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1、(10)申请公布号 CN 102757931 A (43)申请公布日 2012.10.31 CN 102757931 A *CN102757931A* (21)申请号 201210165419.3 (22)申请日 2012.05.25 C12N 5/07(2010.01) C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) (71)申请人 南京大学 地址 210061 江苏省南京市浦口区学府路 12 号 (72)发明人 储丹丹 陈炯 (54) 发明名称 果蝇视网膜发育模型的体外培养系统及其应 用 (57) 摘要 本发明公开一种果蝇视网膜发育模型体外培 养构建方法， 包括。
2、 ： 果蝇细胞培养液配方和制备， 透气性可视培养平台的搭建和制片方法， 使用激 光共聚焦显微镜进行追踪观测视网膜细胞的发 育， 重塑， 分裂和分化等步骤。本发明的系统设计 合理， 操作简便快捷， 可以在体外环境中培养果蝇 幼虫的视网膜长达 3 小时， 便于实时追踪观察视 网膜的早期发育过程， 为研究视网膜发育的细胞 和分子机制， 筛选视网膜发育相关基因及其致病 机理， 药物筛选的毒理学评价， 以及在眼睛疾病模 型中筛选相关药物提供了有利工具。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页。
3、 说明书 4 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种果蝇视网膜发育模型体外培养的构建方法， 其特征包括以下步骤 ： (1) 配制用于果蝇视网膜体外培养的器官培养液 ； (2) 在上述培养液中分离获得果蝇视网膜， 将其置于透气性的可视容器中， 室温培养 ； (3) 使用激光共聚焦显微镜追踪记录视网膜细胞的发育过程。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 器官培养液由体积百分含量的以下组 分构成 ： 89昆虫细胞培养基 (Schneider s Drosophila medium)、 10热灭活胎牛血清 (heat-inactivated feral bovine serum)。
4、、 1青霉素 - 链霉素混合溶液 (penicillin/ streptomycin)， 外加 0.2mg/ml 胰岛素 (insulin)。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述的果蝇视网膜为具有荧光标记的果 蝇三龄晚期幼虫的眼盘 (eye disc)。 4. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 将果蝇视网膜浸透在器官培养液中， 置于 由透气性底膜 (Lumox dish)， 聚三氟氯乙烯 (Halocarbon 700oil) 和盖玻片组成的透气性 可视容器中间的液体腔内 ； 液体腔厚度为 0.3-0.6 毫米。 5. 根根权利要求 1 所述的方法， 其特征在。
5、于， 运用激光共聚焦显微镜检测视网膜发育 过程的时间为视网膜放入透气性可视容器液体腔后 5 分钟至三小时 ； 激光扫描间隔时间为 10 分钟至 3 小时， 且每次扫描前需要调整焦距至图像清晰。 6. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 运用激光共聚焦显微镜检测视网膜发育 过程时， 激光强度设定为 0.1 -10， 选取物镜为 60 倍或 100 倍放大。 7. 根据权利要求 1 至 6 任一权利要求所述的果蝇视网膜发育模型体外培养方法， 其特 征在于， 使用该模型筛选视网膜早期发育相关基因的方法是 ： 分离待筛选的基因突变果蝇 的视网膜， 以野生型果蝇作为对照， 其余培养条件完全相同。
6、， 培养适当时间后， 使用激光共 聚焦显微镜观察基因突变果蝇的视网膜发育进程的变化 ； 若有可分辨的发育缺陷产生， 则 视待筛选基因为视网膜早期发育相关基因。 8. 根据权利要求 1 至 7 任一权利要求所述的果蝇视网膜发育模型体外培养方法， 其特 征在于， 使用此模型进行药物毒理学评价的方法是 ： 器官培养液中加入待筛选药物， 以加入 等量的空白溶剂作为对照， 其余培养条件完全相同， 培养适当时间后， 使用激光共聚焦显微 镜观察待筛选药物对视网膜发育进程的影响 ； 若有可分辨的发育缺陷产生， 则视待筛选药 物为视网膜发育毒性药物。 权 利 要 求 书 CN 102757931 A 2 1/4。
7、 页 3 果蝇视网膜发育模型的体外培养系统及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种果蝇视网膜发育模型的体外培养系统， 及其在视网膜发育相关基因和药物筛选中的应用。 背景技术 0002 果蝇由于其饲养方法简单低廉， 繁殖迅速且大量， 基因组精简清晰便于研究， 遗传 手段较多且操作简便等优点， 被科学界公认为一种优良的模式生物。自从 20 世纪初， 摩尔 根利用果蝇证实了孟德尔定律， 提出了遗传学第三定律 -“连锁与交换定律” 并因此获得 1933 年诺贝尔医学和生理学奖之后， 基于果蝇的研究逐步揭示了胚胎发生和器官发育的分 子调控机理。 经大批科学家长时间的研究成果证。
8、实， 果蝇中发现的大多数发育机理， 在哺乳 动物 ( 包括人类 ) 中有高度的保守性。 0003 果蝇的复眼尽管和人眼在形态上有很大的差别， 但它们都是由晶状体， 色素层 ( 巩膜 ) 和视网膜这三种基本的成像结构组成。任何一部分结构的发育异常都是致盲的。 视网膜发育相关的重要基因和信号通路， 大多在果蝇中最先发现。比如著名的 Wnt 信号通 路， 它几乎调控眼睛发育所有步骤 ( 包括胚胎期眼睛区域决定， 眼睛形态发生， 细胞增殖分 化和凋亡， 视网膜神经形成和生长等等 )， 就是最先在果蝇中发现的。随后在果蝇中的相关 研究帮助科学家们理解了哺乳动物中的 Wnt 通路， 而果蝇中的这些成果也因。
9、此获得了 1995 年诺贝尔医学和生理学奖。随后的大量研究表明， 这些重要基因和信号通路在人类中同 样影响包括眼睛在内的多种器官发育 ； 而相关基因的异常调控和表达， 会造成各种器官发 育异常， 甚至导致肿瘤生成和转移。如今， 果蝇视网膜已经发展为一种理想的人类眼部疾 病模型， 应用于研究常染色体显性遗传视网膜色素变性 (Autosomal Dominant Retinitis Pigmentosa) 这类遗传性眼部疾病， 以及亨廷顿氏舞蹈症 (Huntington s Disease)， 帕金 森病 (Parkinson s disease) 和阿尔茨海默病 (Alzheimer s Dis。
10、ease) 等神经退化性疾 病引发的视觉功能退化。 因此， 探索果蝇视网膜早期发育的过程， 对于揭示人类眼睛等器官 发育的细胞和分子机理， 阐释各种眼部疾病的发病机理， 以及药物筛选和毒理学评价等领 域都有十分重要的意义。 0004 目前对果蝇视网膜早期发育过程的理解， 还停留在上世纪 90 年代初期。Wolff， Ready， Cagan 等科学家通过对果蝇视网膜固定片的观察， 推测了视网膜每隔两小时的发育 进程， 提出了关于视网膜形态发育 (Morphogenesis) 方式的一些假说。然而， 由于早期视网 膜发育过程无法在体内进行观察， 也缺少有效的体外培养方法， 所以其两小时内的实时发。
11、 育细节至今还没有能够弄清， 关于视网膜形态发育过程的假说也依然只是猜测。 发明内容 0005 本发明的第一个目的是建立一种能够实时追踪记录果蝇视网膜早期发育模型的 体外培养系统， 具体技术方案包括以下步骤 ： 0006 1. 配制用于果蝇视网膜体外培养的器官培养液， 器官培养液由体积百分含量的以 说 明 书 CN 102757931 A 3 2/4 页 4 下组分构成 ： 89昆虫细胞培养基(Schneider s Drosophila medium)、 10热灭活胎牛血 清(heat-inactivated feral bovine serum)、 1青霉素-链霉素混合溶液(penicil。
12、lin/ streptomycin)， 0.2mg/ml 胰岛素 (insulin)。 0007 2. 室温条件下， 在器官培养液中解剖分离出含有荧光标记 ( 如 E-cadherin-GFP) 的果蝇三龄后期幼虫视网膜， 将其取出并完全浸透于透气底膜 (Lumox dish， Sigma) 上的 新鲜培养液中， 加盖四周涂有聚三氟氯乙烯 (Halocarbon 700oil) 的盖玻片 (18X18mm)， 使视网膜稳固封闭于 “透气底膜 - 盖玻片 - 聚三氟氯乙烯 - 器官培养液” 所构成的厚度约 0.3-0.6mm 的液体腔内。 0008 3.运用激光共聚焦显微镜实时监测视网膜发育进程。
13、。 选取物镜为60倍或100倍， 激光强度设定为 0.1 -10， 每隔 10 分钟 ( 或其他大于 10 分钟且小于 3 小时的间隔时 间 ) 调整焦距至图像清晰， 扫描采集并分析视网膜形态发育过程。 0009 本发明的第二个目的是提供一种快速筛选与视网膜早期发育相关基因的方法， 具 体技术方案如下 ： 0010 1. 将含有某突变基因 (a-) 的果蝇与含有荧光标记基因 ( 如 E-cadherin-GFP) 的 果蝇交配， 整合出如下基因型的果蝇 ： E-cadherin-GFP ； a-。 0011 2. 分离出基因型为 E-cadherin-GFP ； a-的果蝇的视网膜， 将其稳固。
14、封闭于 “透气 底膜 - 盖玻片 - 聚三氟氯乙烯 - 器官培养液” 构成的液体腔内， 以激光共聚焦显微镜检测其 视网膜发育进程。 0012 3. 比较 E-cadherin-GFP ； a-果蝇的视网膜和野生型果蝇视网膜发育进程的差异 ； 若有可分辨的发育缺陷产生， 则待筛选基因为视网膜发育相关基因。 0013 本发明的第三个目的是提供一种快速实际的药物毒理学评价方法， 具体技术方案 如下 ： 0014 1. 在器官培养液中添加合适浓度的待筛选药物， 另以一份加入等量空白溶剂的器 官培养液作为对照。 0015 2.分离出含有荧光标记(如E-cadherin-GFP)的果蝇视网膜， 将其稳固封。
15、闭于 “透 气底膜 - 盖玻片 - 聚三氟氯乙烯 - 含待筛选药物的器官培养液” 构成的液体腔内， 以激光共 聚焦显微镜检测其视网膜发育进程。 0016 3. 比较药物处理的视网膜和空白对照组视网膜发育进程的差异 ； 若有可分辨的 发育缺陷产生， 则待筛选药物为视网膜发育毒性药物。 0017 本发明的有益效果 ： 0018 1. 本发明建立了一种果蝇视网膜早期发育的体外培养系统， 能够将观测视网膜发 育进程的时间间隔缩短至 10 分钟， 将 90 年代早期技术的观测精细度提高了 12 倍， 因而能 够实现追踪单个视网膜细胞的运动轨迹， 揭示整个视网膜早期形态发育的过程。 0019 2. 果蝇视。
16、网膜是体内器官， 与一般的体外培养细胞相比， 其发育进展更迅速且切 合器官的实际发育状态 ； 与哺乳动物复杂庞大的器官相比， 果蝇视网膜仅含两层细胞， 不需 要切片即可直接用激光共聚焦显微镜观察。所以果蝇视网膜的体外培养兼有细胞培养 ( 利 于观测 ) 和器官培养 ( 切合事实 ) 的双重优点， 非常适合作为视网膜发育的模型应用。 0020 3. 在应用于药物毒理学评价和基因筛选时， 由于果蝇视网膜体外培养时间小于 3 小时， 而传统的细胞培养筛选方法需要至少 1 天以上， 实验动物筛选方法则需要更长周期， 说 明 书 CN 102757931 A 4 3/4 页 5 因此本发明可以更加快速地。
17、对视网膜早期发育相关药物和基因进行初步筛选， 并且筛选结 果更加贴合实际情况。 附图说明 0021 图 1 ： 用于果蝇视网膜发育模型体外培养的透气性可视平台的组成和构建。图中 所示 1 为 Lumox dish 的透气底膜 ； 2， 器官培养液 ； 3， 视网膜样品 ； 4， 18X18mm 盖玻片 ； 5， 聚 三氟氯乙烯均匀涂在距盖玻片四周约 2-3mm 位置。将盖玻片涂有聚三氟氯乙烯的一面向 下， 稳固封闭住内侧的器官培养液和视网膜样品。 0022 图 2 ： 应用体外培养系统实时追踪包含 Armadillo-GFP 荧光标记的果蝇视网膜发 育进程。上排实物图为激光共聚焦显微镜实时扫描。
18、， 虚线框标志出一个单眼的细胞簇。下 排是对上方实物图中细胞边界的手工绘制， 其中 2， 3， 4， 5， 8 代表视网膜发育过程中最先产 生的 5 个视神经细胞， M1， M2 代表非视神经细胞。 0023 图3 ： 应用视网膜发育模型的体外培养筛选出与早期发育相关的基因flr。 上排实 物图为激光共聚焦显微镜实时扫描， 虚线框标志出一个单眼的细胞簇。下排是对上方实物 图中细胞边界的手工绘制， 与野生型果蝇 ( 图 2) 发育相比， 视神经细胞 3 和 4 不能正常接 触以形成新的细胞连接， 从而影响视网膜形态发育 ； M 代表非视神经细胞。 0024 图 4 ： 破坏肌动蛋白微丝稳定性的一。
19、种药物 jasplakinolide 导致视神经细胞簇表 面积增大， 破坏其稳固的簇间结构， 造成视网膜发育缺陷。A， 二甲基亚砜 DMSO 处理作为空 白对照 ； B， jasplakinolide 实验组。 具体实施方式 0025 实施例 1 ： 果蝇视网膜发育模型的体外培养系统的构建和发育进程的实时追踪 0026 1 器官培养液的配制 0027 将50ml fetal bovine serum(FBS， SH30396.03 ； Hyclone)56灭活处理30min， 冷 却至室温后， 将其加入500ml Schneider s Drosophila medium(11720-034 。
20、； Invitrogen) ； 再添加 5mlpenicillin/streptomycin(15140-122 ； Invitrogen)， 混合均匀， 过滤灭菌后 分装保存于 4 度。使用前， 取出适量培养液， 放置至室温， 加入 0.2mg/ml insulin(15500 ； Sigma)， 混合均匀备用。 0028 2 透气性可视平台的搭建 0029 取 18mmX18mm 盖玻片， 在其一面距四边 2-3mm 处均匀涂抹 10l 聚三氟氯乙烯 (Halocarbon 700oil， H8898， Sigma)。在透气底膜 (Lumox dish， Sigma) 上滴加 6l 器官 。
21、培养液， 将新鲜分离出的含 Armadillo-GFP 荧光标记的果蝇三龄后期幼虫视网膜完全浸透 其中， 调整平整。 将盖玻片涂有聚三氟氯乙烯的一面朝下， 轻轻将视网膜封闭在盖玻片中心 位置 ( 见图 1)。 0030 3 视网膜形态发育的追踪 0031 使用奥林巴斯 FV1000 激光共聚焦显微镜， 物镜 60 倍， 数值孔径 1.42， 数码放大 2 倍， 分辨率800X800， 488nm激发光， 激光强度5。 调整焦距至视网膜发育的开始部位 “形态 发生沟” ， 取信号最清晰的位置， 沿 Z 轴每 0.4m 采集一次， 共采集 5 次， 叠加成所需图像。 在三小时内， 每隔十分钟， 重。
22、新调整焦距， 重复以上的图像采集步骤。标志出一个单眼中视 说 明 书 CN 102757931 A 5 4/4 页 6 神经细胞的位置， 观测发育过程中细胞形态和位置变化。从图 2 可见， 野生型视网膜的单眼 中所有细胞 ( 虚线标出 ) 从最初的圆形簇演变成 3 小时后的长形簇。特别的， 原本位于 M 细胞两侧的视神经细胞 3 和 4， 随着时间的推移， 从分离到接触 (120 分钟， 圆点 )， 并最终形 成新的相互连接 (180 分钟， 浅色的细胞边界 )。这种形态变化在视网膜发育过程中十分保 守， 可以作为视网膜发育模型使用。 0032 实施例 2 ： 应用果蝇视网膜发育模型筛选与视网。
23、膜早期发育相关基因 0033 1. 将 含 有 突 变 基 因 的 果 蝇 ( 如 flrEY-P2) 和 含 有 荧 光 标 记 基 因 ( 如 E-cadherin-GFP) 的果蝇交配， 通过遗传学方法构建得到基因型为 E-cadherin-GFP ； flrEY-P2的果蝇。 0034 2.在器官培养液中分离出上述果蝇的视网膜。 按照实施例1中所述的方法搭建透 气性可视平台并追踪分析视网膜发育过程。 由图3可见， 突变体视网膜的单眼(虚线标出) 不能顺利从圆形簇发育成长形簇。 视神经细胞3和4相对于M细胞的位置也难以发生改变， 以至于不能形成新的细胞连接， 这将直接导致后期视网膜发育缺。
24、陷。因此， 该基因 (flr) 被 确定为视网膜早期发育必需基因。 0035 实施例 3 ： 应用果蝇视网膜发育模型进行快速的药物毒理学评价 0036 1. 在器官培养液中添加终浓度 10M 的待筛选药物 如破坏肌动蛋白微丝稳定 性的药物 jasplakinolide(Jasp)， J7473， Invitrogen， 另以一份加入等量溶剂二甲基亚砜 (DMSO) 的器官培养液作为对照。 0037 2. 在器官培养液中分离出含有荧光标记 ( 如 E-cadherin-GFP) 的果蝇视网膜， 按 照实施例 1 所述方法将其稳固封闭于 “透气底膜 - 盖玻片 - 聚三氟氯乙烯 - 含 Jasp 。
25、或二甲 基亚砜的器官培养液” 构成的液体腔内， 以激光共聚焦显微镜检测其视网膜发育进程。 0038 3. 比较 DMSO 对照组和 Jasp 药物处理后视网膜发育可以发现， 处理 10 分钟后， DMSO 对照组的视神经细胞依然相互紧密结合成一个圆形的细胞簇， 而 Jasp 处理后的视神 经细胞簇结构松散， 表面积增大(见图4)。 据此可以对此药物做出以下的毒理学评价 ： Jasp 降低视神经细胞簇的表面张力， 破坏视神经细胞簇的固有形态和结构， 从而造成视网膜发 育缺陷。 说 明 书 CN 102757931 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102757931 A 7 2/2 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102757931 A 8 。