技术领域
本发明涉及阿胶在制备促细胞分裂繁殖、抗凋亡的细胞培养物中的应用，属于生物试剂领域。
背景技术
阿胶是一味传统中药，味甘，性平，质润无毒，两千多年来一直被公认为补血圣药，具有滋阴补血，润燥止血的功效。阿胶主要由黑驴皮熬制而成，基本成分为胶原蛋白的降解产物，含有18种氨基酸总量可达75％，其中包括8种人体必需氨基酸。在人体消化道内阿胶中的各种蛋白短肽及氨基酸，与微量元素相互结合，相互作用能产生多种酶，激素，维生素等功能性分子，最终起到独特的滋补和保键作用。阿胶的成份十分复杂，主要活性成份未知，因此采用科学有效的方法来证明阿胶的药用功能及作用机制具有十分重大的意义。
目前，在生物领域的科学研究都要进行大量的细胞实验，而细胞的生长状态决定了细胞各项实验数据的质量以及实验的精确性，因为不同的细胞状态下得到的实验结果会有较大偏差。所以在进行细胞实验时首先要保证细胞的生长状态，尤其一些体外比较难养的细胞及一些易分化的细胞。例如，生物科研领域经常分离原代细胞进行实验，而离体的原代细胞在体外的培养条件下生长缓慢且细胞状态很差，又如像RAW264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)这样的免疫细胞在体外培养的条件下随着传代次数的增加极易分化。
细胞培养基是人工模拟细胞在体内生长的营养环境，是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。粉剂时，多称为培养基，而将粉剂配成液体后，多称为培养液。培养液中常常补加血清、抗生素等成分。培养基主要包括天然细胞培养基、合成细胞培养基和无血清细胞培养基等。天然细胞培养基是人们早期采用的细胞培养基，直接取自于动物组织提取液或体液，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。营养价值高，但成分复杂，差异大、不稳定，来源也受到限制。合成细胞培养基是用化学成分明确的试剂配制的培养基，组分稳定，主要包括糖类、必需氨基酸、维生素、无机盐类等。自1950年199细胞培养基问世以来，合成细胞培养基发展至今已有几十种，除了沿用半个世纪的基础合成细胞培养基之外，近年来还出现了营养成分更加丰富的低血清细胞培养基。但由于天然培养基的一些营养成分不能被合成细胞培养基完全代替，因此一般需在合成细胞培养基中添加5％～10％的胎牛血清。胎牛血清的加入对细胞培养非常有效，但胎牛血清的成分复杂，这对培养产物的分离纯化和检测会带来一定的不便，为减少胎牛血清的影响，本发明将阿胶用于细胞体外培养的研究，开发一种新型的低血清或无血清细胞培养基。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供阿胶在制备促细胞分裂繁殖、抗凋亡的细胞培养物中的应用。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种新型的低血清或无血清培养基。
为是实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
阿胶在制备促细胞分裂繁殖、抗凋亡的细胞培养物中的应用。
阿胶在制备促细胞分裂繁殖的细胞培养物中的应用。
阿胶在制备抗凋亡的细胞培养物中的应用。
本发明首次发现了阿胶具备抗细胞凋亡的作用。阿胶能提供细胞抵抗外界不良环境的能力，即在有H2O2凋亡诱导剂的存在下能为细胞提供保护作用，极大降低细胞的死亡数。
我们研究发现，阿胶能在体外培养的条件下为细胞分裂繁殖提供营养物质，在短期培养条件下可以完全替代血清在细胞培养中的作用。实验显示，在无胎牛血清的情况下，阿胶短期培养物组的细胞数及细胞分裂繁殖能力与完全培养基处理组的相当。而长时间培养2％低剂量血清饥饿处理时,我们发现饥饿处理组的细胞在培养到第15天时，失去了分裂繁殖能力并且细胞数急剧下降,然而阿胶长期培养物组的细胞数及细胞分裂繁殖能力与完全培养基处理组的相当。这说明在体外长时间培养的条件下阿胶也能为细胞提供营养物质，进而能促进细胞的分裂繁殖。
所述培养物为培养基或培养液。
所述阿胶在培养物中的浓度为50～1000ug/ml。该浓度也指固态培养基在配制成培养液后使用状态时的阿胶浓度。
优选的，所述阿胶在培养物中的浓度为200～500ug/ml。
最优选的，所述阿胶在培养物中的浓度为300ug/ml。
一种短期细胞培养物，每500ml培养物由以下含量的成分组成:
DMEM培养基494.5ml；
1％PS(双抗)5ml；
阿胶500ul；
其中阿胶的浓度为50～1000mg/ml；优选200～500mg/ml，最优选300mg/ml。
一种长期细胞培养物，其特征在于，每500ml培养物由以下含量的成分组成:
其中阿胶的浓度为50～1000mg/ml；优选200～500mg/ml，最优选300mg/ml。
所述阿胶采用如下方法制备：将阿胶成品磨成小碎块，用PBS溶液溶解，用高压灭菌锅在121℃，高压灭菌30min；将灭菌后的阿胶液用PBS溶液配制成使用浓度，低速(800转/分钟)离心5min，去除上层的油脂和杂质，4℃保存。
本发明的细胞短期培养物/长期培养物(包括培养基或培养液)的保存在4℃冰箱，其中DMEM是一种广泛使用的基础培养基支持许多不同的哺乳动物细胞的生长。此促进剂可以满足大量细胞生长繁殖所必须的营养物质。能在体外培养的条件下持续为细胞提供营养物质保证细胞正常的生长繁殖。此促进剂已能满足大部分常见细胞的体外培养，对于及特殊难培养的细胞建议采用长期培养物培养或加入该细胞特殊需要的营养物质。
本发明验证了阿胶短期培养物对细胞生长繁殖的影响及阿胶长期培养物能促进细胞分裂的作用，并首次发现了阿胶培养物的抗凋亡作用。实验结果显示，阿胶能在体外培养的条件下为细胞分裂繁殖提供营养物质，在短期培养条件下可以替代血清在细胞培养中的作用。阿胶能提供细胞抵抗外界不良环境的能力，即在有H2O2凋亡诱导剂存时能为细胞提供保护作用大大降低细胞的死亡数。
本发明证明了阿胶在未知生物领域的应用价值和应用前景及潜在的抗凋亡作用，它也能替代胎牛血清为体外培养的细胞提供分裂繁殖所需要的营养物质。本发明解决了细胞培养过程中的常见问题，改善体外培养的细胞状态同时降低了昂贵胎牛血清使用量，从产业角度解决胎牛血清的生产压力，为体外细胞培养提供新的培养思路。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。其目的在于更好的理解本发明的内容并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1A是ATP检测结果，此结果表示在体外，RAW264.7细胞在短期培养条件下不同培养体系中细胞存活率。
图1B-1至图1B-4是明场显微镜下的结果，此结果表示在体外RAW264.7细胞在短期培养条件下不同培养体系中细胞密度；图1B-1Normal为正常培养的Control组，图1B-2为培养基中无血清培养组，图1B-3为培养基中含30ug/ml阿胶，图1B-4为培养基中含300ug/ml阿胶。
图2是体外长时间培养条件下的RAW264.7细胞的生长曲线。
图3A和图3B为体外正常培养条件下，阿胶能为RAW264.7细胞提供保护作用进而抵抗H2O2所引起的凋亡作用。
具体实施方式
本发明所用阿胶由山东东阿阿胶有限公司提供；首先将阿胶成品块利用机械外力磨成小碎块，用PBS进行溶解，利用高压灭菌锅进行常规的高压灭菌(121℃，灭菌30分钟)，此过程的主要目的是使阿胶块充分溶解且灭菌后的阿胶液能直接用于细胞培养。将灭菌后的阿胶液用PBS配置成300mg/ml的储存液，低速(800rpm/min)离心5min，去除上层的油脂和杂质。配好的阿胶储存液(浓度300mg/ml)放在4℃保存。在进行细胞培养时预先在37℃预热，我们实验数据表明阿胶最好作用的工作浓度为300ug/ml。
DMEM培养基：购于Gibco公司，为常用的DMEM培养基
实施例1.阿胶短期细胞培养物1
培养液由以下含量的成份组成，总体积为500ml，培养液中阿胶终浓度为300ug/ml。
DMEM培养基 494.5ml；
1％PS(双抗) 5ml；
阿胶(储存液浓度为300mg/ml) 500ul。
实施例2.阿胶短期培养物2
培养液由以下含量的成份组成，总体积为500ml，培养液中阿胶终浓度为30ug/ml。
DMEM培养基 494.95ml；
1％PS(双抗) 5ml；
阿胶(储存液浓度为300mg/ml) 50ul。
实施例3.阿胶长期细胞培养物1
培养液由以下含量的成份组成，总体积为500ml，培养液中阿胶终浓度为30ug/ml。
实施例4.阿胶长期细胞培养物2
培养液由以下含量的成份组成，总体积为500ml，培养液中阿胶终浓度为300ug/ml。
实施例5
一、材料和试剂：
1.RAW264.7细胞，购于国家实验细胞资源共享平台(北京协和医学院)
2.DMEM培养基：购于Gibco公司，为DMEM培养基
3.DMEM完全培养基：DMEM培养基，10％FBS(胎牛血清)，1％PS(Penicillin-Streptomycin,青链霉素(双抗),Gibco)
4.2％低剂量血清培养基：DMEM培养基，2％FBS,1％PS。
5.无血清培养基：DMEM培养基，1％PS。
6.阿胶短期培养物1：DMEM培养基，300ug/ml阿胶，1％PS；(实施例1)
7.阿胶短期培养物2：DMEM培养基，30ug/ml阿胶，1％PS；(实施例2)
8.阿胶长期培养物1：DMEM培养基，2％FBS，30ug/ml阿胶，1％PS；(实施例3)。
9.阿胶长期培养物2：DMEM培养基，2％FBS，300ug/ml阿胶，1％PS；(实施例4)。
10.0.55mM H2O2诱导凋亡培养基：DMEM培养基，10％FBS，1％PS，终浓度0.5mM H2O2。
11.阿胶处理培养基：DMEM培养基，10％FBS，1％PS，0.5mM H2O2，阿胶(不同浓度组的阿胶浓度分别为0.3ug/ml；3ug/ml；30ug/ml；300ug/ml)。
12.ATP检测试剂：购于Promega公司(货号：G7571)
二、方法
1、体外短期培养对细胞生长繁殖的影响
(1)将培养在37℃，5％CO2孵箱中的RAW264.7细胞进行传代处理，此细胞培养在完全培养基中，用DMEM培养基进行吹打，将细胞制备成均一的细胞悬液。
(2)利用血细胞计数板进行计数，将RAW264.7细胞，以5×104的细胞数种入60mm的细胞培养板中进行培养，待细胞正常贴壁后将细胞培养基更换成各组的培养基分别培养：
A.正常细胞培养组(Normal)：使用DMEM完全培养基培养
B.无血清处理组(-FBS)：使用无血清培养基培养
C.阿胶短期培养物组1：使用阿胶短期培养物1培养
D.阿胶短期培养物组2：使用阿胶短期培养物2培养
(3)在培养48小时后进行ATP assay检测的细胞存活率，向相应处理组培养板中加入600ul ATP检测试剂，室温条件下摇床上避光孵育10min。
(4)将不同处理组分别吸出3份样品即3个重复，每份100ul到检测化学发光的白板中，进而判定正常细胞培养组，无血清处理组，两个浓度的阿胶短期培养物组对细胞生长繁殖的影响。
(5)该实验独立进行3次，利用GraphPad Prism 6.0进行统计，统计结果以mean±SEM表示。
2、体外长期培养促进细胞分裂的作用
(1)将培养在37℃，5％CO2孵箱中的RAW264.7细胞进行传代处理，此细胞培养在DMEM培完全培养基中，用DMEM培养基进行吹打，将细胞制备成均一的细胞悬液。
(2)利用血细胞计数板进行计数，将RAW264.7细胞，以1×106的细胞数种入10cm细胞培养板中进行培养，待细胞正常贴壁后将细胞培养基分别更换成各组相应的培养基继续培养：
A.正常培养组(Normal):用DMEM完全培养基培养
B.2％低剂量血清培养组：使用2％低剂量血清培养基培养
C.阿胶长期培养物组1：使用阿胶长期培养物1培养
D.阿胶长期培养物组2：使用阿胶长期培养物2培养
(3)继续培养，3天后待细胞密度达到90％的汇合度时进行细胞传代，利用常规的血细胞计数板进行细胞计数，每组细胞进行3次重复计数然后取平均值。统计每组的计数结果，再将RAW264.7细胞以1×106的细胞数种入10cm培养板继续进行培养，连续培养24天，进行8次传代，最终绘制细胞的生长曲线。
(4)从而对比长期培养条件下，不同处理组RAW264.7细胞的生长状态及细胞数及细胞分裂繁殖能力。
3、阿胶培养物抗细胞凋亡作用
将正常培养在10cm培养板中的RAW264.7细胞，弃去旧培养液，利用2ml完全培养基用移液枪吹成细胞悬液，以2×104的细胞数种入24孔板中，待细胞12小时贴壁后将细胞培养基按组更换成相应的培养基，继续培养24小时：
A.正常培养组(non):用DMEM完全培养基培养
B.H2O2诱导凋亡组:用0.55mM H2O2诱导凋亡培养基。
C.不同剂量阿胶处理组:用阿胶处理培养基培养，分为4组，各组的阿胶浓度分别为0.3ug/ml、3ug/ml、30ug/ml、300ug/ml。
(2)用CytoToxNon-Radioactive Cytotxicity Assay(promega)的LDH assay检测不同处理组细胞的死亡情况，具体实验过程参照说明书进行。
三、实验结果
1、体外短期培养对细胞生长繁殖的影响
图1A为ATP检测结果，此结果表示在体外，RAW264.7细胞在短期培养条件下不同培养体系中细胞存活率。
图1B-1至图1B-4是明场显微镜下的结果，此结果表示在体外RAW264.7细胞在短期培养条件下不同培养体系中细胞密度。
从实验结果我们可以看出300ul/ml阿胶短期培养促进剂组细胞的生存率与完全培养基处理组的细胞数相当，此部分实验结果说明在体外培养的条件下阿胶能为细胞提供营养物质，进而能促进细胞的分裂繁殖，且可以在短期培养条件下替代昂贵血清在细胞培养中的作用。以上结果可以证明在短时间的培养条件下阿胶能为细胞提供营养物质促进细胞的分裂繁殖。
2、在体外长期培养促进细胞分裂的作用
图2是阿胶培养物在体外长时间培养条件下的RAW264.7细胞的生长曲线。
实验结果显示300ug/ml阿胶长期培养物组，在2％低剂量血清的情况下，细胞的分裂繁殖能力及细胞数与完全培养基处理组的相当，而2％低剂量血清培养组(2％FBS)的细胞在培养到第15天时失去分裂能力且细胞数急剧下降。此部分实验结果说明在体外长时间培养的条件下阿胶能为细胞提供营养物质，进而能促进细胞的分裂繁殖。
3、阿胶培养物抗细胞凋亡作用
图3A显示在正常培养条件下，阿胶的加入不会对细胞造成基础层面的损伤，即不同剂量阿胶处理组与正常培养组(non)一样未发生细胞的死亡。而0.55mM H2O2能诱导细胞凋亡。
图3B显示0.55mM H2O2刺激组能诱导细胞发生凋亡即发生大量的细胞死亡，而0.55mM H2O2加不同剂量的阿胶处理组能降低这种凋亡诱导带来的损伤，即阿胶能为细胞提供保护作用大大降低了H2O2刺激引起的细胞死亡数。体外正常培养条件下，阿胶能为RAW264.7细胞提供保护作用进而抵抗H2O2所引起的凋亡作用。
因此本发明
1.阿胶能在体外培养的条件下为细胞分裂繁殖提供营养物质，在短期培养条件下可以替代血清在细胞培养中的作用。
2.阿胶能提供细胞抵抗外界不良环境的能力，即在有H2O2凋亡诱导剂存在时能为细胞提供保护作用大大降低细胞的死亡数。