技术领域
本发明涉及植物原生质体技术领域，尤其涉及一种油茶原生质体的制备和纯化方法。
背景技术
油茶属常绿小乔木。因其种子可榨油(茶油)供食用，故名。茶油色清味香，营养丰富，耐贮藏，是优质食用油；也可作为润滑油、防锈油用于工业。茶饼既是农药，又是肥料，可提高农田蓄水能力和防治稻田害虫。果皮是提制栲胶的原料。
油茶喜温暖，怕寒冷，要求年平均气温16～18℃，花期平均气温为12～13℃。突然的低温或晚霜会造成落花、落果。要求有较充足的阳光，否则只长枝叶，结果少，含油率低。要求水分充足，年降水量一般在1000毫米以上，但花期连续降雨，影响授粉。要求在坡度和缓、侵蚀作用弱的地方栽植，对土壤要求不甚严格，一般适宜土层深厚的酸性土，而不适于石块多和土质坚硬的地方。
原生质体(protoplast):脱去细胞壁的细胞叫原生质体，是一生物工程学的概念。原生质体一词来源于原生质(protoplasm)。原生质指组成细胞的有生命物质的总称，是物质的概念。原生质体是组成细胞的一个形态结构单位。在细胞学历史上，"细胞"(cell)一词是由Hooke提出的，意为"小室"。后来发现了原生质，对细胞的认识与Hooke时期不同了，1880年Hanstein提出"原生质体"一词。由于细胞一词的出现 较原生质体早，故沿用至今。
植物原生质体在科学研究中具有重要作用，在研究细胞壁再生机理、细胞对激素的作用机理、体细胞杂种的培育、转入外源基因培育转基因植株等方面都有应用。一般制备原生质体的方法有机械法和酶法。酶法由于操作简单，获得的细胞数目多，目前应用广泛，但是酶等化学试剂会对细胞产生不良影响，影响原生质体的下游实验。机械法由于制备原生质体的数量少没有受到重视。机械法不受酶等试剂的影响，制备的原生质体形态完整并且有活性，所需时间短，费用低，是一种很有发展前景的方法。目前，油茶原生质体的制备研究报道很少，用机械法制备油茶原生质体的研究还没有报道。
发明内容
本发明提供了一种油茶原生质体的制备和纯化方法。
本发明采用如下技术方案：
本发明的油茶原生质体的制备和纯化方法的具体步骤如下：
A制备方法：
A1从室外切取油茶一年生枝条，带回水培1-2天；
A2取6片成熟叶，用刀片切去叶片的边缘和叶片主脉，并在叶片每隔0.5-1cm的位置切上一些缝隙，但不要切断叶片；
A3将带有缝隙的叶块浸入蔗糖溶液中进行质壁分离0.5-1h，期间用镊子将上浮叶块压入蔗糖溶液中；
A4取出叶块，用锋利的刀片与叶块成45°把叶块切成细长条，越细越好；
A5将细叶条转移到盛有3ml叶条洗涤液的容器中，放置30s-1min；6片叶可以分3-4批来切条加入到洗涤液中，以材料在溶液中不拥挤为限度；
A6用镊子将每次洗涤过的叶条取出，放入2ml 13％甘露醇CPW溶液中，放置5-15min；3-4批细叶条的原生质体依次收集在同一管溶液中；
A7用镊子去掉叶条，得到油茶原生质体溶液。
2原生质体纯化：
B1在油茶原生质体溶液的底部加入蔗糖溶液，原生质体溶液与蔗糖溶液的体积比是1∶1，漂洗原生质体1-5min；
B2转移上层原生质体溶液到离心管中，进行离心，去掉上清液；
B3沉淀用等量蔗糖溶液悬浮，再离心，去掉上清液；
B4沉淀用等量蔗糖溶液悬浮，再离心，留下上清液，去掉沉淀；
B5上清液经再次离心，去掉上清液，沉淀用少量的质量-体积百分比浓度是18％蔗糖溶液悬浮并转移到新离心管中；
B6将原生质体悬浮液加在蔗糖溶液上漂洗1-5min,取出上层液即为纯化的原生质体溶液。
步骤A3和B1中，蔗糖溶液的质量-体积百分比浓度为35％。
步骤A5中，所述的叶条洗涤液的成分是含有0.03％CaCl2、0.1％NaCl和0.075％MgCl2的35％蔗糖溶液，其中，各种成分的浓度均为质量-体积百分浓度，单位为g/ml。
步骤A6中，所述的13％甘露醇CPW溶液的成分为：10A0mg/L硝酸钾，27.2mg/L碳酸二氢钾，1480.0mg/L二水氯化钙，264.0mg/L 七水硫酸镁，0.16mg/L碘化钾，0.025mg/L五水硫酸铜，13％W/V甘露醇。
步骤B2中，离心的速率为1500rpm，时间为8min。
步骤B3中，离心的速率为1000rpm，时间为8min
步骤B4中，离心的速率为100rpm，时间为1-2min。
步骤B2和B3中，所述的蔗糖溶液的质量-体积百分比浓度为18％。
步骤B5中，离心的速率为500rpm，时间为12min。
步骤B6中，所述的蔗糖溶液的质量-体积百分比浓度为25％。
本发明的积极效果如下：
本发明的油茶原生质体的制备和纯化方法与酶法制备原生质体相比，本发明制备的原生质体不会受酶等化学试剂的伤害，所需时间短，费用低。本发明的油茶原生质体的制备和纯化方法能够为油茶原生质体的培养、融合和基因转化等原生质体下游实验提供大量材料。
附图说明
图1是机械法制备的原生质体的显微镜图。
①原生质体，②杂质。
取一年生的油茶枝条带入室内水培1-2天，能够促使叶片细胞中淀粉转化成可溶性糖，增加细胞对逆境的抵抗力，有利于叶片细胞在质量-体积百分比为35％蔗糖溶液中进行质壁分离的条件下保持细胞的活性。把经过质壁分离的成熟油茶叶片切条后放入洗涤液中 30s-1min，能够除去细胞中大量的果胶、多糖、蛋白质和单宁等物质和叶片碎块；同时洗涤液中含有较高浓度的Na+能够减少细胞壁中果胶和多糖等物质与原生质体的相互作用，Ca2+和Mg2+能够保持原生质膜的稳定性并且能够使果胶等物质聚集，使个得细叶条从洗涤液转移到13％甘露醇CPW溶液中进行质壁分离复员的时候，从叶片的切口处顺利流出原生质体干净得多了。另外一方面，质壁分离后的细叶条分批次地转移到少量的13％甘露醇CPW溶液(2ml)中通过质壁分离复员方法可以收集到6片油茶叶(1.2g左右)的原生质体，这样可以减少细叶条中果胶和多糖等物质的流出，但不影响细胞的流出。所以，用这种方法制备的原生质体溶液中细胞数量多并且形态清晰(图1)，杂质相对较少，有利于原生质体的纯化。
图2是本发明实施例3制备、纯化的原生质体的显微镜图。
①原生质体,②杂质
用13％甘露醇CPW溶液收集到的原生质体溶液(2ml)，体积较大并且还存在杂质多。在纯化过程中，这种溶液经过3次降速离心和2次降低浓度的蔗糖溶液漂浮去掉了大量的杂质，获得了较纯的原生质体。原生质体溶液的体积由纯化前的2ml降低到了200μL，使得在溶液中的原生质体的密度大大地提高了(图2)，密度为3.1×106/ml，杂质少了。纯化后的原生质体的形态完整，细胞膜边缘干净。用这种方法制备的原生质体的数量能够达到5.1×105个/g·FW，因此.用这种方法制备原生质体具有应用价值。
图3是经苔盼蓝染色的原生质体的显微镜图。
①原生质体
用苔盼蓝染色原生质体的的方法：取含质量-体积百分数为18％蔗糖的原生质体溶液1滴，滴在载玻片上。用浓度为0.4％的苔盼蓝溶液染色，使染色的终浓度达到0.04％。染色3-5min。时间不能过长，否则活细胞也会被染色。放在显微镜下观察，染上蓝色的为死细胞，没有染上颜色的为活细胞。图3显示，原生质体没有变蓝色，说明用这种方法制备的原生质体是有活力的。
图4是融合的原生质体的显微镜图。
①2个细胞正在融合的原生质体
用PEG结合高Ca2+-高pH的诱导融合法来融合油茶叶片的原生质体。步骤是：①用胶头滴管取原生质体溶液，滴2滴在一块干净的载玻片上静置8-10min，使原生质体在载玻片上形成一薄层。②将2滴PEG融合液滴在原生质体上，静置10-15min，使原生质体之间粘连在一起。③每隔5min滴2滴高Ca2+-高pH溶液在原生质体上，进行3次共6滴。④盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的溶液，置于显微镜下观察细胞融合情况(图4)。可以观察到2个细胞融合的百分数是11％，说明用这种方法制备的原生质体是有活性的。原生质体经过苔盼蓝染色和细胞融合实验，结果都表明用这种方法制备的原生质体是有活性的，因此，用这种机械法制备的原生质体可以用于细胞培养、融合和转基因等原生质体的下游实验。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
实施例1
本发明的油茶原生质体的制备和纯化方法的具体步骤如下：
1制备方法：
A1从室外切取油茶一年生枝条，带回水培1-2天；
A2取6片成熟叶，用刀片切去叶片的边缘和叶片主脉，并在叶片每隔0.5cm的位置切上一些缝隙，但不要切断叶片；
A3将带有缝隙的叶块浸入蔗糖溶液中进行质壁分离0.5h，期间用镊子将上浮叶块压入蔗糖溶液中；
A4取出叶块，用锋利的刀片与叶块成45°把叶块切成细长条，越细越好；
A5将细叶条转移到盛有叶条洗涤液的容器中，放置30s左右；6片叶可以分3-4批加入到洗涤液中，以材料在溶液中不拥挤为限度；
A6用镊子将每次洗涤过的叶条取出，放入13％甘露醇CPW溶液中，放置5min；3-4批细叶条的原生质体依次收集在同一管溶液中；
A7用镊子去掉叶条，得到油茶原生质体溶液；
2原生质体纯化：
B1在油茶原生质体溶液的底部加入蔗糖溶液，原生质体溶液与蔗糖溶液的体积比是1∶1，漂洗原生质体1min；
B2转移上层原生质体溶液到离心管中，进行离心，去掉上清液；
B3沉淀用等量蔗糖溶液悬浮，再离心，去掉上清液；
B4沉淀用等量蔗糖溶液悬浮，再离心，留下上清液，去掉沉淀；
B5上清液经再次离心，去掉上清液，沉淀用少量的质量-体积百分比 浓度为18％蔗糖溶液悬浮原生质体并转移到离心管中；
B6将原生质体悬浮液加在蔗糖溶液上漂洗1-5min,取出上层液即为纯化的原生质体溶液。
步骤A3和B1中，蔗糖溶液的质量-体积百分比浓度为35％。
步骤A5中，所述的叶条洗涤液的成分是含有0.03％CaCl2、0.1％NaCl和0.075％MgCl2的35％蔗糖溶液，其中，各种成分的浓度均为质量-体积百分比浓度，单位为g/ml。
步骤A6中，所述的13％甘露醇CPW溶液的成分为：10A0mg/L硝酸钾，27.2mg/L碳酸二氢钾，1480.0mg/L二水氯化钙，264.0mg/L七水硫酸镁，0.16mg/L碘化钾，0.025mg/L五水硫酸铜，13％W/V甘露醇。
步骤B2中，离心的速率为1500rpm，时间为8min。
步骤B3中，离心的速率为1000rpm，时间为8min。
步骤B4中，离心的速率为100rpm，时间为1-2min。
步骤B2和B3中，所述的蔗糖溶液的质量-体积百分比浓度为18％。
步骤B5中，离心的速率为500rpm，时间为12min。
步骤B6中，所述的蔗糖溶液的质量-体积百分比浓度为25％。
实施例2
本发明的油茶原生质体的制备和纯化方法的具体步骤如下：
1制备方法：
A1从室外切取油茶一年生枝条，带回水培1-2天；
A2取6片叶，用刀片切去叶片的边缘和叶片主脉，并将叶片每隔1cm的位置切上一些缝隙，但不要切断叶片；
A3将带有缝隙的叶块浸入蔗糖溶液中进行质壁分离1h，期间用镊子将上浮叶块压入蔗糖溶液中；
A4取出叶块，用锋利的刀片与叶块成45o把叶块切成细长条；
A5将细叶条转移到盛有叶条洗涤液的容器中，放置1min；6片叶可以分3-4批加入到洗涤液中，以材料在溶液中不拥挤为限度；
A6用镊子将每次洗涤过的叶条取出，放入13％甘露醇CPW溶液中，放置15min；3-4批细叶条的原生质体依次收集在同一管溶液中；
A7用镊子去掉叶条，得到油茶原生质体溶液；
2原生质体纯化：
B1在油茶原生质体溶液的底部加入蔗糖溶液，原生质体溶液与蔗糖溶液的体积比是1∶1，漂洗原生质体5min；
B2转移上层原生质体溶液到离心管中，进行离心，去掉上清液；
B3沉淀用等量蔗糖溶液悬浮，再离心，去掉上清液；
B4沉淀用等量蔗糖溶液悬浮，再离心，留下上清液，去掉沉淀；
B5上清液经再次离心，去掉上清液，沉淀用少量的质量-体积百分比浓度是18％的蔗糖溶液悬浮原生质体并转移到离心管中；
B6将原生质体悬浮液加在蔗糖溶液上漂洗5min,取出上层液即为纯化的原生质体溶液。
步骤A3和B1中，蔗糖溶液的质量-体积百分比浓度为35％。
步骤A5中，所述的叶条洗涤液的成分是含有0.03％CaCl2、 0.1％NaCl和0.075％MgCl2的35％蔗糖溶液，其中，各种成分的浓度均为质量-体积百分比浓度，单位为g/ml。
步骤A6中，所述的13％甘露醇CPW溶液的成分为：10A0mg/L硝酸钾，27.2mg/L碳酸二氢钾，1480.0mg/L二水氯化钙，264.0mg/L七水硫酸镁，0.16mg/L碘化钾，0.025mg/L五水硫酸铜，13％W/V甘露醇。
步骤B2中，离心的速率为1500rpm，时间为8min。
步骤B3中，离心的速率为1000rpm，时间为8min。
步骤B4中，离心的速率为100rpm，时间为1-2min。
步骤B2和B3中，所述的蔗糖溶液的质量-体积百分比浓度为18％。
步骤B5中，离心的速率为500rpm，时间为12min。
步骤B6中，所述的蔗糖溶液的质量-体积百分比浓度为25％。
实施例3
本发明的油茶原生质体的制备和纯化方法的具体步骤如下：
制备方法；
A从室外切取油茶一年生枝条，带回实验室水培1-2天，B取6片叶，用刀片切去叶片的边缘和叶片主脉，并将叶片每隔0.5-1CM的位置切上一些缝隙，但不要切断叶片。
3.将带有缝隙的叶块浸入35％蔗糖溶液中进行质壁分离0.5-1h左右，期间用镊子将上浮叶块压入蔗糖溶液中。
4.取出叶块放在载玻片上，用锋利的刀片与叶块成45°把叶块切成 0.5mm宽的长条，越细越好。
5.将细叶条转移到盛有3ml叶条洗涤液的试管中，放置30s-1min左右。6片叶可以分3-4批加入到洗涤液中，以材料在溶液中不拥挤为限度。
6.用镊子将每次洗涤过的叶条取出，放入2ml的13％甘露醇CPW溶液中，放置10min左右。3-4批细叶条的原生质体依次收集在同一管溶液中；
7.用镊子去掉叶条，得到油茶原生质体溶液。
原生质体纯化方法：
A用移液枪在油茶原生质体溶液的试管底部放入2ml 35％蔗糖溶液，漂洗原生质体3min左右。
B转移上层原生质体溶液到离心管中，1500rpm离心8min，去掉上清液。
3.沉淀用2ml 18％蔗糖溶液悬浮，1000rpm离心8min，去掉上清液。
4.沉淀用2ml 18％蔗糖溶液悬浮，100rpm离心1-2min，留下上清液，去掉沉淀。
5.上清液经500rpm离心12min，去掉上清液，沉淀用200μL质量-体积百分比浓度为18％蔗糖溶液悬浮原生质体并转移到A5ml的离心管中。
6.将原生质体悬浮液加在质量-体积百分比浓度为25％蔗糖溶液上漂洗3min左右,取出上清液即为纯化的原生质体溶液。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。