《以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法.pdf（7页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610140721.1 (22)申请日 2016.03.11 (83)生物保藏信息 CGMCC No.11976 2016.01.07 (71)申请人 中国农业大学 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路2号 (72)发明人 梅晓宏柳倩韩诗雯陈西 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王文君 (51)Int.Cl. C12P 21/02(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (54)发明名称 以无机培养基高效表达猕猴。
2、桃果胶甲酯酶 抑制剂的方法 (57)摘要 本发明涉及以无机培养基高效表达猕猴桃 果胶甲酯酶抑制剂的方法， 其为将含高拷贝重组 质粒的巴斯德毕赤酵母菌株GS115160107种子液 接入7L发酵罐中， 以3L培养基量为发酵体系， 经 初始甘油消耗期、 分批甘油补料期及甲醇补加诱 导期， 共计发酵96h。 本发明利用7升发酵罐对重 组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂在无机培养基中进 行高密度发酵培养表达进行初步探索， 该研究成 果将有力促进重组果胶甲酯酶抑制剂大规模工 业化生产， 从而促进该抑制剂在果蔬汁工业中的 应用。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 105861603 A 2016.08.1。
3、7 CN 105861603 A 1.以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法， 其特征在于， 其为将含高 拷贝重组质粒的巴斯德毕赤酵母菌株GS115160107种子液接入7L发酵罐中， 以3L培养基量 为发酵体系， 经初始甘油消耗期、 分批甘油补料期及甲醇补加诱导期， 共计发酵96h； 巴斯德 毕赤酵母菌株GS115160107的保藏号为CGMCC11976。 2.如权利要求1所述的以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法， 其特 征在于， 所述种子液为高拷贝重组质粒的巴斯德毕赤酵母菌株GS115160107发酵至OD600 2-6所得。 3.如权利要求2所述的以无机培养基高。
4、效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法， 其特 征在于， 所述种子液的制备方法为： 将高拷贝重组质粒的巴斯德毕赤酵母菌株GS115160107 接种到BMGY培养基上， 28， 摇床转速为220rpm发酵至OD6002-6， 得到种子液。 4.如权利要求2所述的以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法， 其特 征在于， 种子液的接种量为按照体积百分含量5-10接入初始培养基。 5.如权利要求2所述的以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法， 其特 征在于， 发酵期间用质量百分含量85的磷酸及氨水控制pH值为6.0。 6.如权利要求2所述的以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的。
5、方法， 其特 征在于， 发酵期间控制溶氧在20以上。 7.如权利要求2所述的以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法， 其特 征在于， 发酵期间培养基中的甘油耗尽， 溶氧反弹后补加50的含有微量元素为12ml/L的 甘油。 8.如权利要求2所述的以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法， 其特 征在于， 发酵期间菌体量达到200g/L时， 停止补加甘油， 待甘油耗尽时补加100含有微量 元素为12ml/L的甲醇诱导表达。 9.如权利要求8所述的以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法， 其特 征在于， 补加甲醇， 开始流加速度为1ml/h/L， 最后增加到5ml/h/L。
6、。 10.权利要求1-9任一项所述以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法 在果蔬汁工业中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105861603 A 2 以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑 制剂的方法。 背景技术 0002 果蔬汁主要由浆液和浑浊态物质组成。 浑浊态在果蔬汁的颜色、 风味和质地等感 官品质方面发挥重要的作用。 然而， 果蔬汁在加工及储存过程中经常会发生浑浊态消失的 现象， 这主要是由于果蔬汁内源果胶甲酯酶对果胶的脱甲酯化作用而产生的。 为了避免果 蔬汁的浑。
7、浊态消失现象， 则需抑制果胶甲酯酶的活性。 工业上生产果蔬汁通常采用热加工 处理的方式钝化果胶甲酯酶的活性， 但此方法极易影响果蔬汁的感官品质及营养成分。 果 胶甲酯酶抑制剂(PEMI)可以有效抑制植物内源果胶甲酯酶的活性， 为果蔬汁在加工中由于 脱甲酯化作用而产生浑浊态消失的现象提供了一个非常具有应用前景的解决方法。 然而从 植物体内直接提取果胶甲酯酶抑制剂十分困难， 并且提取量极低， 目前只可以从猕猴桃果 实中获取果胶甲酯酶抑制剂。 0003 本实验室在上述研究背景下， 利用巴斯德毕赤酵母表达系统已高效表达出对果胶 甲酯酶有抑制活性的重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂， 但是只限于在摇瓶水平的小规。
8、模表 达， 远远不能满足果蔬汁工业生产的需求。 为了解决上述存在的问题， 本发明利用7升发酵 罐对重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂在无机培养基中进行高密度发酵培养表达进行初步探 索， 该研究成果将有力促进重组果胶甲酯酶抑制剂大规模工业化生产， 从而促进该抑制剂 在果蔬汁工业中的应用。 发明内容 0004 介于现有技术猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的表达只限于在摇瓶水平， 远远不能满 足果蔬汁工业生产的需求， 本发明的目的是提供以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶 抑制剂的方法。 0005 本发明提供以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法， 其为将含高 拷贝重组质粒的巴斯德毕赤酵母菌株GS11516。
9、0107种子液接入7L发酵罐中， 以3L培养基量 为发酵体系， 经初始甘油消耗期、 分批甘油补料期及甲醇补加诱导期， 共计发酵96h。 0006 其中， 所述巴斯德毕赤酵母菌株GS115160107的保藏号为CGMCC11976， 分类名称 为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)， 保存单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心， 地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏日期为2016年1月7日。 该菌株的 基因型为arg4his4aox1:ARG4， 表型： Muts， His-， Arg+。 0007 其中， 所述种子液为高拷贝重组质粒的巴斯德毕赤酵母菌株GS1151。
10、60107发酵至 OD6 0 02-6所得， 其具体制备方法为： 将高拷贝重组质粒的巴斯德毕赤酵母菌株 GS115160107接种到BMGY培养基上， 28， 摇床转速为220rpm发酵至OD6002-6， 得到种子 液。 说明书 1/4 页 3 CN 105861603 A 3 0008 其中， 种子液的接种量为按照体积百分含量5-10接入初始培养基(以接种完为 100)。 0009 其中， 所述发酵所用的初始培养基优选为BSM培养基。 0010 其中， 发酵期间用质量百分含量85的磷酸及氨水控制pH值为6.0。 0011 其中， 发酵期间控制溶氧(DO)在20以上。 0012 其中， 发酵。
11、期间培养基中的甘油耗尽， 溶氧反弹后补加50(甘油与水的体积比为 1： 1)的含有微量元素为12ml/L的甘油。 0013 其中， 发酵期间菌体量达到200g/L时， 停止补加甘油， 待甘油耗尽， 补加含有微量 元素为12ml/L的甲醇诱导表达。 0014 其中， 所述补加甲醇， 开始流加速度为1ml/h/L， 24h内逐渐增加到5ml/h/L。 0015 本发明还提供所述以无机培养基高效表达猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的方法在果 蔬汁工业中的应用。 0016 本发明利用7升发酵罐对重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂在无机培养基中进行高密 度发酵培养表达进行初步探索， 该研究成果将有力促进重组果胶甲酯酶抑制。
12、剂大规模工业 化生产， 从而促进该抑制剂在果蔬汁工业中的应用。 附图说明 0017 图1为实施例1中BSA蛋白浓度标准曲线图。 0018 图2为实施例1中不同表达时间发酵上清液的电泳照片。 其中， 泳道1-9： 诱导0、 12、 24、 36、 48、 60、 72、 84、 96h时的发酵上清； M： 彩色预染蛋白质分子量标准， 从上到下分子量依 次为170、 130、 95、 72、 55、 43、 34、 26、 17、 10kDa。 具体实施方式 0019 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0020 实施例1 0021 1.材料 0022 (1)菌株： 重组巴斯德。
13、毕赤酵母菌株GS115160107由本实验室构建， 于甘油中-80 保存。 所述巴斯德毕赤酵母菌株GS115160107的保藏号为CGMCC11976， 保存单位为中国微 生物菌种保藏委员会普通微生物中心， 地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏日期 为2016年1月7日。 该菌株的基因型为arg4his4aox1:ARG4， 表型： Muts， His-， Arg+。 0023 (2)化学试剂： 蛋白质Marker购于天根生化科技(北京)有限公司； 生物素、 BSA标准 蛋白及考马斯亮蓝G250购自北京畅华志城科技有限公司； 丙烯酰胺、 甲叉双丙烯酰胺、 无氨 基酵母氮源(YNB)为A。
14、mresco公司产品， 购自北京经科宏达生物技术有限公司； 其他试剂均 为国产分析纯。 0024 2.方法 0025 (1)重组巴斯德毕赤酵母菌株在7L发酵罐中的诱导表达方法 0026 A.以BMGY为培养基， 28， 摇床转速为220rpm， 培养发酵种子液至OD6002-6。 0027 B.在7L发酵罐中加入3LBSM培养基， pH电极校准后， 进行罐体在位121灭菌， 灭 菌结束待温度降至30后， 按照每升BSM培养基加4.35ml/h的标准加入过滤除菌的微量元 说明书 2/4 页 4 CN 105861603 A 4 素(PTM1)， 用质量百分含量25的氨水调节pH至6.0， 然后校。
15、准溶氧电极， 最后按体积百分 含量5-10的接种量将种子液接种至发酵罐内(以接种完为100)， 开始发酵， 随着菌体的 生长， 溶氧量(DO)将从100逐渐下降， 通过级联搅拌速度和通气量使DO维持在20以上， 直到甘油耗尽， 此为初始甘油消耗期。 0028 C.初始甘油消耗期后进入分批甘油补料期， 每次甘油耗尽， 溶氧反弹后， 补加50 的(甘油以水按体积比1:1稀释)含有微量元素为12ml/L的甘油， 甘油补加泵、 通气量与搅拌 级联， 控制溶氧(DO)在20以上， 温度30， 用氨水控制pH在6.0左右。 0029 D.菌体量达到200g/L后， 停止补加甘油， 待甘油完全耗尽后， 开始。
16、补加100(纯甲 醇不以水稀释)含有微量元素为12ml/L的甲醇进行诱导表达， 此为甲醇补加诱导期。 待整体 发酵时间达到96小时时结束发酵。 0030 E.发酵结束后， 发酵菌液在12000rpm离心15min， 得上清， 进行Tricine-SDS-PAGE 检测。 0031 (2)表达上清的Tricine-SDS-PAGE检测方法 0032 A.制胶： 分别制备体积百分比10的分离胶和体积百分比4的浓缩胶。 0033 B.在1.5mL微离心管中， 将60 L上清液和60 L2SDS样品缓冲液充分混合， 在沸 水浴中煮7-9min。 0034 C.用10 L枪小心上样， 尽量使样品在孔的底。
17、部成一薄层。 样品上样量为30 L， 低分 子量蛋白质Marker上样量为8 L。 空置的加样孔， 需加等体积的空白1SDS样品缓冲液， 以 防相邻泳道样品的扩散。 0035 D.以80V恒压进行电泳， 当样品进入浓缩胶后将电压升至120V。 0036 E.待溴酚兰跑至胶的底部， 取出凝胶， 放在合适大小的容器中， 用染色液覆盖凝 胶， 缓慢摇动0.5-1h。 0037 F.将凝胶从染色液中取出， 用自来水小心冲掉凝胶表面上的染色液， 然后放入脱 色液中， 以脱色液覆盖凝胶， 缓慢摇动过夜， 其间更换脱色液3-4次， 直至获得清晰的蓝色条 带及干净背景。 0038 (3)发酵上清液中蛋白浓度的。
18、测定方法 0039 A.标准曲线绘制 0040 取10支1.5ml离心管， 按照表1加入各试剂： 0041 表1蛋白质浓度标准曲线的制备 0042 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 BSA母液( l) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 双蒸水( l) 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 蛋白浓度(mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0043 将上述各溶液混合均匀后， 向各管中分别加入980 l考马斯亮蓝G250溶液， 摇匀， 室温反应2min， 测定595nm处的吸光值， 以BSA浓度为横坐标，。
19、 吸光值为纵坐标， 绘制标准曲 线。 0044 B.样品中蛋白含量的测定 0045 另取一干净的离心管， 加入20 l样品溶液和980ul考马斯亮蓝G250溶液， 摇匀， 室 说明书 3/4 页 5 CN 105861603 A 5 温反应2min， 测定595nm处的吸光值， 由标准曲线即可得样品溶液中的蛋白含量。 0046 3.结果 0047 (1)BSA蛋白浓度标准曲线如图1所示。 0048 (2)不同表达时间发酵上清液的电泳结果如图2所示。 由电泳图及结合所测的发酵 上清液总蛋白浓度可知， 甲醇诱导表达60h时总蛋白浓度达到最高值900mg/L， 随后蛋白浓 度开始下降， 甲醇诱导表达48h以后目的蛋白含量没有显著增加， 应用Bandscan软件分析发 现， 48h目的蛋白占总蛋白的比例约为7.7， 由此可计算出发酵罐高密度培养48h后重组果 胶甲酯酶抑制剂产量约为59.7mg/L。 说明书 4/4 页 6 CN 105861603 A 6 图1 图2 说明书附图 1/1 页 7 CN 105861603 A 7 。