硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株及其构建方法与应用.pdf

本发明涉及生物医药技术领域。蛋白酶体抑制剂硼替佐米对多种血液系统肿瘤有显著作用，已被批准用于多发性骨髓瘤及淋巴瘤的临床治疗。临床研究发现部分MM患者对硼替佐米产生了耐药反应或在初期治疗有效的MM患者中出现耐药及疾病的复发。本发明的目的是提供硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株及其构建方法与应用。本发明通过构建硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株，对该细胞株进行的基因芯片、蛋白电泳、实时定量PCR等检测，证实耐药细胞株与亲本骨髓瘤细胞株之间存在多个基因表达差异及蛋白表达差异；这些差异基因和蛋白可用于研究硼替佐米在骨髓瘤中的耐药机制。本发明可用于筛选抗硼替佐米耐药药物。

1、  一种硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株，其特征在于是按照以下方法构建的：
A、取生长期的骨髓瘤细胞株NCI-H929，采用浓度为1-10nmol/L的硼替佐米诱导；
B、逐步增加硼替佐米浓度至200nmol/L，获得硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株。

2、  根据权利要求1所述的一种硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株，其特征在于是按照以下方法构建的：
取生长期的骨髓瘤细胞株NCI-H929，采用浓度为10nmol/L的硼替佐米诱导；2-3天半量换液一次，每1-2周浓度提高10nmol/L，直至终浓度达到200nmol/L，培养时间为8个月，获得硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株。

3、  如权利要求1所述的硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株的构建方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
A、取生长期的骨髓瘤细胞株NCI-H929，采用浓度为1-10nmol/L的硼替佐米诱导；
B、逐步增加硼替佐米浓度至200nmol/L，获得硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株。

4、  根据权利要求3所述的硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株的构建方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
取生长期的骨髓瘤细胞株NCI-H929，采用浓度为10nmol/L的硼替佐米诱导；2-3天半量换液一次，每1-2周浓度提高10nmol/L，直至终浓度达到200nmol/L，培养时间为8个月，获得硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株。

5、  根据权利要求4所述的硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株的构建方法，其特征在于该方法为：
取指数生长期的NCI-H929骨髓瘤细胞株1x10⁹/L接种于6孔板，加入含硼替佐米终浓度为10nmol/L的RPMI1640培养液+10％胎牛血清，置于37℃、含5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养，2-3天半量换液至细胞生长恢复正常，再次加入终浓度为10nmol/L的硼替佐米，反复三次后硼替佐米的终浓度增加至20nmol/L，逐步增加浓度至200nmol/L，培养8个月，获得硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株。

6、  如权利要求1或2所述的硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株在筛选抗硼替佐米耐药药物中的应用。

硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种蛋白酶体抑制剂硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株，及其构建方法，在筛选抗硼替佐米耐药药物中的应用。
背景技术
蛋白酶体抑制剂是近年来抗癌新药的研究热点，临床前期研究已正式蛋白酶体抑制剂硼替佐米对多种血液系统肿瘤有显著作用，已被批准用于多发性骨髓瘤及淋巴瘤的临床治疗。硼替佐米为哺乳动物细胞中26S蛋白酶体糜蛋白酶样活性的可逆抑制剂，化学名为：[(1R)-3-甲基-1-[[(2S)-1-氧-3-苯基-2-[(吡嗪羧基)氨基]丙基]氨基]丁基]硼酸，分子式C₁₉H₂₅BN₄O₄，相对分子量384.24。它是一特异性强效、高效蛋白酶体抑制剂。Mateos等报道，采用硼替佐米联合MP(VMP方案)治疗60例65岁及以上的老年初诊多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)患者，总反应率为89％，CR率为32％，16个月的无事件生存率(EFS)为93％；而历史对照的MP方案总反应率为42％，16个月的EFS为51％。2008年美国国家综合癌症网络(National Comprehensive CancerNetwork，NCCN)骨髓瘤诊疗指南中也推荐将硼替佐米+地塞米松(简称VD方案)、硼替佐米+地塞米松+阿霉素(简称PAD方案)、美法仑+强的松+硼替佐米(简称MPV)用于初发及移植候选的MM患者。对于难治/复发的MM患者2008年NCCN指南中将硼替佐米单药及硼替佐米联合脂质体阿霉素作为I类推荐，硼替佐米+地塞米松方案作为2A类推荐。然而，随着其临床应用范围的扩大和时间的推移，国内外临床研究已发现部分MM患者对硼替佐米产生了耐药反应或在初期治疗有效的MM患者中出现耐药及疾病的复发(Richardson PG，Barlogie B，Berenson J，et al.A phase 2 study of bortezomibin relapsed，refractory myeloma.N Engl J Med，2003；348：2609-2617.)。
目前，国内外关于硼替佐米的耐药机制研究尚少，其耐药机制尚不明确。有研究国外分析了多药物耐药蛋白(MRP)在MM细胞中的表达与硼替佐米诱导MM细胞凋亡间的相关性，研究显示MRP3和MRP5的表达不足以遏制硼替佐米诱导产生的凋亡作用，从而提示硼替佐米可能并非为多药耐药转运蛋白的底物。这就提示，硼替佐米的耐药不同于现有肿瘤治疗中经典的多药耐药。
另外，Selga等采用基因芯片技术分析了甲氨喋呤(Methotrexate，MTX)敏感与耐药的人HT29肠癌细胞株，结合实时定量PCR、基因转染及小RNA干扰等技术研究发现Caveolin-1和E-cadherin在MTX耐药的HT29细胞中表达下调，可能与耐药有关，提示其可能为潜在的治疗靶点(Selga E，Morales C，NoéV，Peinado MA，Ciudad CJ.Role of Caveolin 1，E-Cadherin，Enolase 2 andPKCalpha on resistance to methotrexate in human HT29 colon cancer cells.BMCMed Genomics，2008；1：35.)。Shen等采用二维电泳技术分析了阿霉素(Adriamycin，ADM)敏感和阿霉素耐药的K562白血病细胞株，共鉴定发现了9个差异表达的蛋白，其中CRKL在ADM耐药K562细胞中表达明显上调，而通过转染重组慢病毒psc-2 LVshCRKL可下调该蛋白的表达。此外，采用RNA干扰技术沉默了CRKL基因的表达后ADM的耐药可被逆转，提示CRKL与多耐药相关，该蛋白可望作为反义治疗技术的作用靶点(Shen SH，Gu LJ，Liu PQ，Ye X，Chang WS，Li BS.Comparative proteomic analysis ofdifferentially expressed proteins between K562 and K562/ADM cells.Chin Med J(Engl)，2008；121(5)：463-8.)。这些文献均给出通过耐药细胞株找到差异蛋白后筛选耐药药物的启示。
因此，如果能建立硼替佐米耐药的骨髓瘤细胞株，可以深入研究硼替佐米可能的耐药机制，为临床应用蛋白酶体抑制剂治疗多发性骨髓瘤，监测和避免治疗中耐药的发生提供实验依据；同时，为抗耐药药物的筛选提供细胞模型，以期达到逆转耐药提高疗效的目的。
目前尚未有硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株，及其构建方法与应用。
本发明提供了一种硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株。
本发明还提供上述硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株的构建方法。
本发明的具体技术方案是：一种硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株，是按照以下方法构建的：
A、取生长期的骨髓瘤细胞株NCI-H929，采用浓度为1-10nmol/L的硼替佐米诱导；
B、逐步增加硼替佐米浓度至200nmol/L，获得硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株。
本发明也可以是其他骨髓瘤细胞株，由于NCI-H929是目前国际上公认的一株骨髓瘤细胞株，生物学及遗传学形状已研究的较为明确了，是国内外实验中较为常用的骨髓瘤细胞株之一，因此本发明选用该细胞株。
上述硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株，较佳地，是按照以下方法构建的：
取生长期的骨髓瘤细胞株NCI-H929，采用浓度为10nmol/L的硼替佐米诱导；2-3天半量换液一次，每1-2周左右浓度提高10nmol/L，直至终浓度达到200nmol/L，然后停药1月后进行相关检测，培养时间为8个月，获得硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株。
本发明还提供上述硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株在筛选抗硼替佐米耐药药物中的应用。
本发明构建硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株之后，利用该细胞株进行基因组学、蛋白组学等方面的研究。通过研究，进一步了解硼替佐米在骨髓瘤中耐药可能的机制，以及为筛选可逆转耐药的基因及蛋白提供实验室依据。
硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株的生物学特性的观察及耐药机制的研究，具体包括：
1.取指数生长期的亲本H929细胞及耐药H929细胞，进行流式细胞术细胞周期分析；
2.取指数生长期的亲本H929细胞及耐药H929细胞，提取RNA行表达谱基因芯片分析；
3.采用分析软件结合基因通路相关网站，分析基因芯片结果，初步确定差异基因及与耐药相关的可能的信号通路；
4.进行实时定量PCR检测可能与耐药相关的差异基因，进一步验证基因芯片结果；
5.取指数生长期的亲本H929细胞及耐药H929细胞，提取蛋白进行双相二维电泳，结合质谱分析确定差异基因。
本发明通过对硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株进行的基因芯片、蛋白电泳、实时定量PCR等检测，证实耐药细胞株与亲本骨髓瘤细胞株之间存在多个基因表达差异及蛋白表达差异。这些差异基因和蛋白作为研究硼替佐米在骨髓瘤中的耐药机制，并为筛选抗耐药药物提高实验依据。从而达到逆转耐药提高疗效的研究目的。
附图说明
图1为本发明的硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株与亲本的流式细胞周期图。
A亲本流式细胞周期图
B本发明的硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株流式细胞周期图
图2为本发明的硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株基因芯片数据分析图。
图3为采用实时定量PCR法验证基因芯片差异表达基因图。
图4为采用二维电泳法，对亲本及硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株间存在的差异蛋白进行鉴定结果图。
具体实施方式：
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
实施例1：硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株的建立
取指数生长期的NCI-H929骨髓瘤细胞株(购自美国菌种保藏中心(ATCC)，可用长期液氮保存，实验时复苏后使用的)1x10⁹/L接种于6孔板，加入含硼替佐米(由西安杨森公司提供原药)终浓度为10nmol/L的RPMI1640培养液(购自Gibico公司)+10％胎牛血清，置于37℃、含5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养，2-3天半量换液至细胞生长恢复正常(大约为1-2周)，再次加入终浓度为10nmol/L的硼替佐米，反复三次后硼替佐米的终浓度增加至20nmol/L。如此逐步增加浓度至200nmol/L，培养8个月，获得硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株(以下称NCI-H929B)。
实施例2：采用MTT法测定亲本及耐药骨髓瘤细胞株的IC50
MTT法参考工具书：薛庆善，体外培养的原理与技术，科学出版社，2001；343。
硼替佐米相对分子量384.24，且根据本申请人测得NCI-H929对于硼替佐米的IC50约为20.7nmol/L，以此为参考设计实验浓度分别为1nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、500nmol/L及1000nmol/L六个浓度。取停药至少2周以上的NCI-H929B细胞，取指数生长期的细胞悬液，浓度调整为1x10⁵/L，分别接种于96孔板，每孔含90ul，置于37℃、含5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养24h后，分别加入六个浓度的硼替佐米，每孔10ul，每一浓度均设3个复孔。培养20小时后，加入10ul MTT液，共同培养4小时每孔加入酸化异丙醇100ul，将其完全溶解，采用波长570nm，进行酶标仪检测，测定半数抑制率。根据测定结果，NCI-H929B IC50为487.4nmol/L，耐药倍数＝耐药细胞IC50/亲本细胞IC50＝487.4/20.7＝23.5。
实施例3：流式细胞术分析细胞周期
取指数生长期的NCI-H929、NCI-H929B细胞悬液，分别计数，取1x10⁶/L，离心、去上清，加入70％冰乙醇打匀固定，0-4℃过夜。次日，再次离心去上清，PBS洗涤2次，RNA酶作用15分钟，加入碘化丙锭、精胺作用15分钟，调整细胞浓度为1x10⁶/L，上流式细胞仪做细胞周期分析。
结果如图1所示，图中纵座标Y表示被测细胞的绝对数目，横座标x是所测的荧光或散射光的强度，用“道数”表示：
1)图1A为亲本NCI-H929流式细胞周期图：S期比例为54.28％，G1期为36.83％，G2期为8.89％，G2/G1：1.85
2)图1B为NCI-H929B细胞流式细胞周期图：S期比例为51.88％，G1期为32.36％，G2期为15.76％，G2/G1：1.85。
实施例4：NCI-H929、NCI-H929B细胞总RNA的提取
1)收集1x10⁷/NCI-H929、NCI-H929B细胞，用PBS 2000rpm洗5分钟，每管加TRIZOL试剂(Gibico，Invitrogen，USA)1ml(用Rnase-free枪头，边加边振荡)，充分混匀。-80℃保存。
2)加新开的氯仿0.2ml(1∶5的体积)，剧烈振荡，室温静置5-10min。
3)12000rpm，15min，4℃，离心。然后取上清至EP管(DEPC处理过)。
4)加0.5ml新开的异丙醇(1∶1体积)，轻摇(防止RNA断裂)，室温静置10min。
5)12000rpm，15min，4℃，离心。弃上清。
6)总RNA为管底的白色沉淀，加75％乙醇1ml洗涤(用DEPC水新配制)后，10000rpm，10min，4℃。离心。
7)去上清，气干沉淀5-10分钟，至沉淀半透明，加sigma-water 20-30ul，
8)96孔板稀释，测OD值。
9)吸取500ng的RNA+loading buffer 10ul，65℃加热8min后立即冰置(目的：打开二级结构)
11)电泳。
12)将抽好的RNA-80℃保存(反复冻融不得超过3次)。
实施例5：NCI-H929、NCI-H929B细胞表达谱基因芯片分析
NCI-H929、NCI-H929B两种mRNA分别变性及逆转录至cDNA，分别标记荧光染料Cy3及Cy5后，与载有12673个克隆的cDNA芯片(由上海市血液病研究所医学基因组国家重点实验室提供)空气浴杂交，65℃15h。
芯片结果分析，结果如图2所示：
1)根据筛选出的耐药组与正常组的骨髓瘤细胞差异基因进行基因功能分析，确定该群基因在GO分类的规律，找到显著性GO分类中的基因，这些基因的上下调差异表达即导致样本差异的具有靶向性的关键基因；
2)同时对差异基因产物主要分布的Pathway进行显著性分析，找出与实验目的有显著联系的Pathway；
3)取显著性GO分类中的关键基因与显著性的Pathway中的关键基因交集，作为重点研究的靶点基因群。
4)采用基于KEGG Pathway数据库的Path-Net技术，从网络角度发现显著性Pathway之间的激活关系，从而确定出具有中心调控能力Pathway。
实施例6：实时定量PCR检测差异表达的基因
1、引物设计
根据GenBank中下列六个基因的已知序列结合primer5.0程序设计出目
的基因引物序列：
FADD P：5’CACGACCTGCTGCGGCGCG 3’(SEQ ID NO：1)
FADD M：5’CCCGCACACGCTCTGTCAGG 3’(SEQ ID NO：2)
TRAF2P：5’CCGAATGTCCCGCGTGCAAAG 3’(SEQ ID NO：3)
TRAF2M：5’CCTGAAACTTCTCCCGGGGG 3’(SEQ ID NO：4)
Casp8P：5’GATGAATTTTCAAATGGGGAGGAG 3’(SEQ ID NO：5)
Casp8M：5’CATTCCTGTCCCTAATGCTGTG 3’(SEQ ID NO：6)
CASP7P：5’TGTGCCAAGATGCAAGATCTGC 3’(SEQ ID NO：7)
CASP7M：5’TCGGCAAGCCTGAATGAAGAAG 3’(SEQ ID NO：8)
HSP86P：5’GTTAACTGGTACCAAGAAAAGGC 3’(SEQ ID NO：9)
HSP86M：5’CAGGCATCAGTAGCCTAAGCAA 3’(SEQ ID NO：10)
MAP3K5P：5’TTCCTGATGACAAGAAAGGTATAC 3’(SEQ ID NO：11)
MAP3K5M：5’TGCTTCTCCCCTTCTCTTCGG 3’(SEQ ID NO：12)
至上海英俊生物公司订制六对引物。
2、提取总RNA
取指数生长期NCI-H929、NCI-H929B悬浮细胞5x10⁶，2000rpm离心5分钟，弃去上清，加入1mlTRIzol裂解，加入200ul氯仿，用力颠倒混匀，室温静置10分钟，4℃，13000rpm，离心30分钟，从每管吸取上清至另一1.5mlEP管中，加入等体积异丙醇，混匀后-20℃沉淀1小时。4℃，13000rpm，离心20分钟，弃去上清液，加入500ul75％乙醇，洗涤沉淀。4℃，13000rpm，离心10分钟，弃去上清，加入10ulDEPC水至完全溶解，进行电泳分析测定。
逆转录反应
取总RNA1ug加入0.2mlPCR管中，加入0ligodT 1ul用DEPC水补充体积至12ul，混匀后70℃冰浴5分钟，依次加入5x反应缓冲液，Riblolck^TMRNA酶抑制剂1ul、10mM dNTP混合物2ul，混匀后37℃反应5分钟，加入RevertAid^TMM-MulV逆转录酶1ul，最终体积为20ul，混匀后42℃反应60分钟，然后70℃反应10分钟。
3、实时定量PCR反应
以GAPDH为内参基因，采用上述六对引物。取逆转录产物1ul，依次加入SYBY Premix Ex Taq酶10ul，引物及双蒸水。反应循环体系设定如下：
Cycle 1：        (1X)
        Step 1：                                    95.0℃    1分钟
Cycle 2：        (40X)
        Step 1：                                    95.0℃    15秒
        Step 2：                                    57.0℃    15秒
        Step 3：                                    72.0℃    45秒
        Data collection and real-time analysis enabled.
Cycle 3：        (1X)
        Step 1：                                    95.0℃    1分钟
Cycle 4：        (1X)
        Step 1：                                    65.0℃    1分钟
Cycle 5：        (62X)
        Step 1：                                    65.0℃    10秒
4.计算目的基因的相对表达量
按照下列公式计算样本中六个基因的相对表达量(见参考文献：Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data usingreal-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method.Methods，2001；25(4)：402-8.)，采用CT值代表实时定量PCR的结果，GAPDH作为组织的内参对照，ΔCt(目的基因)＝目的基因Ct-内参对照基因Ct；ΔΔCt＝ΔCt(耐药细胞)-ΔCt(亲本细胞)；根据公式可计算出耐药株中基因表达/亲本细胞中基因表达＝2^-ΔΔCt。参照表达谱芯片分析，当候选基因在耐药株中表达/亲本细胞中表达≥1.5时，则认为该基因为过表达，若是≤0.5则判定该基因为低表达。
结果如图3及表1所示：
1)通过实验绘制成实时荧光扩增曲线图，横坐标为循环数；纵坐标为PCR基线扣除值，(其中CF值是指样品管的荧光信号达到某一固定阈值的PCR反应循环数，RFU表示相对荧光单位[relativefluorescence units，RFU])，；
2)根据公式计算得到结果如表1所示，结果提示在NCI-H929B细胞株中FADD、Casp8，MAP3K5表达下调，而Hsp86表达上调。
表1实时定量PCR亲本及硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株中相关基因的表达

实施例7：二维电泳分析及差异蛋白鉴定
1、细胞蛋白提取：
1)取指数生长期的NCI-H929及NCI-H929B细胞悬液，总数为1x10⁸/L，1000rpm离心10min收集细胞；如果是悬浮细胞则直接离心收集。
2)往离心管中加入～5ml冰冻的PBS洗涤细胞，吹打数次，1000g、4℃离心5min，弃上清；重复3次(轻柔，避免细胞破裂)。
3)用山梨醇(250mM)洗液1ml轻轻吹打细胞，1000rpm离心10min，重复一次。
4)之后完全干燥。
5)加入适当体积的裂解液(保证蛋白终浓度不能太高或者太低，3瓶细胞加150ul裂解液)。
6)涡旋振荡离心管10～30s，重悬细胞。冰上放置30min以上。超声破碎细胞20～30s(管子放置于冰上)。
7)冰上放置30min。
8)14000rpm，4℃离心30min。
9)54000rpm，4℃再离心30min。
10)取上清，分装，-80℃保存。
2、第一向等点聚焦：
(1)从冰箱中取出IPG预制胶条，用溶胀缓冲液将胶条泡胀12小时。
溶胀缓冲液：8M尿素，2M硫脲，0.5％CHAPS，0.52％两性电解质，0.02％溴酚蓝，1％DTT
(2)将胶条取出放入聚焦槽内，加入矿物油至没过上样杯，上样量为0.45mg，并用溶胀buffer稀释至170ul。
(3)对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序：

(4)聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳。
3、第二向SDS-PAGE电泳(见补充材料三，推荐使用12.5％凝胶)：
(1)配制丙烯酰胺凝胶2块。
(2)待凝胶凝固后，从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。
(3)配制胶条平衡缓冲液I，平衡缓冲液II。
平衡缓冲液I：50mM Tris-HCl 6.8，6M尿素，30％甘油，2％SDS，2％DTT，0.02％溴酚蓝。
平衡缓冲液II：50mM Tris-HCl 6.8，6M尿素，30％甘油，2％SDS，2.5％IAA，0.02％溴酚蓝。
(4)平衡胶条：先将胶条放入平衡缓冲液I水平振荡15min，再将胶条转入平衡缓冲液II水平振荡15min。
(5)第二次平衡结束后，将IPG胶条从样品水化盘中移出，放到已配好的SDS-PAGE凝胶上端，并将marker放到凝胶的一端，再用0.5％的琼脂糖将胶条和marker封严。并将胶板固定于电泳槽内。
(6)在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
(7)电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，进行染色。
4、染色
①染色：R350：每片药片用200ul染液母液(乙酸∶甲醇＝120∶80)溶解，搅拌过夜，滤纸过滤；加入1800ul染液稀释液(水∶乙酸∶甲醇＝7∶2∶1)，混匀。
②脱色：将收集染色液，将凝胶浸于脱色液中，水平摇床振荡。最后换成MQ再洗涤30min
脱色液：3％冰醋酸溶液。
5、差异蛋白分析
把上述得到的tiff格式的文件导入到Melanie Viewer软件，生成mel格式的文件。具体步骤如下：
1)Spot detection：所有的被分析的凝胶都用同一参数进行检测，调整spotdetection的各个参数使得凝胶上的spot在考马斯亮蓝染色水平下都是清晰可见的。检测之后确认，删除掉明显是杂质的点，或轮廓不清的点。
2)Backgbround substraction：采用lowest on boundary的扣除背景方法进行
3)Reference gel：选择图谱最规矩，spot number相对最多的凝胶，设置为reference gel，在后续的差异蛋白之的比较中，其余的凝胶都与参考胶相比较。
4)Matching：首先在各个胶上选择分辨率、聚焦较好，确信是同一个蛋白质点的spot作为landmark，landmark的选取要在胶上均匀分布，选取6-8个spots作为胶之间进行matching的路标。
5)Normalization：目的是标准化每张胶上spot的volumn值，以便胶之间蛋白表达量的准确比较和分析。我们采用(volumn of each spot on a gel)/(total volumn of total spots on the same gel)×10000作为标准化之后的volumn值，这个值用于后面的差异表达分析(非参数t检验)，这样就避免了由于上样量的差异导致的差异表达假像。
6)Differential protein analysis：所有胶经过与reference gel匹配之后，参考胶上的每一个点都对应着各个胶上的相应的点，这样的点归为一个Group，利用每个spot经过nomalization后的volumn值进行差异表达分析。首先软件自动分析，然后确认Visualization confirmation，方可认为是差异表达蛋白。
7)匹配结果，我们利用双向电泳分析软件对双向图谱(考马斯亮蓝染色)进行分析。
在耐药细胞株组中，可以检测到763个清晰可见的spot；在对照组中，检测到691个spot。经上述分析后发现：在耐药细胞株组组中上调的蛋白有11个，在对照组中上调的蛋白有6个。
6、差异蛋白酶解
酶解步骤：
1)将200ul枪头(黄色)顶端剪掉，然后将凝胶上的目的蛋白点切下，或者用解剖刀将一维电泳上的蛋白条带切下，装入0.5ml离心管中，用Milli-Q水洗三次，每次10～15min 2)胶块脱色：用脱色液(50％ACN/25mMNH₄HCO₃)每次加400ul，摇床250rpm摇动。脱色洗涤三次，直到胶块透明为止。
3)胶块加入50ul 100％ACN，作用5min，重复一次，最好振荡一下。待胶块变白缩小后吸出CAN，并让残留的ACN自然干燥。
4)每个胶块加入10ul Trypsin溶液(1ug trypsin溶于100ul 25mMNH₄HCO₃pH8.0中，Sigma)，这样每个胶块大约100ng trypsin。40C下吸涨30min，然后补加10ul的25mM NH₄HCO₃pH8.0，37℃过夜。Trypsin的作用时间依据蛋白质分子量的大小而定，分子量越小，作用的时间应该适当缩短；分子量越大，消化时间适当延长。
5)对于MALDI-TOF-MS蛋白鉴定来说，胶块蛋白消化液无需经过脱盐处理可以直接取1～2ul(蛋白量少的时候可以重复点样)点样于MALDI板上。
结果如图4和表2所示，根据差异蛋白酶解及质谱鉴定后共鉴定出17个差异蛋白，见下表。
表2二维电泳中差异表达的蛋白列表

SEQUENCE LISTING
<110>中国人民解放军第二军医大学
<120>硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株及其构建方法与应用
<130>说明书
<140>200910044965.X
<141>2009-01-07
<160>12
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
cacgacctgc tgcggcgcg                                   19
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
cccgcacacg ctctgtcagg                                  20
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ccgaatgtcc cgcgtgcaaa g                                21
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
cctgaaactt ctcccggggg                                  20
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
gatgaatttt caaatgggga ggag                             24
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
cattcctgtc cctaatgctg tg                               22
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
tgtgccaaga tgcaagatct gc                               22
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
tcggcaagcc tgaatgaaga ag                               22
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
gttaactggt accaagaaaa ggc                              23
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
caggcatcag tagcctaagc aa                               22
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
ttcctgatga caagaaaggt atac                             24
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
tgcttctccc cttctcttcg g                                21