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1、(10)授权公告号 CN 102766586 B (45)授权公告日 2013.05.15 CN 102766586 B *CN102766586B* (21)申请号 201210248863.1 (22)申请日 2011.05.12 CGMCC No. 4747 2011.04.06 201110122398.2 2011.05.12 C12N 1/18(2006.01) C12G 3/02(2006.01) C12G 3/12(2006.01) C12G 3/04(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (73)专利权人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡。
2、湖大道 1800 号江南大学生物工程学院 (72)发明人 徐岩 吴群 陈良强 (74)专利代理机构 无锡市大为专利商标事务所 32104 代理人 时旭丹 刘品超 (54) 发明名称 中国酱香型白酒生产中高产乙醇低产杂醇油 的酵母 CGMCC 4747 的筛选与应用 (57) 摘要 中国酱香型白酒生产中高产乙醇低产杂醇油 的酵母 CGMCC4747 的筛选与应用， 属于生物工程 技术领域。所述菌株为酿酒酵母 CGMCC4747。菌 株是从中国多家名酒厂的各种大曲、 酒醅、 酿造原 料、 酿造环境中分离得到， 其筛选方法是取曲样、 酒醅、 酿造原料或酿造环境物质， 经过稀释涂布 TTC 初筛平板，。
3、 挑选红色显著的菌落， 再转接于摇 瓶培养进行复筛， 发酵液分别采用蒸馏比重法和 HS-SPME-GC-MS 测定乙醇及杂醇油含量， 筛选获 得乙醇浓度高以及杂醇油浓度低的菌株。该菌株 可应用于食品工业、 酿造酒工业中。 (62)分案原申请数据 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 审查员 代月函 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 (10)授权公告号 CN 102766586 B CN 102766586 B *CN102766586B* 1/1 页 2 1. 高产乙醇低产杂醇。
4、油的酵母， 其分类命名为 酿酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae） BJY-8， 保藏编号CGMCC No. 4747， 以上菌株已 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。 2. 权利要求 1 所述的高产乙醇低产杂醇油的酵母的应用， 其特征在于在酿造酒、 蒸馏 酒、 配制酒的酿造工业和食品工业中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102766586 B 1/4 页 3 中国酱香型白酒生产中高产乙醇低产杂醇油的酵母 CGMCC 4747 的筛选与应用 技术领域 0001 本发明涉及高产乙醇低产杂醇油的酵母的筛选方法， 及应用该方法在中国酱香型 白酒生产中筛选高产。
5、乙醇低产杂醇油的酵母及其在食品工艺、 酿造酒工业中的应用。属于 生物工程技术领域。 背景技术 0002 乙醇是酿造酒中最重要也是最主要的成分之一， 中国白酒中乙醇含量高达 40% 55%（v/v） ； 黄酒中为 14% 20% ； 啤酒中为 2% 5%。酵母是产生乙醇的主要微生物， 也是 酿造酒工业中不可缺少的微生物。 因此， 寻找高产乙醇的酵母能够优化酿造工艺， 降低生产 成本， 在酿酒行业中具有重要的意义。 0003 杂醇油是酵母在酿酒发酵中产生的次生代谢产物， 包括正丙醇、 异丙醇、 正丁醇、 异丁醇、 正戊醇、 仲戊醇、 己醇和庚醇等。 它是白酒中醇甜和助香剂的主要物质， 对形成酒的 。
6、风味和促使酒体丰满、 浓厚起着重要的作用。适宜的杂醇油含量及各种杂醇油之间的比例 协调可使酒的口感柔和协调、 酒体丰满圆润和味道独特， 但白酒中如杂醇油含量过高， 不仅 会导致产品辣、 苦、 涩， 影响酒的口感， 而且对人体有毒害作用。 杂醇油在人体内氧化速度较 乙醇慢， 停留时间长， 会引起头痛， 神经系统充血等症状。杂醇油同时也是造成白酒出现白 色浑浊的原因之一， 因此其含量必须控制在一定范同内， 国标规定白酒中杂醇油的含量为 0.20g/100 mL( 以白酒中含量最大的异丁醇、 异戊醇计 )。 0004 目前， 在传统的酿造酒中， 杂醇油含量普遍偏高的问题已经广泛引起了业界的关 注。 。
7、因此， 为降低其杂醇油含量， 使其控制在合适的范围内， 生产上已采取了种种措施， 如采 用低温发酵、 优化用曲量等。但由于其工艺复杂， 影响因素繁多， 生产中还未得到很好的解 决。 最根本的措施是采用低产杂醇油的酵母菌种进行发酵， 但是， 杂醇油是酵母在乙醇发酵 过程中的必然副产物， 高产乙醇能力的菌株产杂醇油能力一般也较强， 因此高产乙醇与低 产杂醇油往往难于两全。 目前， 也有通过诱变选育低产杂醇油的酒精酵母菌株的报道， 但在 酿造工业中存在回复突变等问题， 生产上存在风险。因此只有选育低产杂醇油且高产乙醇 的野生酵母才是最根本的解决手段。 0005 本发明所筛选获得的酵母是从中国多家名酱。
8、香型白酒厂的各种大曲或酿造酒醅 中筛选所得， 具有高产乙醇低产杂醇油的功能。该菌株为首次从中国白酒酿造过程中获得 的高产乙醇且低产杂醇油的酵母。该菌株是优良的酿酒功能菌株。该菌株能够有效应用于 传统酿造酒工业， 优化酿造酒生产工艺， 降低酿造酒生产成本， 提高酒类品质。 发明内容 0006 （1） 要解决的技术问题 0007 本发明要解决的一个技术问题是提供高产乙醇低产杂醇油的酵母菌株， 本发明所 要解决的另一个技术问题是提供了高产乙醇低产杂醇油的酵母菌株的筛选方法， 以及将所 说 明 书 CN 102766586 B 2/4 页 4 得的酵母应用于酿造酒工业中。 0008 （2） 本发明的技。
9、术方案 0009 高 产 乙 醇 低 产 杂 醇 油 的 酵 母， 其 分 类 命 名 为 酿 酒 酵 母 （Saccharomyces cerevisiae） BJY-8， 保藏编号 CGMCC No. 4747， 上述菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心。 0010 高产乙醇低产杂醇油的酵母菌株的筛选 ： 0011 所述的高产乙醇低产杂醇油的酵母的筛选方法， 在中国酱香型白酒生产中将大 曲、 酒醅、 酿造原料或酿造环境物质与无菌水混合后， 经过稀释涂布 TTC 初筛平板， 挑选红 色显著的菌落， 再转接于液体发酵培养基， 摇瓶培养进行复筛， 发酵液分别采用蒸馏比重法 和。
10、 HS-SPME-GC-MS 测定乙醇及杂醇油含量， 筛选获得产乙醇浓度高以及产杂醇油浓度低的 菌株。 0012 取 0.5 5g 大曲、 酒醅、 酿造原料或酿造环境物质溶于 15 150mL 无菌生理盐水 摇床振荡 30 150min， 再稀释， 涂布 TTC 初筛平板。 0013 TTC 初筛培养 ： TTC 上层培养基 （g/L） ： 葡萄糖 5， 琼脂 15， 121灭菌 20min， 冷却至 60左右时， 加入 TTC 溶液 （三苯基四氮唑盐酸盐， 终浓度 0.5） 后， 立即倾倒底层平板。TTC 下层培养基 ： YPD 琼脂。涂布 TTC 初筛平板后 30培养 24h， 长出可见菌。
11、落后， 倒入约 12mL TTC上层培养基覆盖原来菌落， 之后在30下避光保温23h， 由菌落的呈色来判断酵母产 酒精能力。 0014 TTC 初筛挑选红色显著的菌落， 再转接于摇瓶培养进行复筛， 摇瓶发酵培养条件 为 ： 接种量为 0.1106 5106个 /mL， 培养基为 ： 采用 YPD、 高粱汁或麦芽汁液体培养基， 高粱汁或麦芽汁制作方式为 ： 20 200g 高粱或麦芽样品经粉碎后， 加 mL/g 计 1 4 倍的 水， 蒸煮 1-5h， 呈糊状， 冷却后加入 10 50U/g 的糖化酶， 于 40 80保持 2 10h， 过滤、 离心所得滤液， 糖度为1015oBx ； 调节pH。
12、为25， 2535， 150rpm， 摇瓶培养24120h。 0015 所述的高产乙醇低产杂醇油的酵母的应用， 在各种酿造酒、 蒸馏酒、 配制酒的酿酒 工业和食品工业中的应用。高产乙醇低产杂醇油的酵母在酿造酒工业中的应用 ： 将该菌株 制成液体或固体菌制剂， 添加于酿造酒酿造过程中， 能够有效增加酿造中该菌株的生物量， 并有效提高乙醇的含量， 减少杂醇油的生成， 最终提高酿造酒的品质。 0016 乙醇浓度测定 ： 蒸馏比重法测定乙醇浓度。同时用减重法测定 CO2释放质量。 0017 杂醇油浓度测定 ： 采用 HS-SPME-GC-MS 方法， 15 mL 顶空瓶中加入 5 10 mL 澄清 发。
13、酵液， 1 5 g NaCl， 以 4- 甲基 -2- 戊醇为内标， 进行顶空固相微萃取。顶空固相微萃取 的条件为 ： 三相 (Car/DVB/PDMS) 萃取头， 60 预热 5 10 min， 萃取吸附 30 50 min， GC 解吸 5 10 min。 0018 （3） 有益效果 0019 本发明所筛选获得的酵母是从中国酱香型白酒酿造过程中筛选所得， 具有高产乙 醇低产杂醇油的功能。 该批菌株为首次从中国白酒酿造过程中获得的高产乙醇且低产杂醇 油的酿酒酵母。该批菌株每株都是优良的酿酒功能菌株。这些菌株能够有效应用于酿造酒 行业， 优化酿造酒生产工艺， 降低酿造酒生产成本， 提高酒质。 。
14、0020 生物材料样品保藏 ： 中国酱香型白酒生产中高产乙醇低产杂醇油的酵母， 其分类 命名为 ： 异常毕赤酵母 （Pichia anomala ） BJY-1， 已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 说 明 书 CN 102766586 B 3/4 页 5 会普通微生物中心， 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中国科学院微生物研究所， 保 藏编号 CGMCC No. 4740， 保藏日期 2011 年 4 月 6 日 ； 0021 粟酒裂殖酵母 （Schizosaccharomyces pombe） BJY-5， 已保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号 。
15、CGMCC No. 4744， 保藏日期 2011 年 4 月 6 日 ； 0022 拜尔接合酵母 （Zygosaccharomyces bailii ） BJY-6， 已保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号 CGMCC No. 4745， 保藏日期 2011 年 4 月 6 日 ； 0023 丝孢酵母 （Trichosporon asahii ） BJY-7， 已保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心， 保藏编号 CGMCC No. 4746， 保藏日期 2011 年 4 月 6 日 ； 0024 酿酒酵母 （Saccharomyces cerevisi。
16、ae） BJY-8， 已保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心， 保藏编号 CGMCC No. 4747， 保藏日期 2011 年 4 月 6 日 ； 0025 少孢酵母 （Kazachstania exigua ） BJY-9， 已保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心， 保藏编号 CGMCC No. 4748， 保藏日期 2011 年 4 月 6 日 ； 0026 发酵毕赤酵母 （pichia fermentans） BJY-11， 已保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心， 保藏编号 CGMCC No. 4750， 保藏日期 2011 年 4 月 6 。
17、日。 附图说明 0027 图 1. 异常毕赤酵母 （Pichia anomala） CGMCC No. 4740 细胞形态电镜照片。 0028 图 2. 少孢酵母 （Kazachstania exigua） CGMCC No. 4748 细胞形态电镜照片。 0029 图 3. 酿酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae） CGMCC No. 4747 高粱汁发酵培养 释放 CO2时间曲线。 0030 图 4. 发酵毕赤酵母 （pichia fermentans） CGMCC No. 4750 高粱汁发酵培养释放 CO2时间曲线。 具体实施方式 0031 实施例 1 ： 高产乙。
18、醇低产杂醇油的酵母菌株的筛选 0032 取 0.5g 酒醅溶于 15mL 无菌生理盐水摇床振荡 30 分钟， 再稀释， 涂布 TTC 初筛 平板， 挑选红色显著的菌落， 再转接于摇瓶培养进行复筛， 发酵液分别采用蒸馏比重法和 HS-SPME-GC-MS 测定乙醇及杂醇油含量， 筛选获得乙醇浓度高以及杂醇油浓度低的菌株。 0033 TTC 初筛培养 ： TTC 上层培养基 （g/L） ： 葡萄糖 5， 琼脂 15， 121灭菌 20min， 冷却至 60左右时， 加入 TTC 溶液 （三苯基四氮唑盐酸盐， 终浓度 0.5） 后， 立即倾倒底层平板。TTC 下层 ： YPD 琼脂。30培养 24h。
19、， 长出可见菌落后， 倒入约 12mL TTC 上层培养基覆盖原来菌 落， 之后在 30下避光保温 2 3h， 由菌落的呈色来判断酵母产酒精能力。 0034 摇瓶培养条件为 ： 接种量为0.11065106个/mL， 培养基条件为 ： 采用麦芽汁 培养基， 制作方式为 ： 20g麦芽样品经粉碎后， 加14倍体积的水， 蒸煮1-5h， 呈糊状， 冷却 后加入 10 50 单位 /g 的糖化酶， 于 40 80保持 2 10h， 过滤、 离心所得滤液， 糖度为 10oBx ； 调节 pH 为 4 5， 25 35， 150rpm， 摇瓶培养 24 120h。 0035 实施例 2 ： 高产乙醇低产。
20、杂醇油的酵母及其分子生物学鉴定 0036 对获得的不同高产乙醇低产杂醇油的酵母进行分子生物学鉴定， 利用酵母特异分 类鉴定引物分别扩增菌株的 26srDNA 片段， 经凝胶电泳检测。随后进行测序比对， 确定所筛 说 明 书 CN 102766586 B 4/4 页 6 得酵母的种属。将菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 酵母种属 及保藏编号见表 1。 0037 表 1 高产乙醇低产杂醇油的酵母 0038 编号 中文名英文名保藏编号 1异常毕赤酵母PichiaanomalaCGMCCNo.4740 2粟酒裂殖酵母SchizosaccharomycespombeCGMCCNo.。
21、4744 3拜耳接合酵母ZygosaccharomycesbailiiCGMCCNo.4745 4丝孢酵母TrichosporonasahiCGMCCNo.4746 5酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeCGMCCNo.4747 6少孢酵母KazachstaniaexiguaCGMCCNo.4748 7发酵毕赤酵母pichiafermentansCGMCCNo.4750 0039 实施例 3 ： 菌株发酵产乙醇及杂醇油测定 0040 以某酒厂所用的 2 株产酒酵母为对照， 将本专利所提供的不同高产乙醇低产杂 醇油的酵母， 采用 pH 为 5， 糖度为 10oBx 的高粱汁培养基， 1106个 /mL 的接种量， 30， 150rpm， 摇瓶培养 72 96h， 产乙醇及杂醇油浓度见表 2。 0041 表 2 酵母高粱汁培养基发酵产乙醇结果 0042 0043 注 ： 乙醇对糖的理论转化率为 51.1。 说 明 书 CN 102766586 B 1/2 页 7 图 1图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102766586 B 2/2 页 8 图 4 说 明 书 附 图 CN 102766586 B 。