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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610188527.0 (22)申请日 2016.03.24 (71)申请人 天津出入境检验检疫局动植物与食 品检测中心 地址 300461 天津市天津港保税区京门大 道158号 (72)发明人 王乃福陈小金吴冬雪黄晨 陈本龙董志珍赵祥平王玉玲 王建华 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于快速等温检测猪德尔塔冠状病毒的引 物组和方法 (57)摘要 本。
2、发明公开了一种用于快速等温检测猪德 尔塔冠状病毒的引物组和方法。 本发明公开了一 种运用环介导等温扩增技术(LAMP)检测猪德尔 塔冠状病毒的方法， 用于环境样本、 医学样本及 卫生防疫领域猪德尔塔冠状病毒的检测。 其技术 方案是以猪德尔塔冠状病毒基因组中编码N段区 域基因序列为目的序列， 设计特异性引物， 优化 反应体系， 进行目的基因特异性扩增， 本发明只 需一个恒温装置， 不需要模板的热变性、 长时间 温度循环， 而且可以直接观察结果， 具有低成本、 高效率、 操作简单的特点。 本发明建立的猪德尔 塔冠状病毒核酸LAMP检测方法具有特异性强、 灵 敏度高、 方便快捷等特点， 可在基层实验。
3、室和小 型实验基地进行， 为猪德尔塔冠状病毒检测提供 了一种新的技术与方法。 权利要求书1页 说明书5页 序列表3页 附图1页 CN 105861744 A 2016.08.17 CN 105861744 A 1.一套检验猪德尔塔冠状病毒的引物， 其特征在于： 通过环介导等温扩增技术检测猪 德尔塔冠状病毒的引物组， 序列为： SEQIDNO： 1、 SEQIDNO： 2、 SEQIDNO： 3、 SEQIDNO： 4， 上述引物可以检测到至少10个拷贝的猪德尔塔冠状病毒。 2.权利要求1所述的引物在制备用于检验猪德尔塔冠状病毒的试剂盒中的应用。 3.一种用于检验猪德尔塔冠状病毒的试剂盒， 包括。
4、： (1)环介导等温扩增反应试剂， 包括扩增体系中各成分的组成； (2)按照比例混合的权利要求1所述的SEQIDNO： 1、 SEQIDNO： 2、 SEQIDNO： 3、 SEQ IDNO： 4。 (3)阳性标本对照、 阴性标本对照； (4)使用说明书。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其中还包括SYBRGreenI染料， 加入到产物中可以在 紫外灯和日光下观察反应管颜色变化。 5.利用权利要求1的引物或权利要求3的试剂盒进行环介导等温扩增检测猪德尔塔冠 状病毒方法， 包括： (1)RNA的提取及cDNA的制备 取样本， 将病毒灭活后， 进行反转录反应， 得到cDNA， -20备用； (2。
5、)猪德尔塔冠状病毒N基因区的检测 2 LcDNA样品、 5 LBstDNA聚合酶缓冲液(10)、 2 LBstDNA聚合酶(8000U/L)、 5 L dNTP(10mmol/L)、 3 LBetaine(5mol/L)、 6 LMgSO4(25mmol/L)、 对应于N段基因的引物如 权利要求1所述的SEQIDNO： 1、 SEQIDNO： 2各4 L、 SEQIDNO： 3、 SEQIDNO： 4各0.5 L、 18 LH2O， 混匀； (3)恒温水浴或热块扩增或任何保温材料6065， 30min90min； (4)扩增产物采用荧光染料法同步检测。 6.如权利要求5所述方法能够检测到至少1。
6、0个拷贝的猪德尔塔冠状病毒。 7.如权利要求5所述方法在检测食品及原料、 环境样本、 进境种猪血清样品中猪德尔塔 冠状病毒方面的用途。 8.如权利要求5所述方法可以在基层或小型实验基地进行， 可应用于现场检测、 卫生评 价等方面。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105861744 A 2 用于快速等温检测猪德尔塔冠状病毒的引物组和方法 技术领域 0001 本发明涉及病毒检验技术， 具体地说是运用环介导等温扩增法来检测猪德尔塔冠 状病毒。 背景技术 0002 仔猪腹泻是影响猪群生产的一种常见性多发性疾病， 猪传染性胃肠炎病毒 (Transmissiblegastroenteritisviru。
7、s， TGEV)、 猪流行性腹泻病毒(porcineepidemic diarrheavirus， PEDV)、 猪轮状病毒(Porcinerotovirus， PRoV)是我国流行性病毒性仔猪 腹泻的主要病原， 其中TGEV和PEDV均为冠状病毒。 2012年香港大学学者检测到新型猪冠状 病毒-猪德尔塔冠状病毒(porcinedeltacoronavirus， PDCoV)， 基因序列分析表明为 冠 状病毒。 2012年Patrick等对169份猪腹泻样品进行检测的结果表明猪德尔塔冠状病毒阳性 率为10； Marthaler等对美国部分地区2014年1月至2月的猪场样品进行检测， 结果PDC。
8、oV 阳性率为30， 表明PDCoV在美国中东部普遍存在。 引起仔猪腹泻的新发现病原体， PDCoV已 经引起了欧盟和世界动物卫生组织(OIE)的重视， 因此快速、 准确的检测家畜血清样品中是 否含有猪德尔塔冠状病毒将有助于控制病毒的传播， 并为我国的养殖业动物及其产品的正 常贸易提供强有力的技术支持。 0003 目前， 猪德尔塔冠状病毒的检测方法为中和试验及荧光定量RT-PCR。 中和试验所 需检测时间过长， 费时费力； 荧光定量RT-PCR对人员和设备要求较高， 难于在基层实验室普 及推广。 Notomi等开发了一种恒温核酸扩增方法， 即环介导等温扩增法(loop-mediated iso。
9、thermalamplification， LAMP)， 其特点是在等温条件(65左右)下作用60min左右即 可完成核酸扩增反应， 更为重要的是此方法不需要贵重的仪器和试剂， 在水浴锅中就能完 成反应， 特别适合在野外现场和基层部门应用。 近年来， LAMP法已被成功地用于诊断发生于 人类和动物的病毒性疾病， 成为检测多种致病病毒的有效工具。 我们建立了一种运用环介 导等温扩增技术(LAMP)检测猪德尔塔冠状病毒的方法， 用于食品及原料、 环境样本、 进境种 猪血清样品中猪德尔塔冠状病毒的检测。 其技术方案是以猪德尔塔冠状病毒基因组中编码 N段区域基因序列为目的序列， 设计特异性引物， 优化。
10、反应体系， 进行目的基因特异性扩增， 本发明只需一个恒温装置， 不需要模板的热变性、 长时间温度循环， 而且可以直接观察结 果， 具有低成本、 高效率、 操作简单的特点。 0004 本发明建立的猪德尔塔冠状病毒核酸LAMP检测方法具有特异性强、 灵敏度高、 方 便快捷等特点， 可在小型实验基地进行， 为猪德尔塔冠状病毒检测提供了一种新的技术与 方法。 发明内容 0005 为了提高动物疫病检测效率， 节约时间， 以解决传统检测方法无法满足进出口动 物日益增长的现状， 本发明经过实验检测， 终于探索出一种运用环介导等温扩增法检测猪 德尔塔冠状病毒的方法， 该方法具有检测快速、 便捷、 低成本、 适。
11、合在野外现场和基层部门 说明书 1/5 页 3 CN 105861744 A 3 应用等特点。 0006 本发明的目的是提供了一种应用环介导等温扩增法检测猪德尔塔冠状病毒的方 法。 0007 本发明是通过以下技术方案实现的： 0008 一套检验猪德尔塔冠状病毒的引物， 其特征在于： 通过环介导等温扩增技术检测 猪德尔塔冠状病毒的引物组， 序列为： SEQIDNO： 1、 SEQIDNO： 2、 SEQIDNO： 3、 SEQID NO： 4， 上述引物可以检测到至少10个拷贝的猪德尔塔冠状病毒。 0009 上述引物在制备用于检验猪德尔塔冠状病毒的试剂盒中的应用。 0010 一种用于检验猪德尔塔。
12、冠状病毒的试剂盒， 包括： 0011 (1)环介导等温扩增反应试剂， 包括扩增体系中各成分的组成； 0012 (2)按照比例混合SEQIDNO： 1、 SEQIDNO： 2、 SEQIDNO： 3、 SEQIDNO： 4。 0013 (3)阳性标本对照、 阴性标本对照； 0014 (4)使用说明书。 0015 上述试剂盒中还包括SYBRGreenI染料， 加入到产物中可以在紫外灯和日光下观 察反应管颜色变化。 0016 利用上述试剂盒进行环介导等温扩增检测猪德尔塔冠状病毒方法， 包括： 0017 (1)RNA的提取及cDNA的制备 0018 取样本， 将病毒灭活后， 进行反转录反应， 得到cD。
13、NA， -20备用； 0019 (2)猪德尔塔冠状病毒N段基因区的检测 0020 2 LcDNA样品、 5 LBstDNA聚合酶缓冲液(10)、 2 LBstDNA聚合酶(8000U/ L)、 5 LdNTP(10mmol/L)、 3 LBetaine(5mol/L)、 6 LMgSO4(25mmol/L)、 对应于N段基因的 引物如权利要求1所述的SEQIDNO： 1、 SEQIDNO： 2各4 L、 SEQIDNO： 3、 SEQIDNO： 4各0.5 L、 18 LH2O， 混匀； 0021 (3)恒温水浴或热块扩增或任何保温材料6065， 30min90min； 0022 (4)扩增产。
14、物采用荧光染料法同步检测。 0023 上述方法能够检测到至少10个拷贝的猪德尔塔冠状病毒。 0024 该方法在检测食品及原料、 环境样本、 进境种猪血清样品中猪德尔塔冠状病毒方 面的用途。 可以在基层或小型实验基地进行， 同时也可应用于现场检测、 卫生评价等方面。 附图说明 0025 图1N段基因LAMP扩增电泳结果(1， 100bpMarker； 2， N基因； 3， 阴性对照)； 0026 图2N段基因LAMP扩增产物酶切图(1， 100bpMarker； 2， N基因； 3， 酶切结果)； 0027 图3LAMP扩增可见光结果(1， N基因； 2， 阴性对照)； 0028 图4LAMP扩。
15、增紫外光结果(1， N基因； 2， 阴性对照)； 0029 图5N基因检测灵敏度(1， 100bpMarker； 2， 107copies/ L， ； 3， 106copies/ L； 4， 105copies/ L； 5， 104copies/ L； 6， 103copies/ L； 7， 102copies/ L； 8， 101copies/ L9， 100) copies/ L； 0030 图6特异性试验(1， 100bpMarker； 2， 阴性对照； 3， N基因； 4， 猪传染性胃肠炎病毒； 5， 猪流行性腹泻病毒； 6， 猪轮状病毒； 7， 口蹄疫病毒； 8水泡性口炎病毒， )。。
16、 说明书 2/5 页 4 CN 105861744 A 4 具体实施方式 0031 现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本发明。 但是应当理解， 下面的实施例仅仅是作为例证的， 不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。 除非有 其它说明， 本发明的实施例使用本领域中的分子生物学常规技术。 这些技术是技术人员熟 知的， 并在文献中有详细解释。 0032 材料和方法 0033 1.1材料 0034 总RNA提取试剂盒、 DNA提取试剂盒、 BstDNA聚合酶、 M-MULV反转录酶、 RNA酶抑制 剂、 DpnII内切酶购自NEB公司； 质粒小量提取试剂盒、 大肠杆菌TOP10感受态。
17、细胞购自 TIANGEN公司； Betaine(甜菜碱)、 MgSO4购自Sigma公司。 0035 1.2引物的设计与合成 0036 根据登录于GenBank数据库的猪德尔塔冠状病毒N段基因序列， 应用生物学软件进 行序列比对， 在N段基因的保守区设计了2对引物(外引物和内引物)， 引物的合成修饰由英 俊公司完成， 序列见表1。 0037 表1引物和探针序列 0038 0039 1.3RNA的提取及cDNA的制备 0040 取经DEPC水处理过的EP管， 加入1mLTRIzol和200 L病毒液， 混匀后室温放置 5min； 加入200 L氯仿， 用力摇晃30s， 室温静置3min， 4离心。
18、15min， 得到分层液； 取上层液 移入干净的EP管， 加入500 L异丙醇， -20静置30min， 4离心15min； 移去上层悬液； 加入 1mL75的DEPC乙醇， 涡旋振荡， 4离心10min； 去上清， 空气中干燥5min； 向试管中加入50 LDEPC水。 参照M-MuLV反转录酶过程进行反转录， 得到cDNA， -20备用。 0041 1.4阳性重组质粒的构建 0042 利用针对猪德尔塔冠状病毒N段基因的特异性引物， 将cDNA在50 L体系中进行PCR 扩增， 得到的PCR产物纯化后克隆到pGEM-Teasy载体中并转化至大肠杆菌TOP10感受态细 胞中， 从纯化扩增的重组。
19、菌中提取质粒， 进行酶切鉴定， 选取阳性重组质粒进行测序， 从而 为检测提供阳性质粒， 并利用此阳性质粒对LAMP方法进行优化。 0043 1.5猪德尔塔冠状病毒环介导等温扩增方法检测 0044 经过摸索和优化反应条件后， 建立如下扩增反应体系： 2 LcDNA样品、 5 LBst DNA聚合酶缓冲液(10)、 2 LBstDNA聚合酶(8000U/L)、 5 LdNTP(10mmol/L)、 3 L Betaine(5mol/L)、 6 LMgSO4(25mmol/L)、 对应于N段基因的引物FIP和BIP各4 L、 F3和B3各 0.5 L、 18 LH2O。 混匀， 65， 水浴1.5h。
20、。 0045 1.6扩增产物的检测 说明书 3/5 页 5 CN 105861744 A 5 0046 LAMP反应结束后， 取5 L扩增产物进行1.5琼脂糖凝胶电泳； 其余扩增产物采用 荧光染料法同步检测， 向扩增管中加入2 L50倍稀释的SYBRGreenI染料， 在紫外灯和日 光下观察反应管颜色变化。 回收N段基因的阳性产物， 进行酶切鉴定， 反应体系： 8 LN基因回 收产物、 1 LDpnII内切酶、 2 L内切酶缓冲液(10)、 9 LH2O； 混匀， 37， 水浴8h。 同时以N 基因的回收产物为模板进行普通PCR扩增， 扩增产物送上海生工测序。 0047 1.7猪德尔塔冠状病毒。
21、N段基因的检测灵敏度 0048 取阳性质粒DNA， 经紫外分光光度计测定浓度， 10倍系列稀释后， 进行猪德尔塔冠 状病毒N段基因的灵敏度检测试验。 具体试验方案参照LAMP的常规操作程序进行。 0049 1.8特异性试验 0050 分别以猪传染性胃肠炎病毒、 猪流行性腹泻病毒、 猪轮状病毒、 口蹄疫病毒、 水泡 性口炎病毒核酸作为待测样品， 以所提取的猪德尔塔冠状病毒N段基因质粒DNA为阳性对 照， 以经DEPC处理的水为阴性对照， 检验方法的特异性。 0051 实施例1 0052 猪德尔塔冠状病毒N段基因的扩增 0053 取样本， 提取病毒基因组后， 参照M-MuLV反转录酶过程进行反转录。
22、， 得到cDNA， 利 用特异性引物对猪德尔塔冠状病毒N段基因进行扩增， 经扩增后得到S段基因1029bp， 与理 论扩增值相符。 0054 实施例2 0055 猪德尔塔冠状病毒LAMP方法的检测 0056 1.1凝胶电泳结果观察 0057 经过摸索和优化反应条件后， 建立针对猪德尔塔冠状病毒N段基因的LAMP检测方 法， 检测结果如图1所示， N段基因区的扩增结果中核酸电泳条带呈阶梯状分布， 与理论结果 相符， 阴性对照未见特异性产物出现。 0058 1.2扩增产物的酶切鉴定 0059 回收N段基因的阳性扩增产物， 应用DpnII内切酶进行酶切鉴定。 结果如图2所示， N基因经过酶切后电泳结。
23、果为164bp和45bp条带， 与理论结果相符， 未经酶切的阳性扩增产 物仍为阶梯状条带。 0060 1.3染料法结果观察 0061 LAMP方法扩增产物中加入2 L50倍稀释的SYBRGreenI染料， 在紫外灯和日光下 观察反应管颜色变化。 图3所示， N段基因阳性扩增管在可见光下呈黄绿色， 阴性对照为橘红 色。 图4中， N段基因阳性扩增管在紫外光下可见荧光产生， 阴性对照管内无荧光产生。 回收N 段基因的阳性产物， 进行普通PCR扩增后测序得知， 扩增序列与GenBank数据库中的猪德尔 塔冠状病毒N段基因一致， 表明LAMP方法特异性的扩增检测猪德尔塔冠状病毒N段基因。 0062 实。
24、施例3 0063 猪德尔塔冠状病毒N段基因的检测灵敏度 0064 取阳性质粒DNA， 经紫外分光光度计测定浓度， 10倍系列稀释后， 进行猪德尔塔冠 状病毒N段基因的灵敏度检测试验。 图5中所示猪德尔塔冠状病毒N段基因10拷贝以上的稀 释度均显示了典型的LAMP扩增带型， 说明该检测方法的灵敏度可达到10个拷贝的水平。 0065 实施例4 说明书 4/5 页 6 CN 105861744 A 6 0066 特异性试验 0067 分别以猪传染性胃肠炎病毒、 猪流行性腹泻病毒、 猪轮状病毒、 口蹄疫病毒、 水泡 性口炎病毒核酸作为待测样品， 以所提取的猪德尔塔冠状病毒N段基因质粒DNA为阳性对 照。
25、， 以经DEPC处理的水为阴性对照， 检验方法的特异性。 结果如图6所示， 阳性对照和阴性对 照均成立， 以猪德尔塔冠状病毒所构建的质粒DNA呈阳性， 其他试验样品呈阴性， 表明试验 所用引物对猪德尔塔冠状病毒特异性良好。 0068 环介导等温扩增技术(LAMP)是一种新的核酸等温扩增技术， 原理是在目的基因片 段上的多个位点上设计4条或6条引物， 通常只要4条引物即可完成目的基因的扩增， 如果加 入另外两条环引物， 可以有效的加速整个反应过程， 但反应体系内引物的增多也会增加引 物二聚体的形成。 LAMP反应结果判别方法多样， 目前常用的有电泳法、 荧光法、 浊度法和钙 黄绿素法。 浊度法和。
26、钙黄绿素法是基于LAMP反应产生的大量焦磷酸盐副产物进行检测的方 法， 因此这2种方法均存在一定程度的背景干扰， 且干扰强度随反应时间延长而增加； 电泳 法和荧光法利用双链嵌合染料直接检测扩增产物， 因此背景更低， 其中荧光法的阳性、 阴性 可用肉眼区分， 对操作人员的技术要求低， 更适合于现场快速检测。 0069 本文采用LAMP技术建立了检测猪德尔塔冠状病毒核酸的检测方法， 通过与文献报 道的实时荧光RT-PCR法相比较， 两种方法的检测灵敏度相当， 将107复制的病毒量质粒进行 10倍系列稀释后， 应用本文建立的LAMP方法检测灵敏度为10个拷贝； 从检测时间上看LAMP 完成1次检测可。
27、在1.5h内完成， 而实时荧光RT-PCR法则需要3h。 从所需仪器上看实时荧光 RT-PCR需要荧光定量PCR仪， 而LAMP只需恒温水浴锅。 0070 综上所述， 本研究建立的猪德尔塔冠状病毒核酸LAMP检测方法具有特异性强、 灵 敏度高、 方便快捷等特点， 可在基层或小型实验基地进行， 同时也可应用于现场检测、 卫生 评价、 临床诊断等方面， 为猪德尔塔冠状病毒检测提供了一种新的技术与方法。 说明书 5/5 页 7 CN 105861744 A 7 0001 序列表 1/3 页 8 CN 105861744 A 8 0002 序列表 2/3 页 9 CN 105861744 A 9 0003 序列表 3/3 页 10 CN 105861744 A 10 图1 图2 图3 图4 图5 图6 说明书附图 1/1 页 11 CN 105861744 A 11 。