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1、(10)授权公告号 CN 101643746 B (45)授权公告日 2011.09.21 CN 101643746 B *CN101643746B* (21)申请号 200910102071.1 (22)申请日 2009.08.25 C12N 15/82(2006.01) A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市浙大路 38 号 (72)发明人 黄新 舒小丽 蒋永清 刘新华 叶红霞 吴殿星 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 韩介梅 US 7449617 B2,2008.11.11, 全文 . CN。
2、 101283673 A,2008.10.15, 全文 . 顾垒 等 . 转基因苜蓿研究的现状和前 景 .草原与草坪 .2004,( 第 1 期 ),17-21. 周兴龙 等 . 苜蓿转基因研究进展 .重庆 大学学报 ( 自然科学版 ) .2005, 第 28 卷 ( 第 4 期 ),126-130. (54) 发明名称 一种耐热紫花苜蓿的转基因培育方法 (57) 摘要 本发明涉及一种耐热紫花苜蓿的转基因培育 方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 取主栽紫花苜 蓿品种的子叶为外植体， 诱导愈伤组织， 继代培养 至快速增殖期， 暗条件预培养， 进行农杆菌共培养 转化， 转移到筛选培养基进行 3 轮。
3、筛选， 取抗性愈 伤组织诱导分化成苗， 对抗性植株进行组织化学 染色和分子检测， 鉴定含目的基因的分化小苗， 对 入选的转基因植株进行耐热性鉴定， 选留不受热 害、 生长良好的转基因植株， 继续种植室内外评价 验证耐热性的表达稳定性， 对稳定的优良株系进 行种子繁殖， 培育能正常越夏的耐热紫花苜蓿。 本 发明的耐热紫花苜蓿， 更适合在我国南方种植， 增 加优质饲草的供应。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 彭郁葱 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 CN 101643746 B1/1 页 2 1. 一种耐热紫花苜蓿的转基因。
4、培育方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 1) 取主栽紫花苜蓿品种的子叶为外植体， 接种至诱导培养基， 在 25光条件下诱导形 成愈伤组织 ； 2) 取诱导形成 2 周的愈伤组织， 转移至继代培养基， 继代培养至愈伤组织进入快速增 殖期 ； 3) 取快速增殖的愈伤组织， 在 25暗条件下进行受体愈伤组织预培养 3 天 ； 4) 取预培养的愈伤组织， 在农杆菌悬浮液中浸泡 15 分钟， 之后弃去菌液， 用无菌滤纸 吸干， 接种于共培养基上， 在 23暗条件下共培养 3 天， 所说的农杆菌的菌株为 EHA105， 内 含质粒 pCMD ； 5)取共培养愈伤组织， 洗净、 晾干后， 转移到筛选培养基，。
5、 在25暗条件下培养2周， 收 集新长出的抗性愈伤组织， 转移至新的筛选培养基上， 再进行连续 2 轮继代筛选， 每隔 2 周 转继 1 次 ； 6) 取 3 轮筛选后的抗性愈伤组织， 转移至分化培养基， 诱导分化成苗， 对抗性植株进行 葡糖苷酸酶基因组织化学染色和分子检测， 选留含目的基因的转基因植株 ； 7) 取入选的转基因植株， 转移至温度 35和光照 10000Lux 下耐热鉴定 1 周， 移至自然 环境生长1周， 尔后重新置于35和10000Lux下再耐热鉴定1周， 选留叶片不枯黄、 生长良 好的转基因植株， 进行种子繁育 ； 8) 继续种植步骤 7) 筛选的转基因株系， 室内外评价。
6、验证耐热性的表达稳定性， 对稳定 的优良株系进行种子繁殖， 培育能正常越夏的耐热紫花苜蓿。 2. 根据权利要求 1 所述的耐热紫花苜蓿的转基因培育方法， 其特征在于所说的诱导培 养基为 MS 基本培养基添加 NAA5mg、 BA0.5mg、 蔗糖 30g、 琼脂粉 6.8g， pH 灭菌前 5.8。 3. 根据权利要求 1 所述的耐热紫花苜蓿的转基因培育方法， 其特征在于所说的继代培 养基为 MS 基本培养基添加 NAA0.5mg、 BA2mg、 蔗糖 30g、 琼脂粉 6.8g， pH 灭菌前 5.8。 4. 根据权利要求 1 所述的耐热紫花苜蓿的转基因培育方法， 其特征在于所说的共培养 基。
7、为 MS 基本培养基添加 NAA0.5mg、 BA2mg、 蔗糖 30g、 琼脂粉 6.8g， pH 灭菌前 5.8。 5. 根据权利要求 1 所述的耐热紫花苜蓿的转基因培育方法， 其特征在于所说的筛选培 养基为 MS 基本培养基添加潮霉素 100mg、 NAA0.5mg、 BA2mg、 蔗糖 30g、 琼脂粉 6.8g， pH 灭菌 前 5.8。 6. 根据权利要求 1 所述的耐热紫花苜蓿的转基因培育方法， 其特征在于所说的分化培 养基为 MS 基本培养基添加 KT1mg、 蔗糖 30g、 琼脂粉 6.8g， pH 灭菌前 5.8。 7. 根据权利要求 2-6 中任一所述的耐热紫花苜蓿的转基。
8、因培育方法， 其特征在于 所 说 的 MS 基 本 培 养 基 为 NH4NO3 650mg、 KNO3 900mg、 CaCl22H2O 440mg、 MgSO47H2O 370mg、 KH2PO4 700mg、 KI 0.83mg、 H3BO3 6.2mg、 MnSO44H2O22.3mg、 ZnSO47H2O 8.6mg、 Na2MnO42H2O 0.25mg、 CuSO45H2O 0.025mg、 CoCl26H2O 0.025mg、 FeSO47H2O 27.8mg 、 Na2-EDTA2H2O 37.3mg、 肌醇 100mg、 烟酸 0.5mg、 维生素 B6 0.5mg、 维生。
9、素 B1 0.5mg 和甘 氨酸 2mg。 权 利 要 求 书 CN 101643746 B1/3 页 3 一种耐热紫花苜蓿的转基因培育方法 技术领域 0001 本发明涉及一种耐热紫花苜蓿的转基因培育方法。 背景技术 0002 苜蓿因其高产、 优质、 利用年限长、 根系发达， 可改良土壤结构， 增加土壤肥力， 被 誉为 “牧草之王” 。在我国， 随着农业产业结构和畜牧业结构的调整， 节粮型畜牧业， 特别是 草食动物养殖业， 呈现良好的发展态势， 因为苜蓿在提高奶牛、 肉羊的单产中发挥决定性的 作用， 已成为我国 “三元” 种植结构调整的首选饲料作物， 苜蓿产业作为新兴的朝阳产业， 存 在着广阔。
10、的发展空间。 0003 由于夏季高温的原因导致紫花苜蓿在我国南方难以种植， 南方的苜蓿干草基本是 从北方调运， 运输成本极高， 既提高了饲养成本， 而且质量难以保证， 极大阻碍了南方草食 畜禽的发展。CBF 基因是几年前发现的一类耐逆相关基因， 其所编码的转录激活因子能与 CRT/DRE 的 DNA 调控元件特异结合， 促进启动子中含有这一调控元件的多个热和干旱诱导 基因的表达， 从而引起植株耐热性和耐逆性的增强。 0004 正是在该背景下， 本发明提出一种耐热紫花苜蓿的转基因培育方法， 旨在培育更 适合南方种植的耐热紫花苜蓿新品种， 推动南方紫花苜蓿苜蓿产业化发展， 增加优质饲草 的供应。 。
11、发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种耐热紫花苜蓿的转基因培育方法， 以获得适合南方种 植的耐热紫花苜蓿新品种。 0006 耐热紫花苜蓿的转基因培育方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 0007 1) 取主栽紫花苜蓿品种的子叶为外植体， 接种至诱导培养基， 在 25光条件下诱 导形成愈伤组织 ； 0008 2) 取诱导形成 2 周的愈伤组织， 转移至继代培养基， 继代培养至愈伤组织进入快 速增殖期 ； 0009 3) 取快速增殖的愈伤组织， 在 25暗条件下进行受体愈伤组织预培养 3 天 ； 0010 4) 取预培养的愈伤组织， 在农杆菌悬浮液中浸泡 15 分钟， 之后弃去菌液， 用无菌 。
12、滤纸吸干， 接种于共培养基上， 在 23暗条件下共培养 3 天 ； 0011 5) 取共培养愈伤组织， 洗净、 晾干后， 转移到筛选培养基， 在 25暗条件下培养 2 周， 收集新长出的抗性愈伤组织， 转移至新的筛选培养基上， 再进行连续 2 轮继代筛选， 每 隔 2 周转继 1 次 ； 0012 6) 取 3 轮筛选后的抗性愈伤组织， 转移至分化培养基， 诱导分化成苗， 对抗性植株 进行葡糖苷酸酶基因组织化学染色和分子检测， 选留含目的基因的转基因植株 ； 0013 7) 取入选的转基因植株， 转移至温度 35和光照 10000Lux 下耐热鉴定 1 周， 移至 自然环境生长1周， 尔后重新。
13、置于35和10000Lux下再耐热鉴定1周， 选留叶片不枯黄、 生 说 明 书 CN 101643746 B2/3 页 4 长良好的转基因植株， 进行种子繁育 ； 0014 8) 继续种植步骤 7) 筛选的转基因株系， 室内外评价验证耐热性的表达稳定性， 对 稳定的优良株系进行种子繁殖， 培育能正常越夏的耐热紫花苜蓿。 0015 上述的稳定性是指入选紫花苜蓿的耐热性可在不同年份间 (2 年及以上 )、 季节间 (2 季及以上 ) 以及地点间 (2 个地点及以上 ) 表达一致， 特性不受年份、 季节以及地点的显 著影响。 0016 本发明中， 所说的诱导培养基为MS基本培养基添加NAA5mg、 。
14、BA0.5mg、 蔗糖30g、 琼 脂粉 6.8g， pH 灭菌前 5.8。 0017 本发明中， 所说的继代培养基为MS基本培养基添加NAA0.5mg、 BA2mg、 蔗糖30g、 琼 脂粉 6.8g， pH 灭菌前 5.8。 0018 本发明中， 所说的共培养基为MS基本培养基添加NAA0.5mg、 BA2mg、 蔗糖30g、 琼脂 粉 6.8g， pH 灭菌前 5.8。 0019 本发明中， 所说的筛选培养基为 MS 基本培养基添加潮霉素 100mg、 NAA0.5mg、 BA2mg、 蔗糖 30g、 琼脂粉 6.8g， pH 灭菌前 5.8。 0020 本发明中， 所说的分化培养基为M。
15、S基本培养基添加KT1mg、 蔗糖30g、 琼脂粉6.8g， pH 灭菌前 5.8。 0021 上述的 MS 基本培养基为大量元素 (NH4NO3650mg、 KNO3900mg、 CaCl22H2O 440mg、 MgSO47H2O 370mg、 KH2PO4700mg)、 微量元素 (KI0.83mg、 H3BO36.2mg、 MnSO44H2O 22.3mg、 ZnSO47H2O 8.6mg、 Na2MnO42H2O0.25mg、 CuSO45H2O 0.025mg、 CoCl26H2O 0.025mg、 FeSO47H2O 27.8mgNa2-EDTA2H2O 37.3mg) 和有机成。
16、分 ( 肌醇 100mg、 烟酸 0.5mg、 维生素 B60.5mg、 维生素 B10.5mg、 甘氨酸 2mg)。 0022 本发明中， 所说的农杆菌的菌株为超毒力型EHA105， 内含质粒pCMD。 pCMD的T-DNA 区携带有拟南芥耐逆相关CBF1基因、 潮霉素磷酸转移酶基因和葡糖苷酸酶基因。 CBF1基因 长 642bp， 与 CaMV35S 启动子和胭脂碱合成酶终止子共同构成表达框架。菌株 EHA105 可方 便购买或赠送获得， 在一般植物基因工程实验室均有保存， 参见文献吴关庭等， 中国农业科 学， 2005， 38(12) ： 2395-240。 0023 本发明中， 所说的。
17、葡糖苷酸酶基因组织化学染色方法参见 Rueb 和 Hensgens.Rice Genetics Newsletter， 1989， (6) ： 168-169， 潮霉素基因分子检测方法参见吴关庭等， 中国 农业科学， 2005， 38(12) ： 2395-240。 0024 本发明具有以下几方面的有益效果 ： 0025 培育的耐热紫花苜蓿新品种能正常越夏， 更适合我国南方种植， 推动紫花苜蓿苜 蓿在我国南方的产业开发， 增加优质饲草的供应， 促进我国草食动物养殖业的发展， 尤其有 利于增进南方丘陵山区的农村经济发展和农民收入。 具体实施方式 0026 以下通过具体实例进一步说明本发明。 00。
18、27 实施例 1 ： 0028 以紫花苜蓿品种 “维多利亚” 的子叶为外植体， 接种至诱导培养基， 诱导形成愈伤 组织 ； 取诱导形成 2 周的愈伤组织， 转移至继代培养基， 继代培养至愈伤组织进入快速增殖 说 明 书 CN 101643746 B3/3 页 5 期 ； 取快速增殖的愈伤组织， 在25暗条件下进行受体愈伤组织预培养3天 ； 取预培养的愈 伤组织(约3000个培养皿， 含30000块以上的愈伤组织)， 在农杆菌悬浮液中浸泡15分钟， 之后弃去菌液， 用无菌滤纸吸干， 接种于共培养基上， 在 23暗条件下共培养 3 天 ； 取共培 养愈伤组织， 洗净、 晾干后， 转移到筛选培养基，。
19、 在 25暗条件下培养 4 周， 收集长出的抗性 愈伤组织(约200块)， 转移至新的筛选培养基上， 再进行连续2轮继代筛选， 每隔4周转继 1 次 ； 取 3 轮筛选后的抗性愈伤组织 (53 块 )， 转移至分化培养基， 诱导分化成苗 49 株， 对抗 性植株进行葡糖苷酸酶基因组织化学染色和潮霉素基因分子检测， 选取含目的基因的分化 小苗 27 株， 转移至生根培养基长成正常幼苗 19 株 ； 取入选的转基因植株， 转移至温度 35 和光照 10000Lux 下进行耐冷性鉴定 1 周 2 个轮次， 选留不受热害、 生长良好的转基因植株 5 株 ； 继续种植入选的转基因紫花苜蓿株系， 在 2007-2008 年室内外评价模拟评价耐热的表 达稳定性， 获得稳定表达的转基因耐热紫花苜蓿株系 1 个， 即 THT-Alfa1-1。种植培育出的 THT-Alfa1-1， 可正常越夏， 即盛夏炎热季节叶片保持绿色， 能正常生长， 可提供稳定提供优 质营养的饲料， 而普通紫花苜蓿材料由于不耐热， 休眠停滞生产， 叶片枯黄。 说 明 书 。