大肠菌群单管定量快速检测方法.pdf

本发明公开了一种大肠菌群单管定量快速检测方法，它包括以下步骤：特异性检测培养基的配制；样品接种；将接种的样品在35℃-44℃下培养8-15h；以8000-12000rpm速度离心5-10min；用分光光度计测定上清液在405nm处的吸光度值；根据公式计算菌浓度。本发明应用分光光度计测定培养液的吸光度值，比目测法灵敏很多，可以大大缩短培养时间。采用单管定量检测技术，一个样品只需1管培养液，比最大可能数法节约很多试剂、耗材，而且检测结果更加快速、稳定、灵敏度高。

1、  一种大肠菌群单管定量快速检测方法，其特征在于：它包括以下步骤：特异性检测培养基的配制；样品接种；将接种的样品在35℃-44℃下培养8-15h；以8000-12000rpm速度离心5-10min；用分光光度计测定上清液在405nm处的吸光度值；根据公式计算菌浓度。

2、  根据权利要求1所述的大肠菌群单管定量快速检测方法，其特征在于：所述的培养基为：含邻硝基酚半乳糖甙的培养液，其组分和重量如下：ONPG 300-700mg；胰蛋白胨8-12g；(NH₄)₂SO₄ 3-8g；Mn(SO₄)₂ 0.2-0.7mg；ZnSO₄ 0.2-0.7mg；Na₂SO₃ 20-60mg；NaCl 8-12g；CaCl₂ 40-60mg；KH₂PO₄ 0.7-1.2g；Na₂HPO₄ 6.0-6.5g；蒸馏水1000ml。

3、  根据权利要求2所述的大肠菌群单管定量快速检测方法，其特征在于：所述的培养基配制方法：将所列重量的各组分置于容器内，培养温度：35-44℃，培养时间：10-14h，保持pH值7.0-7.5。

大肠菌群单管定量快速检测方法
技术领域
本发明涉及一种检测方法，特别是涉及一种大肠菌群单管定量快速检测方法。
背景技术
目前国内外已有的基于产色技术检测样品中大肠菌群都是采用最大可能数法(MPN)，也就是单管定性，多管定量，检测手段都是采用目测产色。该方法存在2个主要缺陷：第一个缺陷是检测时间较长，该方法在接种样品后需要培养18-24小时；第二个缺陷是采用最大可能数法进行定量，导致接种试管数较多，一般需要接种9支或15支试管，同时最大可能数法的误差比较大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、灵敏度高、成本低廉的大肠菌群单管定量快速检测方法。
为实现上述目的，本发明的技术解决方案是：
本发明是一种大肠菌群单管定量快速检测方法，它包括以下步骤：特异性检测培养基的配制；样品接种；将接种的样品在35℃-44℃下培养8-15h；以8000-12000rpm速度离心5-10min；用分光光度计测定上清液在405nm处的吸光度值；根据公式计算菌浓度。
所述的培养基为：含ONPG(邻硝基酚半乳糖甙)的培养液，其组分和重量如下：ONPG 300-700mg；胰蛋白胨8-12g；(NH₄)₂SO₄ 3-8g；Mn(SO₄)₂ 0.2-0.7mg；ZnSO₄ 0.2-0.7mg；Na₂SO₃ 20-60mg；NaCl 8-12g；CaCl₂ 40-60mg；KH₂PO₄ 0.7-1.2g；Na₂HPO₄ 6.0-6.5g；蒸馏水1000ml。
所述的培养基配制方法：将所列重量的各组分置于容器内，培养温度：35-44℃，培养时间：10-14h，保持pH值7.0-7.5。
采用上述方案后，本发明应用分光光度计测定培养液的吸光度值，比目测法灵敏很多，可以大大缩短培养时间。采用单管定量检测技术，一个样品只需1管培养液，比最大可能数法节约很多试剂、耗材，而且检测结果更加快速、稳定、灵敏度高。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
附图说明
图1是本发明的检测流程图。
具体实施方式
本发明的原理：根据大肠菌群在生长的过程中能产生β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)分解培养液中的特定底物ONPG(邻硝基酚半乳糖甙)产生显色物质ONP(邻硝基酚)的原理，通过测定培养液有无产生黄色物质可以判断样品中是否存在大肠菌群。通过研究发现，在一定条件下，培养液中黄色物质的量与接种大肠菌群数量成正比。因此，可以在特定条件下通过测定培养液的吸光度值来推算出样品中的大肠菌群数。
如图1所示，本发明大肠菌群单管定量快速检测方法，它包括以下步骤：特异性检测培养基的配制；样品接种；恒温培养一定时间；离心；测定405nm处的吸光度值；根据公式计算菌浓度。
培养基：含ONPG(邻硝基酚半乳糖甙)的培养液，推荐配方如下：ONPG 300-700mg；胰蛋白胨8-12g；(NH₄)₂SO₄：3-8g；Mn(SO₄)₂：0.2-0.7mg；ZnSO₄：0.2-0.7mg；Na₂SO₃：20-60mg；NaCl：8-12g；CaCl₂：40-60mg；KH₂PO₄：0.7-1.2g；Na₂HPO₄：6.0-6.5g；蒸馏水：1000ml；pH：7.0-7.5。
培养温度：35-44℃。
培养时间：10-14h。
检测方法：用分光光度计测定培养液的吸光度值，检测波长为405nm，光程为1cm。
计算公式：根据培养的条件不同，菌浓度的计算公式与线性检测范围也有所不同。
42℃培养10h的公式：吸光度值(y)＝0.5809×1g菌浓度-1.4801，线性检测范围：10^3.522-10^6.522cfu/ml。
42℃培养11h的公式：吸光度值(y)＝0.5092×1g菌浓度-0.5521，线性检测范围：10^1.522-10^5.522cfu/ml。
42℃培养12h的公式：吸光度值(y)＝0.4881×1g菌浓度+0.0014，线性检测范围：0-10^3.522cfu/ml。
42℃培养13h的公式：吸光度值(y)＝0.7072×1g菌浓度+0.0415，线性检测范围：0-10^2.522cfu/ml。
42℃培养14h的公式：吸光度值(y)＝0.8677×1g菌浓度+0.187，线性检测范围：0-10^2.522cfu/ml。
检测范围：环境、食品、饮料等样品中的大肠菌群。
应用实例：
实例1：配制好ONPG培养液，分装于试管，每支试管10ml，接种1ml样品到培养液中，42℃培养10小时，离心后用分光光度计测定培养液在405nm处的吸光度值为1.20，根据该条件下吸光度度与菌浓度的对应公式，该样品中的大肠菌群数为4.1×10⁴cfu/ml。
实例2：配制好ONPG培养液，分装于试管，每支试管10ml，接种1ml样品到培养液中，42℃培养12小时，离心后用分光光度计测定培养液在405nm处的吸光度值为1.10，根据该条件下吸光度度与菌浓度的对应公式，该样品中的大肠菌群数为186cfu/ml。
实例3：配制好ONPG培养液，分装于试管，每支试管10ml，接种1ml样品到培养液中，42℃培养14小时，离心后用分光光度计测定培养液在405nm处的吸光度值为1.30，根据该条件下吸光度度与菌浓度的对应公式，该样品中的大肠菌群数为16cfu/ml。
发明要点及要求保护的重点：本发明的要点是在建立单管定量检测技术，并通过研究确定该检测技术的具体参数和适用范围。本发明保护的重点是单管定量检测技术。