技术领域
本发明属于多肽筛选技术领域，具体涉及一种杂合抗菌肽及其应用。
背景技术
抗菌肽(antibacterialpeptides)是生物体产生的一种具有强抗菌作用的 多肽，是生物先天免疫的重要组成成分。迄今为止，已在许多生物包括动 物、植物及原核生物中发现600多种内源性抗菌活性肽。猪源抗菌肽PR-39 (GenBank登录号：NM_214450.1)由39个氨基酸组成，是AgerberthB等于 1991年首先从猪肠道分离得到的。其富含精氨酸(Arg)和脯氨酸(Pro) 两种氨基酸残基，形成一种Pro-Arg-Pro结构，可能与细菌磷脂膜相互作用 有关。其N端26个氨基酸的合成肽相对抗菌肽PR-39本身来说对多种革兰氏 阴性菌、阳性菌的抑制作用更强。抗菌肽cecropinP1是从猪小肠分离出得到 的，其含有31个氨基酸残基，分子量是3339Da，不含半胱氨酸，不能形成 分子内二硫键，有强碱性的N端和强疏水性的C端，其中酰胺化的C端对其 广谱抗菌作用极为重要。cecropinP1氨基酸序列与昆虫cecropinA有64％相 似性，与cecropinB有75％的相似性。对其二级结构的理论预测及CD谱和二 维核磁共振数据表明，其分子内含有两亲水性α-螺旋和疏水性α-螺旋， 中间是形成柔性弯曲的谷氨酸-甘氨酸(Glu-Gly)卷曲序列。研究表明，其 螺旋-卷曲-螺旋结构对保持高抗菌活性具有特殊的重要性。
天然的抗菌肽在临床应用存在各种缺点，有的在对病原微生物高杀灭活 性的同时往往伴随着溶血作用，有的本身就对真核细胞有毒性(例如天然 抗菌肽蛙皮素、防御素和蜂毒素等)。随着对抗菌肽结构功能与杀菌机理研 究的深入，人们开始尝试设计杀菌活力更强、抗菌谱更广的新型杂合抗菌 肽。杂合抗菌肽设计通常采用的方法是将不同来源抗菌肽保守序列拼接， 而后通过氨基酸替换等生物学修饰，以期抗菌活性高且溶血性低的新型抗 菌肽。目前，国内外已设计合成了许多种杂合肽，抑菌效果明显优于天然 肽，且大大降低了毒性和溶血性。总之，杂合肽的成功设计和应用对解决 当前抗菌肽存在的问题有着重要意义和实用价值
发明内容
本发明的目的是提供一种杂合抗菌肽CE-PR，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种杂合抗菌肽CE-PR，其编码蛋白的氨基酸序列为 SEQIDNO:1；
本发明的杂合抗菌肽CE-PR可用做畜禽饲料添加剂或畜禽疾病的预防 和治疗制剂。
本发明还提供一种杂合抗菌肽CE-PR的重组毕赤酵母的制备方法，其制 备步骤如下：
1)根据杂合抗菌肽CE-PR的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子， 合成抗菌肽基因序列，连入重组酵母表达载体中，构建成表达重组质粒；
2)将构建的表达重组质粒电转化宿主酵母菌，构建能表达杂合抗菌肽 CE-PR的重组基因工程酵母菌；用该重组基因工程菌高密度发酵表达出杂合 抗菌肽CE-PR；
3)对重组表达的杂合抗菌肽CE-PR进一步浓缩、纯化后，测定效价。 稀释分装，即为抗菌肽制剂。
本发明在对猪源抗菌肽PR-39与cecropinP1的氨基酸序列进行空间结构 分析的基础上，将抗菌肽cecropinP1的N端19个氨基酸与抗菌肽PR-39的N端 26个氨基酸进行拼接，中间加入蛋白Lingker(GPG)，并对抗菌肽cecropinP1 的N端中的1处氨基酸进行突变(K12N)，获得一种新型杂合抗菌肽CE-PR， 使其抗菌效力获得显著提高。
具体实施方式
下面结合具体实施方式来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该 理解的是，在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案 的细节和形式进行修改或替换，这些修改和替换均落入本发明保护范围内。
实施例1杂合抗菌肽CE-PR及其基因的获得
1、利用生物软件对猪源抗菌肽cecropinP1(GenBank登录号： AB186032)和抗菌肽PR-39(GenBank登录号：NM_214450.1)的氨基酸序 列进行空间结构分析，选取抗菌肽cecropinP1的N端具有α-螺旋结构的19个 氨基酸为基础，并将其第12位疏水性氨基酸替换成亲水性氨基酸赖氨酸 (K12N)，然后将其与抗菌肽PR-39抑菌活性较强的N端26个氨基酸进行拼 接，中间加入蛋白Lingker(GPG)，获得一种新型杂合抗菌肽CE-PR，其氨 基酸序列为SEQIDNO:1。
2、根据获得的新型杂合抗菌肽CE-PR的氨基酸序列SEQIDNO:1，按 照毕赤酵母基因密码子偏好性进行重新设计，获得编码新型杂合抗菌肽 CE-PR的核苷酸序列。并在其N端引入Kex2酶切位点。两端引入XhoI和 XbaI酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中。
实施例2基因工程杂合抗菌肽CE-PR表达载体的构建与工程菌的获得
1、将含抗菌肽基因的载体和酵母表达载体均用XhoI和XbaI双酶切， 酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定、测序。
2、阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中。 电转化后均匀涂布于含100μg/mLZeocin的YPDS选择平板上，30℃孵育3 -5天。待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含 Zeocin200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度 Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株。
3、将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100μg/mLZeocin的YPD培 养液中，28℃振摇培养18个小时。取此菌液按4％体积比转接于5mlBMGY 培养基中，28℃摇振培养18-24h左右，OD600值约为5-6。培养物直接转 接于25mlBMMY培养基中，28℃继续摇振培养。为了维持诱导表达，每 隔24h补加100％甲醇使终浓度达1％。48h后，4℃5000r/min离心10min， 收集上清，进行抑菌活性测定。能产生抑菌活性的重组酵母菌株即为能产 生新型杂合抗菌肽CE-PR的阳性菌株。
实施例3发酵、纯化新型杂合抗菌肽CE-PR的制备
1、发酵工艺
1)将筛选得到的阳性重组子活化后按1％-10％接种量接种于三角瓶， 28-30℃，200r/min摇床培养16-24h后以5％-20％接种量接入10L发酵罐(实 装培养基6L)，温度28-30℃，转速500-1500r/min，培养基pH值5.0-6.0， 通气量0.1-1.0VVM(1L发酵液1min通入的氧气量)，溶氧>20％情况下进 行发酵，在培养18-24h后流加50％甘油4h，待溶氧突然升至100％时流加 甲醇至发酵结束，整个发酵持续48-72h。
2)发酵结束后原罐蒸汽100℃灭菌10-20min，放料，5000r/min离心 10min，收集发酵上清即为抗菌肽半成品。
3)新型抗菌肽制剂
抗菌肽半成品经微滤、超滤、喷雾干燥、冻干等生产的粉剂和以生化 方法精制、纯化后得到液体制剂。
上述基因工程抗菌肽可做成畜禽饲料添加剂或畜禽疾病的预防和治疗 制剂。
实施例4新型杂合抗菌肽CE-PR的最小抑菌浓度测定(MIC)
1、试验菌株
金黄色葡萄球菌(CowanI)、猪金黄色葡萄球菌肠毒素75-1、大肠杆菌 K12D31、猪大肠杆菌O78、猪大肠杆菌O157-H71和猪副伤寒沙门氏菌C782
2、菌株处理：将菌种复苏，在固体LB培养基中划线，在培养箱中37℃ 过夜培养。将过夜培养的细菌挑单菌落于含有25ml液体MHB培养基的三 角瓶中，将三角瓶放于摇床37℃培养12-18h。将培养后的菌液在OD600的 条件下测其吸光度值，用MHB培养基调节菌液浓度，使其处于0.6-0.8之 间。之后将菌液稀释成浓度为5×105CFU/mL，依次取90μl加入到96孔板 的各孔内。
3、抗菌肽定量后用MHB培养基依次做倍比稀释。将稀释好的抗菌肽 各取10μl依次加入到96孔板的各个孔中，此时每个孔的反应体系为100μ l。96孔板盖盖后，37℃振荡培养24h后，观察并用酶标仪在600nm处 测量并记录实验结果。抗菌肽样品经过二倍稀释后，成一系列浓度，以抑 制细菌生长的最小浓度来定义最小抑菌浓度(MIC)。利用菌液和MHB培 养基分别用来做阴性和阳性对照，各自代表抑菌率为0和100％。同时分别 设立猪源抗菌肽PR-39与cecropinP1标准品试验组作为对照，用于观察抗 菌肽改造前后的抑菌活性变化。
4、用微量稀释法测定重组新型杂合抗菌肽CE-PR对多种细菌的最低抑 菌浓度，结果表明新型杂合抗菌肽CE-PR与猪源抗菌肽PR-39、cecropinP1 标准品相比，其大大增加抗菌肽对革兰氏阴性菌和阳性菌的抑菌能力，更 具市场应用价值。
表1：抗菌肽对多种细菌的最低抑菌浓度
实施例5新型杂合抗菌肽CE-PR的最低溶血浓度测定(MHC)
抗菌肽对血红细胞的溶血活性是衡量其对真核细胞毒性的最主要方 法。本试验目的即是验证新型杂合抗菌肽CE-PR是否具有细胞毒性。
1、将重悬于PBS中的8％猪红细胞100μl加入96孔板中，再加入PBS 系列稀释的抗菌肽100μl，使各孔中抗菌肽的浓度分别为100μg/mL、 50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.12μg/mL、1.56μg/mL和 0.78μg/mL。阳性对照孔加入100μl0.2％TritonX-100，阴性对照孔加100μl PBS，37℃孵育1h后，3000rpm离心5min后，从各孔吸取100μl上清到 另一96孔板中，550nm波长测定OD值，计算溶血百分比＝[(实验孔OD 值-阴性孔OD值)/(阳性孔OD值-阴性孔OD值)]×100。同时设立猪源抗菌 肽PR-39与cecropinP1标准品作为对照。
2、结果表明：新型杂合抗菌肽CE-PR与猪源抗菌肽PR-39与cecropinP1 标准品一样，对猪红细胞基本无溶血活性，是一种安全的抗菌肽。
将本发明的抗菌肽人工合成进行检测，效果与重组表达的重组多肽保持 一致。上述的结果表明本发明所获得的新型杂合抗菌肽CE-PR具有更好的效 果，能够用于商业开发。