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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610298682.8 (22)申请日 2016.05.06 (71)申请人 北京晋祺生物科技有限公司 地址 100039 北京市海淀区永定路东街甲6 号东轻宾馆写字楼406 (72)发明人 汪大为张井存 (74)专利代理机构 北京世誉鑫诚专利代理事务 所(普通合伙) 11368 代理人 郭官厚 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种CYP4F2*3的检测引物组合物、 试剂盒及 方法 (5。
2、7)摘要 本发明涉及生物检测技术领域， 尤其是涉及 一种CYP4F2*3的检测引物组合物、 试剂盒及方 法， 采用PNAClampLAMP技术， 利用PNA-C封闭 rs2108622的C等位基因， PNA-T封闭rs2108622的 T等位基因， PNA-I封闭高度相似基因CYP4F3， 以 保证扩增的特异性， 从而使得对应的LAMP反应无 法继续， 以此达到CYP4F2*3突变型等位基因检测 的目的， 给华法林的安全使用带来更可靠的保 障。 该发明具有的优点在于该方法步骤简单， 特 异性高， 鉴定简便， 成本低廉， 便于临床检验大范 围普及。 权利要求书2页 说明书7页 序列表3页 附图2。
3、页 CN 105861688 A 2016.08.17 CN 105861688 A 1.一种CYP4F2*3的检测引物组合物， 其特征在于： 包括： 正向外侧引物F3： 5 -ATCAAAACCCTGCCCCCT-3 (SEQIDNo.1)； 反向外侧引物B3： 5 -GGGTCATCCCCAAAGGTG-3 (SEQIDNo.2)； 正向内侧引物FIP： 5 -GGAACCCATCACAACCCAGCTGAGGAGCCTTGGAATGGACA-3 (SEQIDNo.3)； 反向内侧引物BIP： 5 -ATGCCTGTGGGAGAGAAGGGAGAGTCTCCTGGGTAGGAAGAG-3 。
4、(SEQIDNo.4)； 以及 用于封闭rs2108622C等位基因的肽核酸序列PNA-C： 5 -GCCACACAGCTGGGTT-3 (SEQIDNo.5)； 用于封闭rs2108622T等位基因的肽核酸序列PNA-T： 5 -GCCACATAGCTGGGTT-3 (SEQIDNo.6)； 用于封闭CYP4F3的肽核酸序列PNA-I： 5 -ACAATGCTCCCTGCC-3 (SEQIDNo.7)。 2.一种CYP4F2*3的检测试剂盒， 其特征在于： 包括权利要求1所述的引物和肽核酸序 列。 3.根据权利要求2所述的CYP4F2*3的检测试剂盒， 其特征在于： 还包括dNTP、 缓冲液。
5、、 Bst聚合酶和超纯水。 4.根据权利要求3所述的CYP4F2*3的检测试剂盒， 其特征在于： 所述检测试剂盒分为两 个反应体系， 分别记为反应体系C和反应体系T： 反应体系C中包括F3、 B3、 FIP、 BIP、 PNA-C、 PNA-I、 dNTP、 缓冲液、 Bst聚合酶和超纯水； 反应体系T中包括F3、 B3、 FIP、 BIP、 PNA-T、 PNA-I、 dNTP、 缓冲液、 Bst聚合酶和超纯水。 5.根据权利要求4所述的CYP4F2*3的检测试剂盒， 其特征在于： 所述两个反应体系中还 包括用于显示体系颜色的指示剂。 6.根据权利要求5所述的CYP4F2*3的检测试剂盒， 。
6、其特征在于： 所述指示剂为羟基萘酚 蓝。 7.根据权利要求6所述的CYP4F2*3的检测试剂盒， 其特征在于： 所述指示剂在反应体系 C和反应体系T中的浓度相同， 羟基萘酚蓝的浓度为120 M。 8.根据权利要求4所述的CYP4F2*3的检测试剂盒， 其特征在于： 所述两个反应体系中还 包括添加剂， 所述添加剂在两个反应体系中的浓度一致。 9.根据权利要求8所述的CYP4F2*3的检测试剂盒， 其特征在于： 所述添加剂为甜菜碱， 甜菜碱的浓度为0.8M。 10.根据权利要求4-9中任一项所述的CYP4F2*3的检测试剂盒， 其特征在于： 所述两个 反应体系中缓冲液的浓度相同， 其包括： Tri。
7、s-HCl20mM， KCl50mM， (NH4)2SO410mM， MgSO4 4mM， Tween-200.1(体积分数)。 11.根据权利要求4-9中任一项所述的CYP4F2*3的检测试剂盒， 其特征在于： 所述两个 反应体系中： F3的浓度相同， 均为0.4 M； B3的浓度相同， 均为0.4 M； FIP的浓度相同， 均为 1.6 M； BIP的浓度相同， 均为1.6 M； PNA-I的浓度相同， 均为0.4 M； 反应体系C中的PNA-C的 权利要求书 1/2 页 2 CN 105861688 A 2 浓度和反应体系T中PNA-T的浓度相同， 均为0.4 M。 12.根据权利要求4。
8、-9中任一项所述的CYP4F2*3的检测试剂盒， 其特征在于： 两个反应 体系中dNTP的浓度相同， 均为1.4mM； 两个反应体系中Bst聚合酶的浓度相同， 均为8U。 13.一种CYP4F2*3的检测方法， 使用权利要求3-12任一所述的检测试剂盒， 其特征在 于： 包括如下步骤： (1)抽取静脉血以EDTA抗凝管保存； (2)用DNA提取试剂盒提取全基因组DNA或直接以全血作为待检测的模板， 以超纯水代 替模板做阴性对照； (3)采用PNAClampLAMP技术， 进行LAMP反应， 将模板和超纯水分别加入到反应体系C 和反应体系T中， 于65下反应， 然后升温至80保持20min进行酶。
9、灭活处理， 之后降温， 观 察体系颜色变化。 14.根据权利要求13所述的CYP4F2*3的检测方法， 其特征在于： 所述反应时间为60 80min。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105861688 A 3 一种CYP4F2*3的检测引物组合物、 试剂盒及方法 技术领域 0001 本发明属于生物检测技术领域， 尤其是涉及一种CYP4F2*3的检测引物组合物、 试 剂盒及方法。 背景技术 0002 华法林， 是一种香豆素类抗凝剂， 作为临床应用最为广泛的抗凝药物之一， 具有价 格低廉， 小剂量即可起效等优点， 主要用于防治静动脉血栓栓塞性疾病， 适用患者人群为心 脏瓣膜置换、 房颤、 深静。
10、脉血栓和肺栓塞患者。 但是， 目前在临床上， 华法林的用药面临一个 严重的问题， 即华法林的给药剂量非常难以掌握， 剂量不足会导致体内血栓的产生， 而剂量 稍大则会加大出血的倾向。 0003 目前， 国内外临床工作者们多采用定期监测国际标准化比值(INR)和凝血酶原时 间(PT)两种手段监测华法林的临床药效。 而近年来， 对于华法林药效学影响因素的研究热 点则主要集中在遗传药物基因组学方面这个研究领域。 由于华法林的抗凝作用主要由S-华 法林产生， 而S-华法林的体内代谢主要是由细胞色素P450酶超家族中的CYP2C9完成, CYP2C9可以催化人体内的华法林成为无活性形式6-或7-羟基华法林。
11、， 所以CYP2C9的活性对 华法林的抗凝治疗效果有着十分重要的影响。 除此之外， 另外一种等位基因CYP4F2的遗传 多态性与华法林剂量也有不可忽视的关联。 CYP4F2*3(rs2108622CT， V433M)可导致细胞色 素药物酶活性降低， 相反患者体内维生素K的浓度会增高， 所以携带这种突变型等位基因的 患者在使用华法林时， 体内出血风险与野生型等位基因携带者相比会大大增高。 因此， 临床 上在使用华法林进行治疗的过程中， 对于CYP4F2*3突变型等位基因的检测， 会给华法林的 安全使用带来更可靠的保障。 0004 目前， 临床及市场上针对CYP4F2的突变型等位基因检测已经有了商。
12、品化的试剂 盒， 这些试剂盒所采用的技术主要包括Taqman-MGB荧光探针法、 液相芯片法、 一代测序法和 二代测序法。 这些技术手段均在不同方面展现出了自己的优势， 但是也都普遍存在检测仪 器及配套试剂耗材购买成本高昂， 检测周期长、 操作繁琐且假阳性率时有出现的问题。 因 此， 发明并构建一套价格低廉， 使用操作简便且利于临床检验大范围普及的商品化试剂盒 就显得十分重要。 环介导的等温扩增(LAMP)技术是日本科学家于2000年提出的一种等温扩 增技术， 其主要特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物， 在链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)的作用下进行恒温扩增， 。
13、仅需15-90分钟即可产生109-1010数量级的产物， 具有敏感性高、 特异性好、 操作简便、 成本低廉且结果易于判定的优点。 0005 LAMP法具有操作简单， 特异性强和成本低廉的优点。 目前LAMP法较多用于病原体 和其他一些微生物的检测中， 虽然对于使用LAMP法进行基因突变的检测也偶见报道， 但这 些等位基因特异性引物的LAMP法在实际的应用中很不稳定， 因此在市场上还没有以LAMP法 为基础的基因突变检测试剂盒出售。 肽核酸(PNA)是具有类多肽骨架的DNA类似物， 骨架是 由N(2-氨基乙基)-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的。 PNA可以特异性地与DNA 或RNA杂交。
14、， 形成稳定的复合体。 当PNA与靶序列完全互补时， 这种复合体的稳定性要远远高 说明书 1/7 页 4 CN 105861688 A 4 于普通的DNA-DNA、 DNA-RNA及RNA-RNA的双链结构。 然而， 当PNA与靶序列不完全配对甚至只 有一个碱基错配的时候， 这种PNA-DNA复合物就变得非常不稳定， 很容易打开双链。 发明内容 0006 本发明要解决的技术问题是现有的CYP4F2*3突变型等位基因的检测存在费用高， 检测周期较长， 操作繁琐且假阳性率时有出现等问题， 不利于临床检验大范围普及。 0007 为解决上述问题， 本发明采用PNAClampLAMP技术， 利用PNA-。
15、C封闭rs2108622的C 等位基因， PNA-T封闭rs2108622的T等位基因， PNA-I封闭高度相似基因CYP4F3， 从而使得相 应的LAMP反应无法继续， 以此实现CYP4F2*3突变型等位基因的检测， 该方法既快速灵敏又 成本低廉， 可给华法林的安全使用带来更可靠的保障。 0008 本发明的第一个目的在于提供一种CYP4F2*3的检测引物组合物， 包括： 0009 正向外侧引物F3： 0010 5 -ATCAAAACCCTGCCCCCT-3 (SEQIDNo.1)； 0011 反向外侧引物B3： 0012 5 -GGGTCATCCCCAAAGGTG-3 (SEQIDNo.2)。
16、； 0013 正向内侧引物FIP： 0014 5 -GGAACCCATCACAACCCAGCTGAGGAGCCTTGGAATGGACA-3 (SEQIDNo.3)； 0015 反向内侧引物BIP： 0016 5 -ATGCCTGTGGGAGAGAAGGGAGAGTCTCCTGGGTAGGAAGAG-3 (SEQIDNo.4)； 以及 0017 用于封闭rs2108622C等位基因的肽核酸序列PNA-C： 0018 5 -GCCACACAGCTGGGTT-3 (SEQIDNo.5)； 0019 用于封闭rs2108622T等位基因的肽核酸序列PNA-T： 0020 5 -GCCACATAGCTG。
17、GGTT-3 (SEQIDNo.6)； 0021 用于封闭CYP4F3的肽核酸序列PNA-I： 0022 5 -ACAATGCTCCCTGCC-3 (SEQIDNo.7)。 0023 本发明的第二个目的在于提供一种CYP4F2*3的检测试剂盒， 所述检测试剂盒包括 上述的引物和肽核酸序列。 0024 进一步地， 所述检测试剂盒中还包括dNTP、 缓冲液、 Bst聚合酶和超纯水。 0025 进一步地， 所述检测试剂盒分为两个反应体系， 分别记为反应体系C和反应体系T： 0026 反应体系C中包括F3、 B3、 FIP、 BIP、 PNA-C、 PNA-I、 dNTP、 缓冲液、 Bst聚合酶和超。
18、纯 水； 反应体系T中包括F3、 B3、 FIP、 BIP、 PNA-T、 PNA-I、 dNTP、 缓冲液、 Bst聚合酶和超纯水。 0027 进一步地， 所述两个反应体系中还包括用于显示体系颜色的指示剂。 0028 优选地， 所述指示剂为羟基萘酚蓝。 0029 优选地， 所述指示剂在反应体系C和反应体系T中的浓度相同， 羟基萘酚蓝的浓度 为120 M。 0030 进一步地， 所述两个反应体系中还包括添加剂， 所述添加剂在两反应体系中的浓 度一致。 0031 优选地， 所述添加剂为甜菜碱， 甜菜碱的浓度为0.8M。 0032 优选地， 所述两个反应体系中缓冲液的浓度相同， 其包括： Tris。
19、-HCl20mM， KCl 说明书 2/7 页 5 CN 105861688 A 5 50mM， (NH4)2SO410mM， MgSO44mM， Tween-200.1(体积分数)。 0033 优选地， 所述两个反应体系中： F3的浓度相同， 均为0.4 M； B3的浓度相同， 均为0.4 M； FIP的浓度相同， 均为1.6 M； BIP的浓度相同， 均为1.6 M， PNA-I的浓度相同， 均为0.4 M； 反应体系C中的PNA-C的浓度和反应体系T中PNA-T的浓度相同， 均为0.4 M。 0034 优选地， 两个反应体系中dNTP的浓度相同， 均为1.4mM； 两个反应体系中Bst聚。
20、合酶 的浓度相同， 均为8U。 0035 本发明的第三个目的在于提供一种CYP4F2*3的检测方法， 其使用上述的检测试剂 盒， 包括如下步骤： 0036 (1)抽取静脉血以EDTA抗凝管保存； 0037 (2)用DNA提取试剂盒提取全基因组DNA或全血直接作为待检测的模板， 同时以超 纯水代替模板做阴性对照； 0038 (3)采用PNAClampLAMP技术， 进行LAMP反应， 将模板和超纯水分别加入到反应体 系C和反应体系T中， 于65下反应， 然后升温至80保持20min进行酶灭活处理， 之后降温， 观察体系颜色变化。 0039 进一步地， 所述反应时间为6080min。 0040 在。
21、本发明的两个反应体系中， 当反应体系中存在指示剂时， 选用羟基萘酚蓝作为 指示剂时， 反应前体系中的镁离子与dNTP螯合， 体系呈现紫罗兰色； 当有阳性反应时， 镁离 子与副产物焦磷酸形成沉淀， 溶液pH发生改变， 颜色逐渐由紫罗兰色变为天蓝色。 因此， 观 察反应体系颜色的变化就可以直接判定是否发生扩增反应。 0041 本发明具有的优点和积极效果是： 0042 本发明采用PNAClampLAMP技术， 将PNA与LAMP法结合， 利用PNA将相应的等位基 因 “封闭” ， 从而使得LAMP反应无法继续； 而当检测样本中存在另外一个或者几个等位基因 时， PNA由于不能有效对其进行 “封闭” 。
22、， 使得LAMP反应得以顺利进行， 以此达到CYP4F2基因 分型检测的目的。 0043 与现有技术相比， PNAClampLAMP法具有如下有益效果： 0044 (1)步骤简单： LAMP法本身对模板的要求并不严格， 其反应模板甚至可以是DNA的 粗提物， 只需反应体系配置完毕后放置在恒温水浴锅中进行反应扩增即可， 不需要预先进 行双链DNA的变性及类似于PCR循环反应中的反复变性、 退火、 延伸等变温过程； 0045 (2)高特异性： 多条引物共同参与反应， 相较于普通PCR具有很高的特异性； 0046 (3)扩增反应快速、 高效： 整个扩增2h内即可完成， 且产率高； 0047 (4)鉴。
23、定简便： 反应完成后通过肉眼观察颜色变化即可判定结果， 结果的观察可以 脱离凝胶成像的操作要求和仪器限制； 0048 (5)成本低廉： 整个检测反应仅需要水浴锅就可开展， 无需任何其他检测设备。 附图说明 0049 图1-图3分别是检测样本M1-M3用PCR测序分型得到的测序图谱。 具体实施方式 0050 为了更好的理解本发明， 下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明， 但 说明书 3/7 页 6 CN 105861688 A 6 不限定本发明的保护范围。 0051 一种CYP4F2*3的检测引物组合物， 包括： 0052 正向外侧引物F3： 0053 5 -ATCAAAACCCTGCC。
24、CCCT-3 (SEQIDNo.1)； 0054 反向外侧引物B3： 0055 5 -GGGTCATCCCCAAAGGTG-3 (SEQIDNo.2)； 0056 正向内侧引物FIP： 0057 5 -GGAACCCATCACAACCCAGCTGAGGAGCCTTGGAATGGACA-3 (SEQIDNo.3)； 0058 反向内侧引物BIP： 0059 5 -ATGCCTGTGGGAGAGAAGGGAGAGTCTCCTGGGTAGGAAGAG-3 (SEQIDNo.4)； 以及 0060 用于封闭rs2108622C等位基因的肽核酸序列PNA-C： 0061 5 -GCCACACAGCTGG。
25、GTT-3 (SEQIDNo.5)； 0062 用于封闭rs2108622T等位基因的肽核酸序列PNA-T： 0063 5 -GCCACATAGCTGGGTT-3 (SEQIDNo.6)； 0064 用于封闭CYP4F3的肽核酸序列PNA-I： 0065 5 -ACAATGCTCCCTGCC-3 (SEQIDNo.7)。 0066 一种CYP4F2*3的检测试剂盒， 所述检测试剂盒包括上述的引物和肽核酸序列， 还 包括dNTP、 缓冲液、 Bst聚合酶、 超纯水、 羟基萘酚蓝和甜菜碱。 0067 所述检测试剂盒分为两个反应体系， 分别为检测rs2108622C等位基因的反应体系 C和检测rs2。
26、108622T等位基因的反应体系T。 反应体系C中包括F3、 B3、 FIP、 BIP、 PNA-C、 PNA- I、 dNTP、 缓冲液、 Bst聚合酶、 超纯水、 羟基萘酚蓝和甜菜碱； 反应体系T中包括F3、 B3、 FIP、 BIP、 PNA-T、 PNA-I、 dNTP、 缓冲液、 Bst聚合酶、 超纯水、 羟基萘酚蓝和甜菜碱。 0068 两反应体系中各组分的浓度可按正常LAMP反应的浓度设置， 作为一种实施方案， 两个反应体系中： F3的浓度相同， 均为0.4 M； B3的浓度相同， 均为0.4 M； FIP的浓度相同， 均 为1.6 M； BIP的浓度相同， 均为1.6 M； PN。
27、A-I的浓度相同， 均为0.4 M； 反应体系C中的PNA-C 的浓度和反应体系T中PNA-T的浓度相同， 均为0.4 M； dNTP的浓度相同， 均为1.4mM； Bst聚合 酶的浓度相同， 均为8U； 缓冲液的浓度相同， 均包括： Tris-HCl20mM， KCl50mM， (NH4)2SO4 10mM， MgSO44mM， Tween-200.1(体积分数)； 羟基萘酚蓝的浓度相同， 均为120 M； 甜菜碱 的浓度相同， 均为0.8M。 0069 一种CYP4F2*3的检测方法， 使用上述的检测试剂盒， 具体为： 抽取静脉血以EDTA抗 凝管保存； 用DNA提取试剂盒提取全基因组DN。
28、A作为待检测的模板， 以超纯水代替模板做阴 性对照； 采用PNAClampLAMP技术， 进行LAMP反应， 将模板和超纯水分别加入到反应体系C 和反应体系T中， 于65下反应， 然后升温至80保持20min进行酶灭活处理， 之后降温， 观 察体系颜色变化。 作为优选， 所述反应时间为6080min。 0070 具体实施时， 抽取3人1ml静脉血以EDTA抗凝管保存， 每管取200ul血液， 用全式金 或者其它公司的DNA提取试剂盒， 参照试剂盒说明书提取全基因组DNA作为待检测的模板， 分别标记为M1、 M2和M3， 另有一以超纯水代替模板的阴性对照， 记为M4； 对模板采用PNA Clam。
29、pLAMP技术， 进行LAMP反应， 分为两组反应体系， 一组针对C等位基因的反应体系C， 另 一组为针对T等位基因的反应体系T， 两个反应体系中的指示剂均为羟基萘酚蓝， 添加剂均 说明书 4/7 页 7 CN 105861688 A 7 为甜菜碱； 将模板Mn(n为组别编号， 1-4)分别加入到反应体系C和反应体系T中， 得到反应体 系C和T， 模板Mn在两反应体系中的浓度一致， 均为40ng/ L(实际操作中可以是8-100ng/ L 均可)， 两个反应体系反应时， 于65下反应70min， 之后升温至80保持20min进行灭活处 理， 之后降温， 观察体系颜色变化。 0071 利用检测试。
30、剂盒对模板Mn进行检测， 作为一种实施方式， 检测试剂盒的两个反应 体系各为25 L， 其内的组分和含量如下表1和表2所示： 0072 表1反应体系C的组分和含量 0073 0074 0075 表2反应体系T的组分和含量 说明书 5/7 页 8 CN 105861688 A 8 0076 0077 反应按照上述的检测方法进行， 反应前， 体系颜色均为紫罗兰色， 反应后， 各组别 反应体系的颜色及基因型判断如下表3所示： 0078 表3各组别反应体系的颜色及基因型判断 0079 0080 由上表可知， 编号为3的样本反应体系C和反应体系T均变为天蓝色， 证明两个反应 说明书 6/7 页 9 CN。
31、 105861688 A 9 体系中均发生阳性反应， 表明编号为3的样本在rs2108622位点处基因型为CT； 编号为1的样 本则是反应体系T保持紫罗兰色， 反应体系C变为天蓝色， 判定为TT基因型； 编号为2的样本 则是反应体系C保持紫罗兰色， 反应体系T变为天蓝色， 判定为CC基因型。 0081 为进一步验证反应的准确性， 将上述3个实验组别的模板M1-M3分别用PCR测序法 进行分型， 得到的测序图谱参见图1-图3。 0082 对比基因测序图谱和本发明提供的检测试剂盒的检测结果可知， 二者的检测吻合 率100， 验证了本发明的结果精确。 0083 以上对本发明的实施例进行了详细说明， 但所述内容仅为本发明的较佳实施例， 不能被认为用于限定本发明的实施范围。 凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等， 均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。 说明书 7/7 页 10 CN 105861688 A 10 0001 序列表 1/3 页 11 CN 105861688 A 11 0002 序列表 2/3 页 12 CN 105861688 A 12 0003 序列表 3/3 页 13 CN 105861688 A 13 图1 图2 说明书附图 1/2 页 14 CN 105861688 A 14 图3 说明书附图 2/2 页 15 CN 105861688 A 15 。