技术领域
本发明涉及遗传物质的提取领域。具体地说，本发明涉及用于游离DNA提取的试剂盒及其应用。
背景技术
游离DNA又称循环DNA(circulating nucleic acid)，是指循环血中游离于细胞外的内源性DNA，可以单链或双链DNA的形式存在，大多数游离DNA是以核蛋白形式存在的双链DNA。游离DNA片段较小，长度一般在几十到几百个bp之间。近些年的研究发现，人循环血中游离DNA含有非常重要的遗传信息，利用游离DNA高通量测序技术可以有效的进行产前筛查和肿瘤等疾病的相关检测，比如唐氏综合症孕中期筛查，传统方法一般需要取羊水进行检测，存在一定的流产风险，而使用游离DNA高通量测序技术，不仅准确率更高，而且仅需采集孕妇静脉血就可以直接进行检测，实现了无创性产前筛查，意义重大。
利用游离DNA进行的产前筛查或肿瘤检测，首先要进行游离DNA的提取纯化，这一步是最为重要，也是最基本的步骤，提取产物的质量直接影响到后续检测结果的准确性和可靠性。由于游离DNA片段较小，在血浆中含量低，因此，游离DNA的提取试剂与普通的核酸提取试剂相比，需要有更高的提取效率，如果要满足大规模的筛查检测需要，游离DNA提取试剂还需要满足操作简单、成本低、能够实现自动化等要求。
目前用于血浆游离DNA提取纯化的方法主要有酚氯仿法、柱提取法和磁珠法，其中酚氯仿法需要在核酸提取过程中使用对人体有害的有机溶剂，越来越难以被检验人员接受，而且该方法操作复杂，对于游离DNA来说提取效率较低，需要加大样本量来满足后续检测需求，同时在提取过程中需要进行高速离心操作，难以实现自动化。柱提取法是目前主要使用的方法，该方法不需要使用毒性较大的有机溶剂，操作方法较酚氯仿法稍简单，但操作过程中仍然需要进行高速离心，同时提取效率较低，需要加大样本量来满足后续检测的需求，难以实现自动化。磁珠法近几年才开始应用于DNA的提取，该方法最大的特点是提取过程不需要进行高速离心，容 易实现自动化。
然而，以上这些产品很少是针对血浆游离DNA的特性而专门为游离DNA设计开发的。这些产品不仅提取效率不高，而且操作步骤繁琐，大部分需要进行多次洗涤(3-4次)。更重要的是，现有的DNA提取产品中的洗涤液均含有高浓度的醇，而高浓度的醇对后续的PCR反应有抑制作用。此外，作为挥发性溶剂，醇对自动化仪器有不利影响，并且具备易燃性，从而带来安全隐患。因此，采用现有的DNA提取产品，需要在提取后放置较长时间，让醇完全挥发后才能进行后续测试，否则会直接影响后续测试结果。
目前无论是采用哪种提取方法，在实际应用中，主要还是以手工柱提取游离DNA为主，该方法手工操作不仅工作量大，而且提取效果容易受人为因素影响，无法满足大规模，高通量、高质量的检测需求。提取DNA的自动化系统虽然也可用于游离DNA的提取，但是设备都比较大，运行成本高，且没有完全配套的游离DNA提取试剂盒，提取效率较低，达不到理想的效果。
自动核酸提取平台目前市场上已有不少，如：Roche、Chiron、Abbott、Gen-probe、Biomerieux等公司研发的分子诊断产品都有相关的全自动核酸提取平台。但这些平台都主要以提取病毒、基因组或其它长片段核酸为主，并未针对短片段的游离DNA进行过优化，也少有配套使用的专门的游离DNA提取试剂盒。这些平台也存在体积较大，构造复杂，设备价格高，每次运行的成本高等缺点，无法满足现有用户对自动化处理游离DNA的需求。
因此，本领域急需可以应用于游离DNA提取的试剂盒以及配套使用该试剂盒的提取系统，这些试剂盒应该具备操作简单、快捷、安全，结果准确以及成本合理等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种游离DNA提取试剂盒以及配套使用该试剂盒的提取系统，从而能简单、快捷、安全、准确地检测游离DNA，尤其是血浆游离DNA。
在第一方面，本发明提供一种游离DNA提取试剂盒，所述试剂盒包含多个容器，所述容器中装有裂解液、洗涤液A、洗涤液B、去抑制剂、磁珠和洗脱液，其中，洗涤液B中醇浓度低于1％。
在具体的实施方式中，所述洗涤液B中不含醇、不含表面活性剂。
在具体的实施方式中，所述洗涤液B的pH值为4-6。
在具体的实施方式中，所述洗涤液B为0.01～1mol/L，pH为4～6的Tris-HCL缓冲液或Tris-乙酸、柠檬酸缓冲液。
在具体的实施方式中，所述游离DNA是血浆游离DNA。
在优选的实施方式中，所述裂解液主要包含异硫氰酸胍、柠檬酸钠、表面活性剂(包括但不限于NP40、Triton 100、Tween 20)、异丙醇。
在优选的实施方式中，所述洗涤液A包含异硫氰酸胍、表面活性剂(包括但不限于NP40、Triton 100、Tween 20)、乙醇。
在优选的实施方式中，所述去抑制剂为蛋白酶K。
在优选的实施方式中，所述磁珠为表面烷基化的磁性颗粒。
在优选的实施方式中，所述洗脱液包含pH值8.0～10的Tris-HCL缓冲液(或Tris-乙酸、柠檬酸缓冲液)。
在第二方面，本发明提供一种提取游离DNA的方法，包括利用本发明第一方面所述的游离DNA提取试剂盒提取样品中的游离DNA。
在具体的实施方式中，所述样品是血浆，和所述游离DNA是血浆游离DNA。
在第三方面，本发明提供一种游离DNA提取系统，所述系统包含或整合了本发明第一方面所述的游离DNA提取试剂盒。
在优选的实施方式中，所述游离DNA是血浆游离DNA。
在第四方面，本发明提供一种用于游离DNA提取的洗涤液B，所述洗涤液B中醇浓度低于1％；优选地，所述洗涤液B不含醇、不含表面活性剂。
在优选的实施方式中，所述洗涤液B的pH值为4-6。
在第五方面，本发明提供本发明第四方面所述的洗涤液B在制备游离DNA提取试剂盒中的用途。
在优选的实施方式中，所述游离DNA是血浆游离DNA。
在优选的实施方式中，所述洗涤液B为0.01～1mol/L，pH为4～6的Tris-HCL缓冲液或Tris-乙酸、柠檬酸缓冲液。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1是本发明的游离DNA提取系统的平面示意图。
具体实施方式
为有效保证核酸在洗涤过程中不损失，现有的DNA提取产品中的洗涤液均含有60～80％的高浓度的醇。但高浓度的醇具有抑制后续PCR反应、不利于自动化仪器、易燃等缺陷，从而造成安全隐患以及整个提取流程的操作繁琐、费时等缺点。
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现利用醇浓度较低的缓冲液进行洗涤同样可以获得良好的洗涤效果而不会造成核酸损失，同时该缓冲液中的醇浓度可以非常低，甚至完全不含醇且不含表面活性剂。在此发现的基础上，本发明提供一种可用于游离DNA提取的试剂盒，该试剂盒所采用的洗涤液不含醇类等挥发性溶剂，从而不会影响后续的PCR反应，并且使用安全、简便、成本低廉；而配套该游离DNA提取试剂盒的全自动游离DNA提取系统不仅实现了游离DNA提取的全自动化，而且提取效率要比现有技术中主要的提取试剂盒的提取效率高1倍左右，并且具有非常好的防污染功能。在此基础上完成了本发明。
本发明的游离DNA提取试剂盒
本发明提供一种操作简单、提取效率高的DNA提取试剂盒，特别是血浆游离DNA提取试剂盒。本发明的试剂盒基于磁珠法核酸提取原理，专门针对游离DNA片段较短的特点设计开发。利用该试剂盒，仅需2步洗涤，在提取过程中不需要进行离心，同时洗涤步骤无需使用高浓度的醇类物质，从而显著降低对后续测试的影响，而且提取效率达到目前主流的柱提取方法试剂盒的2倍以上。
在具体的实施方式中，本发明提供这样一种游离DNA提取试剂盒，所述试剂盒由容器以及装在所述容器中的裂解液、洗涤液A、洗涤液B、去抑制剂、磁珠、洗脱液组成；其中，
裂解液主要包含异硫氰酸胍、柠檬酸钠、去垢剂(包括但不限于NP40、Triton 100、Tween 20)、异丙醇。在高盐条件以及合适浓度异丙醇条件下，血浆中的游离DNA可以高效地与磁珠结合，同时去除部分蛋白、多糖、血脂等血浆中含有的杂质；
洗涤液A主要包含异硫氰酸胍、去垢剂(包括但不限于NP40、Triton 100、Tween 20)、乙醇，作用是进一步去除磁珠上的杂质，保证游离DNA在洗涤条件下不会丢失。
洗涤液B可以包含极低浓度的醇，例如低于1％的醇，甚至完全不含醇。本发明的洗涤液B还可以不含表面活性剂。本发明人出乎意料地发现，利用醇浓度很低的，甚至不含醇的洗涤液B可以达到良好的洗涤效果。本发明人进一步发现，利用较低pH(例如，pH为4-6)的低醇或不含醇缓冲液可以得到更好的效果。在具体的实施方式中，所述洗涤液B主要包含0.01～1mol/L的pH值4～6的Tris-HCL缓冲液或Tris-乙酸、柠檬酸缓冲液，用于去除盐分和其它水溶性杂质，同时保证游离DNA不会丢失。
去抑制剂主要包含蛋白酶K，和裂解液一起使用来消化血浆中的蛋白类杂质。
磁珠为表面被烷基化的磁性颗粒，用于血浆中游离DNA的吸附。
洗脱液主要包含pH值8.0～10的Tris-HCL缓冲液或Tris-乙酸、柠檬酸缓冲液，用于将游离DNA从磁珠上洗脱下来。
本发明的游离DNA提取系统
在本发明提供的游离DNA提取试剂盒的基础上，本发明进一步提供与该试剂盒配套使用的，或包含或整合了本发明的游离DNA提取试剂盒的全自动核酸提取系统。
在具体的实施方式中，本发明的游离DNA提取系统包括安装平台，以及依次安装于该安装平台上的吸头盒载架、试剂槽载架、离心管载架、PCR板载架、 样本管载架、固定载架以及废弃物载架，其中，固定载架上设置有振荡器，该振荡器具有加热功能。
图1是本发明的游离DNA提取系统的平面示意图。如图1所示，本发明的游离DNA提取系统100通常包括安装平台10、吸头盒载架20、试剂槽载架30、离心管载架40、PCR板载架50、样本管载架60、固定载架70以及废弃物载架80。其中，吸头盒载架20、试剂槽载架30、离心管载架40、PCR板载架50、样本管载架60、固定载架70以及废弃物载架80依次安装于安装平台10上。
吸头盒载架10设置有4个容纳室11，从而可以放置多个相同规格或不同规格的吸头，在本实施例中，吸头盒载架10可放置4盒不同规格的吸头，例如吸头盒载架10可放置4盒1000ul和300ul规格的吸头，当然也可根据需求放置其它规格的一次性吸头。
试剂槽载架30用于放置裂解液、洗涤液、洗脱液等提取试剂。如图1所示，在本实施例中，在安装平台10上一共设置3条并列的试剂槽载架30，且该三条试剂槽载架30紧邻吸头盒载架20布置，其中，每一条试剂槽载架30可以放置四个试剂槽31，每一个试剂槽31可容纳60ml试剂，因此，在本实施例中，最多可放置12个试剂槽。
离心管载架40设置有用于离心管容纳孔41，离心管容纳孔41用于放置盛放小体积试剂的离心管(图未示)，如盛放有磁珠、去抑制剂、PCR反应液等的离心管。在本实例中，离心管载架40总共设置有24个离心管容纳孔41，从而可以安装24个不同规格的离心管，例如24个1.5ml或2ml的离心管。离心管载架40紧邻试剂槽载架40布置。
PCR板载架50紧邻离心管载架40布置，并用于放置96孔PCR反应板，以供后续测试时使用。
样本管载架60用于放置样本管并紧邻PCR板载架布置，在本实施例中，总共设置四条样本管载架60，每条样本管载架设置有24个样本管容纳孔61，每一个样本管容纳孔61可以安装一个样本管，从而每一样本管载架60可以放置24个样本管，样本管可以是13×75mm和13×100mm的规格核酸采血管。当然也可以使用其它规格的样本管载架，从而放置其它规格的核酸采血管，例如更大的16 100或16 125mm规格的核酸采血管等。
固定载架70与样本管载架60间隔一定距离布置，在固定载架70上配置有振荡器(图未示)、磁力板(图未示)和深孔板位(图未示)。其中，振荡器具有加热功能。在游离DNA提取过程中，振荡器进行磁珠的混匀，同时由于振荡器具有加热功能，从而可以将提取的游离DNA从磁珠上洗脱下来。磁力板用来实现对96孔深板内的样本进行磁珠吸附，并通过自动化移液通道吸弃废液，实现固液分离，该模式可以有效避免游离DNA提取过程中的核酸污染，同时达到较高的提取效率。
废弃物载架80用于放置样本处理过程中的废液和废弃吸头，并设置有专门的废液槽(图未示)，该废液槽可以取出并进行清洁消毒。
本发明的游离DNA提取系统的工作流程如下所述：
1.游离DNA提取系统先将试剂槽中的裂解液和磁珠混合液加入到深孔板中，例如加入量为500ul；
2.将样本管中的待测样本吸取一定量(诸如为200ul)并加入到深孔板中与裂解液和磁珠混合液进行混匀；
3.裂解一定时间，例如15至30分钟；
4.裂解完成后，全自动提取系统将深孔板转移至磁力板，待磁珠完全吸附至深孔板底侧部后，通过全自动移液通道吸弃废液；
5.将深孔板转移至振荡器上，再通过全自动移液通道加入洗涤液A：600至800ul，进行震荡洗涤；
6.洗涤完成后，将深孔板转移至磁力板，待磁珠完全吸附至深孔板底侧部后，通过全动动移液通道吸弃废液；
7.再一次将深孔板转移至振荡器上，再通过全自动移液通道加入洗涤液B：600至800ul，进行震荡洗涤；
8.将深孔板转移至磁力板，待磁珠完全吸附至深孔板底侧部后，通过全自移液通道吸弃废液；
9.最后，将深孔板转移至振荡器上，加入洗脱液30至100ul，进行加热洗脱，加热温度为60至85摄氏度，洗脱时间为10至20分钟，得到纯净的游离DNA。
本发明的游离DNA提取系统提供通过全自动操作，实现由样本载入到游离 DNA提取纯化完成的全自动化操作，同时具有设备台面设计紧凑、通量大、提取速度快、成本低的优势，可以更好的满足市场需求。而配套本发明的游离DNA提取试剂盒的全自动游离DNA提取系统不仅实现了游离DNA提取的全自动化，而且提取效率远高于现有技术中的主要提取试剂盒，并且具有非常好的防污染功能。
本发明的优点：
1.本发明的游离DNA提取试剂盒采用的洗涤液B的组成简单、不含醇类等挥发性有机溶剂以及表面活性剂；
2.本发明的与后续PCR反应中利用的缓冲液组成非常接近，仅需适当调节pH就可用于PCR反应；和
3.本发明的游离DNA提取试剂盒以及游离DNA提取系统操作简单、快捷并且准确。
实施例1：
使用全自动游离DNA提取系统和配套游离DNA提取试剂盒，对模拟血浆游离DNA样本进行提取，同时使用天根血浆游离DNA提取试剂盒(目录号DP339，天根生化科技(北京)有限公司，北京)进行比对，比较2种方法对模拟血浆游离DNA样本的提取效率。
其中，本发明游离DNA提取试剂盒的组成为：
裂解液(50％异硫氰酸胍、10％Triton-100、1％柠檬酸钠)；
洗涤液A(30％异硫氰酸胍、5％Triton-100、1％柠檬酸钠、30％乙醇)；
洗涤液B(0.1mol/L，pH值4.5的Tris-HCL缓冲液)；
洗脱液(0.05mol/L，pH值8.5的Tris-HCL缓冲液)；
磁珠溶液(硅烷磁珠，含量为30％)；
去抑制剂(30mg/ml蛋白酶K)。
模拟血浆游离DNA样本的配制使用人工合成的160bpDNA片段(模拟游离DNA片段大小，并设计引物探针用于荧光定量PCR分析)使用人血浆进行10倍梯度稀释，配制成待测的模拟样本。经过2种对比方法提取后，提取产物使用 荧光定量PCR方法进行定量分析。
直接扩增检测样本的配制使用人工合成的161bpDNA片段直接使用超纯水进行10倍梯度稀释，配制成可直接进行荧光定量PCR扩增检测的样本，稀释倍数与上述模拟血浆游离DNA样本一致，作为提取效率计算的基数，通过上述提取产物的定量分析，计算不同提取方法的提取效率
实验分别选择浓度约为105、107、108、109copies/ml的4个浓度样本进行提取效率比较，每个样本重复2次取平均值，综合评估本发明提取效率与天跟游离DNA提取试剂盒效率的差异。
从提取效率的比较结果来看，本发明不仅实现了游离DNA提取的全自动化，而且提取效率要比市面上主要的手工提取试剂盒提取效率高1倍左右。
实施例2：
使用全自动游离DNA提取系统和配套游离DNA提取试剂盒进行防污染测试。
模拟血浆游离DNA样本配制：将人工合成的161bpDNA片段使用人血浆进行一定倍数稀释，使稀释后样本的模拟DNA浓度达到1010copies/ml左右。
防污染测试方案：将模拟血浆游离DNA样本作为阳性样本，阴性血浆作为阴性样本，间隔排列，共进行96个样本的测试，要求48个阴性样本不被污染，使用荧光定量PCR方法进行阴阳性判定。
检测结果显示，全自动游离DNA提取系统在进行96个阴阳间隔样本测试过程中，48个阴性样本检测结果均为阴性，未在提取过程中发生污染。证明该全自动游离DNA提取系统具有非常好的防污染产生功能，适合临床单位使用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。