领域还需要深入研究植物的氮利用机制，以及培育出氮高效利用的植物品种。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高植物对氮的吸收利用能力的多肽、其编码核酸及其用途；该多肽是具有SEQ ID NO:3氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
在本发明的第一方面，提供一种改良植物的方法，所述方法包括：在植物中过表达选自下组的多肽：
(a)SEQ ID NO:3氨基酸序列的多肽；或
(b)将SEQ ID NO:3氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列相同功能的由(a)衍生的多肽；或
(c)与SEQ ID NO:3氨基酸序列有至少80％(较佳地至少90％；更佳地至少95％，如98％，99％)相同性，且具有与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列相同功能的由(a)衍生的多肽。
在一个优选例中，所述的植物包括：茄科植物，十字花科植物。
在另一优选例中，所述的茄科植物包括(但不限于)：烟草属，如烟草；番茄属，如番茄；辣椒属，如辣椒；茄属，如马铃薯；枸杞属，如枸杞；颠茄属，如颠茄。
在另一优选例中，所述的十字花科植物包括：鼠耳芥属植物，如拟南芥；或芸薹属植物，如大白菜，小白菜。
在另一优选例中，所述方法包括：将编码(a)～(c)任一所述多肽的核酸转入植物中，从而过表达(a)～(c)任一所述多肽。
在另一优选例中，所述的方法包括：
(1)提供构建物，所述构建物包括：(a)～(c)任一所述多肽的表达盒；
(2)将所述构建物转入植物，从而过表达(a)～(c)任一所述多肽。
在另一优选例中，步骤(2)包括：
(i)将所述的构建物转化农杆菌，获得携带所述构建物的农杆菌；和
(ii)将植物组织或器官与步骤(i)中的携带所述构建物的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入植物。
在另一优选例中，所述改良植物包括：
提高植物对氮(例如含有氮的硝酸根)的吸收利用能力；
增加植物体内(包括地上部、地下部)的硝酸根含量；
促进茄科植物(如番茄)体内硝酸根更多地分配于地上部；
增加植物的生物量；
增加植物果实重量；或
增加植物的产量。
在另一优选例中，编码(a)的多肽的核酸具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供选自下组的多肽或其编码核酸在改良植物中的用途：
(a)SEQ ID NO:3氨基酸序列的多肽；或
(b)将SEQ ID NO:3氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列相同功能的由(a)衍生的多肽；或
(c)与SEQ ID NO:3氨基酸序列有至少80％(较佳地至少90％；更佳地至少95％，如98％，99％)相同性，且具有与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列相同功能的由(a)衍生的多肽。
在一个优选例中，所述的植物包括：茄科植物，十字花科植物。
在另一优选例中，所述的所述改良植物包括：
提高植物对氮的吸收转运能力；
增加植物体内(包括地上部、地下部)的硝酸根含量；
促进茄科植物(如番茄)体内硝酸根更多地分配于地上部；或
增加植物的生物量；
增加植物果实重量；
增加植物的产量。
在本发明的另一方面，提供一种植物细胞或组织，其包含外源的选自下组的多肽的编码核酸：
(a)SEQ ID NO:3氨基酸序列的多肽；或
(b)将SEQ ID NO:3氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列相同功能的由(a)衍生的多肽；或
(c)与SEQ ID NO:3氨基酸序列有至少80％(较佳地至少90％；更佳地至少95％，如98％，99％)相同性，且具有与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列相同功能的由(a)衍生的多肽。
在一个优选例中，所述的植物细胞或组织为非植物繁殖材料或为无法直接再生成植物的材料。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、实时荧光定量PCR分析番茄中SEQ ID NO:1基因的RNA转录本的转录水平。24天(培养24天后)番茄根部经0，0.5，5mM硝酸根处理4天。
图2、本发明的基因的在番茄不同组织中的表达模式分析。
图3、过表达番茄植株的硝酸根含量在地下及地上部分中都增加；但相对于野生型而言，过表达植株在地上部中增加的分配更多(相对于野生型，转基因植物的地上部/地下部硝酸根含量的比值增加)。其中，柱形图中柱形上方的数字表示的是地上部中的硝酸根含量与地下部中的硝酸根含量的比值。
图4、5mM低硝酸根条件下过表达本发明的基因的番茄的生物量高于野生型。
图5、过表达本发明的基因的番茄植株单果重量增加。
图6、过表达本发明的基因的拟南芥植株中地上部分及地下部分的硝酸根含量均显著上升。
具体实施方式
本发明人揭示一种可以极好地应用于植物品种的改良、提高植物对氮素的吸收利用效率的基因，本发明为开发氮高效的植物新品种提供了有价值的基因资源。
如本文所用，所述的“地上部”也称为“地上部分”是指植物植株的部分组织，当植株种植于土地中或培养于培养液中时，该部分组织位于植株的地面或培养液面以上的部分。
如本文所用，所述的“地下部”也称为“地下部分”是指植物植株的部分组织，当植株种植于土地中或培养于培养液中时，该部分组织位于植株的地面或培养液面以下的部分。
如本文所用，所述的“植物”比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。更具体地，所述的植物包括(但不限于)：小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、青蒿、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、烟草、油棕、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、杨树、柳树、松、杉、桉树、续随子、绿玉树、西谷椰子、西蒙得木、天然橡胶树和观赏植物等。本发明对于适用于本发明的植物(或作物)没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，或适合于进行基因敲除的操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。
作为本发明的优选方式，所述的“植物”包括但不限于：茄科植物，十字花科植物。比如，所述的“植物”包括但不限于：茄科植物的烟草属，如烟草；番茄属，如番茄；辣椒属，如辣椒；茄属，如马铃薯；枸杞属，如枸杞；颠茄属，如颠茄等；或十字花科植物的鼠耳芥属植物，如拟南芥；芸薹属植物，如大白菜，小白菜。
如本文所用，术语“提高”、“改良”或“增强”是相互可以交换的并且在应用含义上应当意指与本文中定义的对照植物相比较，至少2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选的至少15％或20％、更优选25％、30％更高的氮吸收利用能力或更高的生物量、产量或果实重量。
关于“对照植物”，选择合适的对照植物是实验设计的例行部分，可以包括对应的野生型植物或无目的基因的相应转基因植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同的品种。对照植物也可以是因分离而丢失转基因植物的个体。如本文所用的对照植物不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。
如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核 酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果目的基因与某一基因组的组合通常不是天然存在的，则该目的基因对于该基因组来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。
如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽(本发明中为SEQ ID NO:3多肽或其保守性变异多肽、活性片段或活性衍生物)所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括一下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子。此外，还可选择性地包括抗性元件、筛选(选择)元件或报告基因元件，如GUS、Bar，这些元件是操作性相连的。
如非另外说明，“本发明的多肽(蛋白)”、“目的多肽(蛋白)”、“所述的多肽(蛋白)”是指SEQ ID NO:3多肽或其保守性变异多肽、活性片段或活性衍生物。
本发明的多肽还包括其片段、变体、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的多肽相同的生物学功能或活性的多肽。所述的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明的多肽的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，所述多肽的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的本发明的多肽的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长多肽的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长多肽的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
在本发明中，术语“本发明的多肽”指SEQ ID NO:3序列的多肽。该术语还包括具有与SEQ ID NO:3相同功能的变异形式(变体)。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个， 最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明的多肽的DNA杂交的DNA所编码的多肽。
任何与本发明的多肽同源性高(比如与SEQ ID NO:3所示的序列的同源性为80％或更高；优选的，同源性为90％或更高；更优选的，同源性为95％或更高，如同源性96％，98％或99％)的、且具有提高植物对氮的吸收利用能力的多肽也包括在本发明内。
本发明的多肽的“保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:3的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
氨基酸残基 代表性的取代 优选的取代 Ala(A) Val；Leu；Ile Val Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln Asp(D) Glu Glu Cys(C) Ser Ser Gln(Q) Asn Asn Glu(E) Asp Asp Gly(G) Pro；Ala Ala His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg Met(M) Leu；Phe；Ile Leu Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr Thr(T) Ser Ser Trp(W) Tyr；Phe Tyr Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还涉及编码本发明的多肽或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的基因组序列或SEQ ID NO:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:3序列的多肽，但与SEQ ID NO:1所示的基因组序列或SEQ ID NO:2所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO:3的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体(变体)，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％，更佳地至少85％，更佳地至少90％，更佳地至少95％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:3所示的成熟多肽有相同 的生物学功能和活性。
本发明的多肽的编码核酸的全长核苷酸序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。
本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或多肽编码核酸经基因工程产生的宿主细胞。
本发明中，编码本发明的多肽的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。较佳地，所述表达载体还可选择性地加入抗性元件、筛选(选择)元件或报告基因元件，如Bar、GUS。
所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。
本发明提供了一种改良植物的方法，该方法包括提高所述植物中本发明的多肽的表达。所述改良植物包括：提高植物对氮的吸收利用能力；增加植物体内的硝酸根含量；促进茄科植物(如番茄)体内硝酸根更多地分配于地上部；增加植物的生物量；增加植物果实重量；或增加植物的产量。
在得知了本发明的多肽的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的多肽的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带其表达基因的表达单位递送到靶点上，并使之表达活性的多肽。
作为本发明的一种实施方式，将编码所述多肽的多核苷酸通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源多核苷酸的重组载体导入到可表达所述多肽的植物细胞中，使所述的植物细胞表达所述的多肽。
优选地，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：
(1)将外源的本发明的多肽的编码核酸转入植物器官或组织，获得转化入所述多肽的编码核酸的植物组织或器官；和
(2)将步骤(1)获得的转入了外源的本发明的多肽的编码核酸的植物组织或器官再生成植物植株。
作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：
(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有本发明的多肽的编码核酸；
(s2)将植物组织或器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使所述多肽的编码核酸转入并且整合到植物细胞的染色体上；
(s3)选择出转入所述多肽的编码核酸的植物组织或器官；以及
(s4)将步骤(s3)中的植物组织或器官再生成植物。
本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物包括：转入了所述多肽的编码核酸的转基因植物。
可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。
此外，本发明还涉及利用本发明的多肽或其编码核酸作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用本发明的多肽或其编码核酸作为一种分子标记，通过检测植物中本发明的多肽的表达情况，鉴定植物的性状，如氮吸收利用能力、生物量、产量或果实重量。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
培养基配方
(1)1/2MS液体培养基
KOH调至pH5.7。
(2)1/2MS固体培养基
1/2MS液体培养基；
1％琼脂粉。
(3)0，0.5或5mM硝酸根的液体培养基(1/2×MS培养液)
1/2MS液体培养基中减去KNO3，即为0硝酸根培养基。
0硝酸根培养基中加入0.5mM KNO3，即为0.5mM硝酸根培养基。
0硝酸根培养基中加入5mM KNO3，即为5mM硝酸根培养基。
实施例1、本发明的多肽及其基因序列
本发明的基因的序列如SEQ ID NO:1所示。其中编码区序列如SEQ ID NO:2所示。
GCCTAAAATGGGTGATATTGAAGGATCACCAGGAAGTTCAATGCATGGTGTTACTGGTAGAGAACCAGTTCTTGCATTTTCAGTTGCTTCACCAATTGTACCAACTGATACATCAGCCAATTTCAAAGTCCCTGTTGATTCTGAACATAAAGCTAAAGTTTTTAAATTTTATTCGTTTTCGAAACCTCATGGACTAACGTTTCAACTCTCATGGATTTCATTTTGTACTTGTTTCGTATCGACTTTTGCTGCAGCCCCTTTAGTCCCTATTATTAGGGACAATCTTAATTTAACTAAAATGGATGTTGGTAATGCTGGAGTTGCCTCTGTTTCGGGTAGTATCTTGTCTAGGCTAGCTATGGGCGCGATATGTGACATGTTAGGTCCTAGATATGGTTGCGCGTTCCTTATAATGTTATCAGCCCCAACTGTTTTTTGTATGTCATTTGTGTCATCGGCTGGAGGGTACGTTGCTGTGAGGTTTATGATTGGGTTTTCACTAGCAACGTTTGTGTCATGTCAGTATTGGATGAGTACGATGTTTAATAGTCAAATCATTGGACTTGTGAATGGTACAGCTGCTGGATGGGGTAATATGGGTGGTGGTGCTACTCAACTTATTATGCCTTTGCTCTACGATATAATACGTAGAGCAGGGGCAACCCCGTTCACTGCTTGGAGAATCGCATTTTTTATTCCTGGATGGCTTCATGTTATTATGGGAATTTTAGTTTTAACTCTTGGACAAGATTTACCTGATGGTAACCTCGCTTCTTTACAGAAGAAAGGCGATGTTTCTAAAGATAAATTCTCAAAGgtcagtgacattcagtaccatatcaaaattaacgtttacgtttagctaacatttgttatctgcattagATATTATGGTATGCTGCAACAAATTACAGAACATGGATCTTTGTTCTGCTCTATGGATACTCAATGGGAGTTGAATTAACTACAGATAACGTGATTGCTGAGTATTTCTTCGATAGgttagatttgatttgtttccctatagtacttaaaacattatacgaacataaagaaattgagtcaatttttgtatgtagATTTGATTTGAAGCTTCATACAGCTGGAATCATCGCTGCAACATTTGGCATGGCTAACTTATTAGCGCGACCATTTGGAGGATGGTCATCAGATGTTGCAGCTAAACATTTCGGGATGAGAGGCAGATTATGGAATTTATGGATTTTACAAACACTTGGTGGTGTGTTCTGTTTACTACTTGGAAGGGCTACTACACTTCCTCTGGCTATTACTTGGATGATCATATTCTCAATAGGTGCACAAGCAGCATGTGGTGCAACGTTTGGAATTATTCCCTTTATTTCGCGAAGATCATTAGGTATAATATCAGGTATGACAGGAGCTGGAGGCAATTTTGGTTCCGGATTGACACAACTACTGTTTTTCACGAGCACAAAGTACTCGACAGGAACAGGACTAACGTATATGGGGATGATGATCATCGCGTGTACACTTCCAGTAATGTTAGTTCATTTTCCACAGTGGGGTAGTATGTTTTTGCCTCCATCTAAAGATCCTATTAAGGGTACTGAAGAACATTATTTTGGTTCTGAGTATACTGAGGATGAGAAACAAAAGGGAATGCACCAGAACAGCATCAAGTTCGCGGAAAACAGCAGGACAGAGCGTGGGAAGAAGCGCGTTGGTTCAGCACCTACTCCGCCTAATGTAACACCAAATCGCGTCTGATGGGGAAAAAATTAAAATACTTACTCGCAGTTCATGCT(SEQ ID NO:1)
SEQ ID NO:1中，从ATG开始编码，下划线标示的是编码区。该基因编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
实施例2、本发明的基因对环境硝酸根含量的响应
番茄(Solanum lycopersicum)种子在1/2MS培养基(固体)上培养，培养条件为16小时光照/8小时黑暗、22℃，培养1周后转至1/2MS液体培养液中培养17天；之后再转至0，0.5或5mM硝酸根的液体培养液(限制硝酸钾的1/2×MS培养液)中培养。在含有不同浓度硝酸根1/2MS培养液中培养4天后，获取整株植物，采用实时荧光定量RT-PCR分析植株中所述基因的转录表达情况。
设计实时定量荧光RT-PCR引物序列，用于测定本发明的基因的引物为：
上游引物：5’-ggtacccagacgcgatttggtgtt-3’(SEQ ID NO:4)；
下游引物：5’-tgtacacttccagtaatgttagtt-3’(SEQ ID NO:5)；
GAPDH为一个组成型表达的对照基因，作为均一化的用途。用于测定GAPDH的引物如下：
GAPDH+：5’-ctgctctctcagtagccaacac-3’(SEQ ID NO:6)；
GAPDH-：5’-cttcctccaatagcagaggttt-3’(SEQ ID NO:7)；
引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
实时荧光定量PCR方法：
整株植物经液氮研磨，使用Trizol试剂盒(Invitrogen)提取总RNA。具体提取方法参照Trizol试剂盒说明书。
总RNA经DNaseI处理，37℃，30分钟。经等体积酚、氯仿抽提，0.1体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2倍体积无水乙醇沉淀，-20℃，30分钟。12000g，4℃，15分钟。1mL 70％乙醇洗沉淀一次，风干5分钟，用30μL DEPC处理过的水溶解沉淀，得到无DNA的总RNA。
总RNA样品取3μg，分别使用M_MLV(Promega)的反转录体系进行反转录，具体方法参照Promega公司M_MLV试剂盒说明书。
实时定量荧光PCR的反应体系如下(总体积25μL)：
Premix Ex TaqTM(2×)(Takara)：12.5μL，
10μM Primer(+)：0.5μL，
10μM Primer(-)：0.5μL，
cDNA模板：5μL，
无菌去离子水：6.5μL。
实时定量荧光PCR的反应条件：
首先，95℃，2分钟(预变性)；
然后，95℃，15秒；58℃，15秒；72℃，20秒；共进行40个循环。
实时定量荧光PCR仪器采用Eppendorf Mastercycler realplex2。
实时定量荧光PCR的结果如图1所示，番茄中具有SEQ ID NO:1所示基因组序列的基因的转录水平受硝酸根诱导上升。
实施例3、本发明的基因在根、茎、叶及花中都有表达
番茄种子在1/2MS培养基(固体)上培养，培养条件为16小时光照/8小时黑暗、22℃，培养1周后转至0，0.5或5mM硝酸根的液体培养基(限制硝酸钾的1/2×MS培养液)中培养，再培养21天，分别获取番茄植株的根、茎、叶及花，采用实时定量荧光PCR方法检测本发明的基因在番茄不同组织中的表达情况，PCR实验条件如实施例2。
结果如图2所示，具有SEQ ID NO:1所示基因组序列的基因在番茄的根、茎、叶及花中都有表达，但是在花中表达最强，叶和根中其次，茎中最低。
实施例4、过表达本发明的基因对于硝酸根的调节作用
过表达本发明的基因的番茄植株的构建：
设计及合成如下引物：
5′-ggatccatgggtgatattgaaggat-3′(SEQ ID NO:8)；
5′-actagtcagacgcgatttggtgtta-3′(SEQ ID NO:9)；
以上述为引物，以番茄Micro-Tom的cDNA为模板，以KOD-PLUS体系(Toyobo公司)进行PCR。PCR产物回收后克隆进pGEM-T easy载体中，序列测定验证序列正确。进行BamHI和SpeI的双酶切，连接进表达载体pCambia1301的BamHI/SpeI中(pCambia1301获自美国UCSD)中。正确连接的重组载体转入农杆菌Soup3101(获自美国UCSD)中。
番茄Micro-Tom的种子进行消毒，70％的乙醇浸泡90秒，用无菌水冲洗3-4次，再用20％次氯酸钠浸泡15分钟，用无菌水冲洗7-8次，之后将种子转移到1/2MS培养基上生长。待子叶完全展开切下番茄幼苗的子叶，置于共培养培养 基(MS培养基，含200μg/ml肌醇、200μM乙酰丁香酮(AS)、0.8μg/ml吲哚乙酸(IAA)、0.8μg/ml 6-苄氨基嘌呤(6-BA))，24℃光照培养24小时。
接种已转入目的质粒的农杆菌Soup3101单菌落于10ml含有卡那霉素(50mg/L)和利福平(20mg/L)的液体YEP培养基中。28℃快速振荡培养24小时；然后取其中1ml转到含相同抗生素的20ml液体YEP培养基中，28℃快速振荡培养24小时。共培养待农杆菌长到OD600在0.6至0.8之间时，将农杆菌4000rpm离心5分钟，并用含有200μM乙酰丁香酮(AS)的液体MS培养基重悬农杆菌，使最后的OD600值达到0.7左右。
将切下来的子叶放在稀释好的农杆菌菌液中，浸染10分钟。将外植体转移到先前的共培养基上，共培养2天，第一天25℃暗培养，第二天在25℃光培养。
外植体的选择与植株再生将外植体转到选择培养基，即MS培养基中含有200μg/ml肌醇、1.5μg/ml 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、0.1μg/ml吲哚乙酸以及用于转化筛选的抗生素卡那霉素50μg/ml。25℃16小时光照培养。
当再生芽3cm高时，将它们转至生根培养基，即MS培养基含200μg/ml肌醇、0.1μg/ml吲哚乙酸、200μg/ml羧苄青霉素、50μg/ml卡那霉素。
将幼苗移栽到温室，得到转基因植株。
硝酸根含量测定：番茄植株在1/2×MS培养液中水培4周，以0.5、5、20mM KNO3(99.15％N15丰度，pH＝6.0，购自上海化工研究院)标记180min，0.1mM CaSO4洗1min，分地上、地下部取材，80℃干燥3天，以元素分析仪-同位素质谱联用(Vario ELⅢ/Isoprime，德国)测定N15含量。
为了明确本发明的基因在植物体内的具体生理作用，对该基因过表达的番茄植株中地上部及地下部硝酸根的分布进行了分析。结果显示，在0.5，5，20mM的含有硝酸根的培养液中，过表达番茄的地上部(Shoot)及地下部(Root)中硝酸根含量都上升，使得地上部相对于野生型而言获得更多比例的分配(即相对于野生型，转基因植物的地上部/地下部硝酸根含量的比值增加)，如图3，提示本发明的基因作用于硝酸根的再分配过程。
因此，本发明的基因的过表达能增加番茄的地上部和地下部硝酸根的含量，并能改变地上部和地下部的分配比例。
实施例5、低硝酸根条件下过表达本发明的基因对番茄的生物量影响
前述制备的过表达本发明的基因的番茄以及野生型番茄的种子在1/2×MS培养基(固体)中培养1周，移苗至含有5mM硝酸根的液体培养基(限制硝酸钾的1/2×MS培养液)中水培3周，测定生物量。
结果显示，在5mM低硝酸根条件下，过表达番茄植株的地上部及地下部的生物量高于对照野生型，如图4。
番茄种子种于1/2MS固体培养基中光照培养1周，移至5mM硝酸根的液体培养基(限制硝酸钾的1/2×MS培养液)中光照培养至果实完全变红(约2.5个月)，测定获得的果实的重量。在5mM低硝酸根条件下，过表达番茄植株的单个果实重量高于对照野生型，如图5。
因此，在含有硝酸根的培养条件下，本发明的基因的过量表达能极其显著地增加番茄的地上部和地下部生物量以及产量。
综上可见，本发明的基因受硝酸根诱导表达量上升，在花茎叶根中都有表达，过表达番茄植株的地上部及地下部硝酸根含量增加，并在地上部分配更多硝酸根，低硝酸根条件下的过表达番茄地上部及地下部的生物量及单果重显著高于野生型。
实施例6、过表达本发明的基因对拟南芥中硝酸根分配的影响
利用前述实施例4制备的转入了本发明的基因的农杆菌Soup3101制备转基因拟南芥，方法如下：拟南芥(Col-0)在花序轴为3-4cm时打顶，主花序打顶后4天转化。转化前1小时浇足水，转化时最后采用浸泡方法后再喷洒。常规方法筛选获得过表达本发明的基因的拟南芥。
过表达本发明的基因的拟南芥(十字花科)及野生型拟南芥在1/2×MS培养基(固体)中培养1周，移苗至1/2×MS培养液中水培3周，测定地上及地下部分的硝酸根含量。
结果显示，过表达拟南芥植株的地上部及地下部的硝酸根含量显著高于对照野生型，如图6。
因此，在含有硝酸根的培养条件下，本发明的基因的过量表达能极其显著地增加拟南芥的地上部和地下部中硝酸根含量。
综上可见，本发明的基因不仅可在茄科的番茄中过表达后提高植物氮素吸收分配，在另一物种的十字花科的拟南芥中过表达后也可以提高植物氮素吸收分配。
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