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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610246323.8 (22)申请日 2016.04.20 (71)申请人 西南大学 地址 400715 重庆市北碚区天生路2号 (72)发明人 宋震王艳娇崔甜甜陈洪明 李中安周常勇 (74)专利代理机构 上海光华专利事务所 31219 代理人 尹丽云 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (54)发明名称 一种快速鉴定柑橘脉突病毒侵染植株的方 法 (57)摘要 本发明提供一种快速鉴定柑橘脉突病毒侵 染植株的方。
2、法， 包括如下步骤：（1） 取待测植株根 部， 提取总RNA；（2） 以提取的总RNA为模板， 利用 柑橘脉突病毒的特异性下游引物EVqR4进行逆转 录反应， 获得cDNA；（3） 以步骤 （2） 制得的cDNA为 模板， 利用特异性引物EVqF4、 EVqR4进行实时荧 光定量RT-PCR检测， 并制作标准曲线；（4） 根据上 述步骤 （3） 的检测结果判断植株的带病情况， 对 带病植株的病毒进行定量计算。 本发明对柑橘脉 突病毒侵染植株的鉴定具有速度快、 准确度高及 重复性强的特点， 并可对植株内的CEVE病毒进行 定量分析。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 105861747。
3、 A 2016.08.17 CN 105861747 A 1.一种快速鉴定柑橘脉突病毒侵染植株的方法， 其特征在于， 包括如下步骤： (1)取待测植株的根部， 提取总RNA； (2)以提取的总RNA为模板， 利用特异性引物EVqR4进行逆转录反应， 获得cDNA； (3)以步骤(2)制得的cDNA为模板， 利用特异性引物EVqF4、 EVqR4进行实时荧光定量RT- PCR检测， 并制作标准曲线； (4)根据上述步骤(3)的检测结果判断植株的带病情况。 2.根据权利要求1所述的快速鉴定柑橘脉突病毒侵染植株的方法， 其特征在于： 所述特 异性引物EVqF4、 EVqR4的序列如下： EVqF4：。
4、 5 -AGAGATGCGTCCTTACCACT-3 ； EVqR4： 5 -CGCCTTCCACTGTACTCTCA-3 。 3.根据权利要求1所述的快速鉴定柑橘脉突病毒侵染植株的方法， 其特征在于： 所述步 骤(1)中取待测植株根部5-100mg， 采用Trizol法提取总RNA。 4.根据权利要求1所述的快速鉴定柑橘脉突病毒侵染植株的方法， 其特征在于： 所述步 骤(2)中逆转录的反应体系及程序为： 取总RNA模板2.5 L， 加ddH2O2.5 L混匀， 942min解 链， 冰上急冷， 然后加入ddH2O8.0 L，Buffer4.0 L， 10mMdNTP1.0 L， 10 MEV。
5、qR40.5 L， 40U/ LRNaseInhibitor0.5 L， 200U/ LRTase1.0 L， 再运 行程序： 42， 60min； 70， 15min。 5.根据权利要求1所述的快速鉴定柑橘脉突病毒侵染植株的方法， 其特征在于： 所述步 骤(3)的实时荧光定量RT-PCR检测， 反应体系为：qPCRMasterMix12.5 L、 10 M的 特异性引物EVqF4、 EVqR4各0.5 L、 ddH2O9.5 L、 所述步骤(2)所得逆转录混合液2.0 L； 荧 光定量PCR扩增条件： 95预变性5min， 95变性15s， 54-64退火30s， 40个循环， 熔解曲线 程。
6、序为： 9515s， 601min， 9515s； 从60开始收集荧光信号。 6.根据权利要求5所述的快速鉴定柑橘脉突病毒侵染植株的方法， 其特征在于： 所述步 骤(3)中荧光定量PCR扩增时， 退火温度为60。 7.根据权利要求1所述的快速鉴定柑橘脉突病毒侵染植株的方法， 其特征在于， 所述步 骤(3)中标准曲线的制作方法如下： 取柑橘脉突病毒外壳蛋白基因克隆质粒作为标准品， 用 ddH2O稀释为71017108拷贝 L-1的10倍浓度梯度模板， 然后进行实时荧光定量PCR扩 增， 扩增完成后， 以Ct值为纵坐标， 标准品浓度对数值为横坐标， 制作标准曲线。 8.根据权利要求7所述的快速鉴定。
7、柑橘脉突病毒侵染植株的方法， 其特征在于， 标准曲 线的方程为y3.28lg(X)+0.71， y为Ct值， X为CVEV浓度。 9.根据权利要求7所述的快速鉴定柑橘脉突病毒侵染植株的方法， 其特征在于， 所述步 骤(4)中待测植株带病情况的判断方法如下： 通过扩增曲线及Ct值来判定待测植株是否为 病毒侵染阳性植株， 当扩增曲线良好并且Ct35时， 则为阳性， 即判断待测植株带毒； 反之， Ct 35时， 则为阴性， 即判断待测植株不带毒。 10.根据权利要求9所述的快速鉴定柑橘脉突病毒侵染植株的方法， 其特征在于， 所述 步骤(4)中， 当检测出待测植株带毒时， 根据待测样品Ct值以及所述步。
8、骤(3)建立的标准曲 线， 计算待测植株内病毒浓度。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105861747 A 2 一种快速鉴定柑橘脉突病毒侵染植株的方法 技术领域 0001 本发明涉及农业技术领域， 特别是涉及一种快速鉴定柑橘脉突病毒侵染植株的方 法。 背景技术 0002 柑橘脉突病毒( Citrusveinenationvirus ,CVEV )是黄矮病毒科 (Luteoviridae)、 豌豆耳突花叶病毒属(Enamovirus)的正义单链RNA病毒(MariCarmenet al.， 2013； Huangetal.， 2015)， 可引起柑橘脉突病。 1953年， Wallce和Dr。
9、ake在美国的加利 福尼亚州酸橙上首次发现， 酸橙感病后主要表现为叶背侧脉和支脉产生耳状小突起， 叶面 有相应的凹陷突起(Wallce&Drake， 1953)。 随后， 在南非也发现相似症状(McClean， 1954)。 1959年， 在澳大利亚发现一种能引起粗柠檬的根茎部出现木瘤的病害(Fraser,1960)， 随后 证实木瘤病和脉突病均是由同一种病原体引起(Wallace&Deake,1960， 1961)。 目前， 柑桔脉 突病在阿根廷、 澳大利亚、 巴西、 中国、 日本、 印度、 秘鲁、 南非、 西班牙、 美国和土耳其等多个 国家均有发生。 由于CVEV除嫁接传播外， 还能由数种。
10、蚜虫传播， 如桔蚜(Toxopetera citricida)、 棉蚜(Aphisgossypii)、 桃蚜(Myzuspcrsicae)等(Laird&Weathers， 1961； Maharaj&Graca， 1989)高效传播。 因而具有大面积流行风险， 威胁柑橘生产安全。 0003 柑橘三级良繁体系的母本树鉴定、 新建柑橘园引种以及CVEV流行调查等都需要对 植株进行鉴定， 判断植株的病毒感染情况， 以排除带病植株， 防止病毒的扩散传播， 降低生 产损失， 维护产业安全。 目前， 柑橘脉突病的检测主要采用指示植物鉴定法、 血清学方法如 ELISA以及常规RT-PCR。 但指示植物鉴定。
11、法费时费力， 且易受柑橘衰退病毒(Citrus tristezavirus,CTV)的影响而掩盖症状(陈国庆和王洪祥， 1996； Vidalakisetal.， 2004)。 ELISA检测灵敏度相对较低。 而常规RT-PCR法检测CVEV的假阴性率较高。 这些现有技 术往往从植株的叶片或者嫩茎部位取样进行检测， 取样的部位不合理， 加之检测灵敏度较 低， 往往造成病株鉴定结果不准确， 不能准确排除带病植株， 难以起到有效抑制CVEV传播的 效果。 发明内容 0004 鉴于以上所述现有技术的缺点， 本发明的目的在于提供一种快速鉴定柑橘脉突病 毒侵染植株的方法， 用于解决现有技术中对带有CVE。
12、V植株的鉴定结果不准、 检测方法复杂、 操作繁琐等缺陷。 0005 为实现上述目的及其他相关目的， 本发明提供一种快速鉴定柑橘脉突病毒侵染植 株的方法， 包括如下步骤： 0006 (1)取待测植株的根部， 提取总RNA； 0007 (2)以提取的总RNA为模板， 利用特异性引物EVqR4进行逆转录反应， 获得cDNA； EVqR4为柑橘脉突病毒的特异性下游引物； 0008 (3)以步骤(2)制得的cDNA为模板， 利用特异性引物EVqF4、 EVqR4进行实时荧光定 说明书 1/5 页 3 CN 105861747 A 3 量RT-PCR检测， 并制作标准曲线； 0009 (4)根据上述步骤(。
13、3)的检测结果判断植株的带病情况。 0010 本发明主要适用于芸香科(Rutaceae)柑橘属(拉丁名： Citrus)植株的鉴定。 0011 进一步地， 所述特异性引物EVqF4、 EVqR4的序列如下： 0012 EVqF4： 5 -AGAGATGCGTCCTTACCACT-3 ； 0013 EVqR4： 5 -CGCCTTCCACTGTACTCTCA-3 。 0014 进一步地， 所述步骤(1)中取待测植株根部5-100mg， 采用Trizol法提取总RNA。 当 然， 也可以采用其他方法对待测植株的总RNA进行提取。 0015 进一步地， 所述步骤(2)中逆转录的反应体系及程序为： 取。
14、总RNA模板2.5 L， 加 ddH2O2.5 L混匀， 942min解链， 冰上急冷， 然后加入ddH2O8.0 L， 5PrimeBuffer 4.0 L， 10mMdNTP1.0 L， 10 MEVqR40.5 L， 40U/ LRNaseInhibitor0.5 L， 200U/ L PrimeRTase1.0 L， 再运行程序： 42， 60min； 70， 15min。 0016进一步地， 所述步骤(3)的实时荧光定量PCR反应， 反应体系为： GoqPCR MasterMix12.5 L、 10 M的特异性引物EVqF4、 EVqR4各0.5 L、 ddH2O9.5 L、 所述步。
15、骤(2) 所得逆转录混合液2.0 L； 荧光定量PCR扩增条件： 95预变性5min， 95变性15s， 54-64 退火30s， 40个循环， 熔解曲线程序为： 9515s， 601min， 9515s； 从60开始收集荧光信 号。 0017 进一步地， 所述步骤(3)中荧光定量PCR扩增时， 退火温度为60。 0018 进一步地， 所述步骤(3)中标准曲线的制作方法如下： 取柑橘脉突病毒外壳蛋白基 因克隆质粒作为标准品， 用ddH2O稀释为71017108拷贝 L-1的10倍浓度梯度模板， 然 后进行实时荧光定量PCR扩增， 扩增完成后， 以Ct值为纵坐标， 标准品浓度对数值为横坐标， 制。
16、作标准曲线。 0019 进一步地， 标准曲线的方程为y3.28lg(X)+0.71， y为Ct值， X为CVEV浓度， X的单 位为拷贝 L-1。 0020 进一步地， 所述步骤(4)中待测植株带病情况的判断方法如下： 通过扩增曲线及Ct 值来判定待测植株是否为病毒侵染阳性植株， 当扩增曲线良好并且Ct35时， 则为阳性， 即 判断待测植株带毒； 反之， Ct 35时， 则为阴性， 即判断待测植株不带毒。 0021 进一步地， 所述步骤(4)中， 当检测出待测植株带毒时， 根据待测样品Ct值以及所 述步骤(3)建立的标准曲线， 计算待测植株内病毒浓度。 0022 如上所述， 本发明通过优选取样。
17、部位(根部)， 设计特异引物(EVqF4/EVqR4)， 优化 反应条件等手段建立的柑橘脉突病毒侵染植株的快速鉴定方法， 具有以下有益效果： 选取 待测植株的根部进行检测， 明显提高检测结果的准确度， 克服了现有技术中因取样部位(叶 片或嫩茎)所导致的假阴性等缺陷； 该实时荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度比常规RT- PCR高100倍， 特异性强， 重复性高(组内和组间变异系数均小于2.85)， 并可实现对感病植 株内CVEV病毒的定量分析。 0023 由于本发明对柑橘脉突病毒侵染植株的鉴定具有速度快、 准确度高及重复性强的 特点， 并可对植株内的CEVE病毒进行定量分析， 在母本树鉴定、。
18、 建园引种及病害流行调查 时， 采用本发明对柑橘脉突病毒侵染植株进行快速筛查， 不仅高效准确而且将有效降低生 产风险， 明显提高生产效益， 并可有效防控CVEV的传播流行， 维护产业安全。 说明书 2/5 页 4 CN 105861747 A 4 附图说明 0024 图1显示为检测的扩增曲线图。 0025 图2显示为标准曲线及病毒定量图。 0026 图3显示为不同质粒浓度下的实时定量PCR扩增曲线图。 0027 图4显示为不同质粒浓度下的常规PCR电泳图。 具体实施方式 0028 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式， 本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与。
19、功效。 本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用， 本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用， 在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。 0029 实施例1 0030 本发明对CVEV的实时荧光RT-qPCR检测及定量实例如下： 0031 1、 根部样品总RNA提取： 1)用无菌刀片切取待测柑橘植株的白色嫩根100mg， 于液 氮中充分研磨， 再加Trizol试剂1.0mL充分研磨， 室温放置5min； 2)12000rpm,4离心5min， 吸取上清液1.0mL至新离心管； 3)加氯仿200 L， 剧烈手摇15s， 室温放置10min； 4)12000rpm, 4离心。
20、10min； 5)吸取上层水相650 L至新离心管， 加入650 L异丙醇， 室温放置2-3min后- 20静置30min； 6)12000rpm， 4离心10min， 弃上清液； 7)用75酒精1mL洗涤沉淀2-3次； 8)7500rpm， 4离心5min， 吸弃上清， 真空干燥RNA沉淀3-5min； 9)加入DEPC水50 L溶解RNA， 立即进行逆转录或-80保存。 0032 2、 逆转录： 取上述RNA模板2.5 L， 加ddH2O2.5 L， 混匀， 942min解链， 冰上急冷。 然后依次加入ddH2O8.0 L， 5PrimeBuffer4.0 L， dNTP(10mM)1.0。
21、 L， EVqR4(10 molL-1)0.5 L， RNaseInhibitor(40U/ L)0.5 L， PrimeRTase(200U/ L)1.0 L， 再 运行程序： 42， 60min； 70， 15min。 00333、 实时荧光定量PCR反应： 冰上避光配制反应混合液， 其中GoqPCRMaster Mix12.5 L、 10 MEVqF4、 EVqR4各0.5 L、 ddH2O9.5 L； 分别取阳性对照、 阴性对照以及前 部所得待测cDNA混合液总核酸2 L到PCR管， 分别加反应混合液各23 L混匀， 5000rmp， 1min 离心。 反应在ABI7000荧光定量仪进。
22、行， 反应参数为： 95预变性5min， 95变性15s， 60 退火30s， 40个循环。 该反应体系中， 引物EVqF4、 EVqR4的终浓度为200nM。 0034 4、 检测结果报告： 0035 在正负对照均符合预期的前提下， 通过扩增曲线及Ct值来判定待测植株是否为病 毒侵染阳性植株， 如果有良好扩增曲线并且Ct35， 则为阳性， 即待测植株带毒， 反之， 则为 检测阴性。 本实施例的试验结果见图1， 正对照及CVEV样品有典型扩增曲线且Ct35， 为阳 性， 即待测植株带毒； 其他样品无典型扩增曲线且Ct 35， 为阴性， 即待测植株不带毒。 0036 5、 植株内CVEV病毒定量。
23、 0037 1)标准曲线制作： 分别取CVEV外壳蛋白基因克隆质粒作标准品， 用ddH2O稀释为7 1017108拷贝 L-1的10倍浓度梯度模板， 然后按上述方法进行实时荧光定量PCR， 扩 增完成后， 以Ct值为纵坐标， log10X(X为标准品系列浓度)为横坐标， 制作标准曲线。 本实施 说明书 3/5 页 5 CN 105861747 A 5 例标准曲线结果(图2)显示， 模板浓度的对数值与其Ct值之间具有良好的线性关系， 相关系 数(R2)为0.99， 扩增效率(E)为101.8， 直线方程为y3.28lg(X)+0.71。 0038 2)病毒定量： 依据待测病毒的Ct值， 利用标准。
24、曲线所得直线方程即可对病毒准确 定量。 本实施例中待测样品(图2中待测样品标记为)的Ct15， 可以通过直线方程y 3.28lg(X)+0.71， 很快计算出样品中的病毒浓度为1104.4Copies/ L。 图2为标准曲线及病 毒定量图。 0039 6、 实时荧光定量RT-PCR条件的优化 0040 1)引物浓度的优化 0041 以71017108拷贝L-1的质粒标准品为模板， 设定40nM， 80nM， 100nM， 200nM， 300nM五个实时引物浓度进行实时荧光定量RT-PCR， 观察各引物浓度扩增的扩增效 率和溶解曲线。 实验结果发现， 引物浓度在200nM时， 扩增效率最高， 。
25、达到101.8， 相关性系 数为0.992， 因此确定200nM为该体系引物终浓度。 0042 2)退火温度的优化 0043 以7105拷贝 L-1的质粒为模板， 在优化的引物浓度下， 退火温度从54-64 进行实时荧光定量梯度RT-PCR， 观察退火温度对荧光信号的影响， 选取Ct值最小且扩增曲 线最好的温度。 实验结果发现， 退火温度在60.4时荧光值最高， Ct值最小， 且溶解曲线为 单一峰， 因此确定该体系的退火温度为60。 0044 下面结合实验对本发明的应用效果做进一步的说明。 0045 1.本发明检测CVEV的特异性实验 0046 分别以CVEV、 柑橘黄化脉明病毒(Citrus。
26、yellowveinclearingvirus,CYVCV)、 柑橘鳞皮病毒(Citruspsorosisvirus,CPV)、 柑橘碎叶病毒(Citrustatterleaf virus,CTLV)、 柑橘衰退病毒(Citrustristezavirus,CTV)、 柑橘裂皮病毒(Citrus exocortisviroid,CEVd)侵染植株的总RNA为模板， 进行实时荧光定量RT-qPCR， 结果如图1 所示， 只有CVEV有扩增， 其他均无扩增， 说明应用本发明检测CVEV的特异性强。 0047 2.本发明检测CVEV的灵敏度试验 0048 以稀释的71017108拷贝 L-1的质粒标。
27、准品为模板， 平行进行实时荧光定 量RT-PCR和普通RT-PCR， 比较两种方法的灵敏度。 试验结果显示： 实时荧光定量RT-PCR能够 检测到7101拷贝 L-1质粒浓度(如图3所示， 1-8： 7108-7101拷贝 L-1)， 而普通RT- PCR只能检测到7103拷贝 L-1的质粒浓度(如图4所示)， 说明荧光定量RT-PCR的灵敏度 是普通RT-PCR的100倍。 0049 3.本发明检测CVEV的重复性试验 0050 以梯度稀释的71077104拷贝 L-1的质粒标准品为模板， 每个稀释度3个重 复， 分3天进行3次实验， 获得Ct值、 标准差(SD)以及变异系数(CV)。 实验。
28、结果(表1)显示各梯 度组内重复检测的变异系数最大为2.85， 组间重复检测的变异系数最大为2.76， 表明 该方法具有较好的重复性。 0051 表1重复性实验结果 说明书 4/5 页 6 CN 105861747 A 6 0052 0053 4.本发明检测CVEV侵染植株的不同组织部位 0054 应用本发明的实时荧光定量RT-PCR鉴定方法(取样部位按需要调整)对代代酸橙 以及象山红植株中CVEV的分布进行定量检测。 试验中每个样品3个技术重复。 检测结果如表 2所示， 数据表明CVEV在代代酸橙和象山红植株中的分布极为不均匀。 其中， 根部病毒含量 最高， 皮中含量居中， 叶中含量最低。 。
29、这种不均匀性在代代酸橙植株中表现更为突出， 根中 CVEV高达81261拷贝， 而叶片中检测为阴性。 象山红根部CVEV病毒含量是叶部含量的4.63 倍。 0055 表2实时荧光定量RT-PCR检测植株不同组织部位的CVEV含量 0056 0057 上述结果证明了现有检测技术通过叶和皮取样来判断植株是否携带CVEV是不可 靠的， 准确率低， 不能准确排除带病植株， 从而带来生产安全隐患。 0058 5.本发明方法与常规RT-PCR检测田间样品的对比试验 0059 待测样品90个， 分别用常规RT-PCR及本发明实时荧光定量RT-qPCR方法进行CVEV 的检测， 分别重复3次判定结果。 前者按。
30、惯例取叶片进行检测， 获得阳性样品6个， 阳性率 6.67； 后者自根部取样进行检测， 获得阳性样品17个， 阳性率18.89； 阳性率提高近3倍。 另外， 常规RT-PCR检测除需要总RNA提取、 逆转录、 PCR扩增外， 还需要制胶、 电泳、 染色等步 骤， 用时8个小时。 而本发明实时荧光定量RT-qPCR法仅需RNA提取、 逆转录、 PCR扩增即可获 得数据， 用时约4个小时， 检测速度提高1倍。 0060 综上所述， 本发明建立的取样方法以及实时荧光定量RT-qPCR检测方法快速、 灵 敏， 可实现对CVEV带病植株的快速鉴定， 并且准确、 可靠， 可用于柑橘母本树鉴定、 建园引种 。
31、及病害流行调查等， 应用前景广阔。 因此， 本发明建立了一种快速、 灵敏、 特异、 高效的CVEV 侵染植株鉴定新方法。 0061 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效， 而非用于限制本发明。 任何熟 悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下， 对上述实施例进行修饰或改变。 因 此， 举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变， 仍应由本发明的权利要求所涵盖。 说明书 5/5 页 7 CN 105861747 A 7 图1 图2 说明书附图 1/2 页 8 CN 105861747 A 8 图3 图4 说明书附图 2/2 页 9 CN 105861747 A 9 。