耐盐性胶质芽孢杆菌的筛选培养方法.pdf

本发明是一种耐盐性胶质芽孢杆菌的筛选培养方法，其特征在于，其步骤如下：将胶质芽孢杆菌在无氮培养基上活化后，转接于抑制荚膜生长的液体培养基中培养至对数生长期，离心收集菌体；用稀释后的海水或者含钾卤水悬浮菌体，并将菌体浓度稀释至103～105万个/ml，得菌体悬浮液，将菌体悬浮液用辐射诱变或者化学诱变方法进行诱变，将诱变后的菌体悬浮液离心，获得诱变菌体；取诱变菌体进行筛选、复筛，获得耐盐性菌株。本发明方法能够定向诱变出可以适应一定浓度的海水和含钾卤水的耐盐性胶质芽孢杆菌，可以有效的利用海水卤水作为钾盐资源，并可以适应普通土壤或者盐碱性土壤，从而可以用于开发一种新型生物有机钾肥的生产菌种。

1、  一种耐盐性胶质芽孢杆菌的筛选培养方法，其特征在于，其步骤如下：
(1)将胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)在无氮培养基上活化后，转接于抑制荚膜生长的液体培养基中培养至对数生长期，离心收集菌体；
(2)用稀释后的海水或者含钾卤水悬浮菌体，并将菌体浓度稀释至10³～10⁵万个/ml，得菌体悬浮液，将菌体悬浮液用辐射诱变或者化学诱变方法进行诱变，将诱变后的菌体悬浮液离心，获得诱变菌体；
(3)取诱变菌体进行筛选、复筛，获得耐盐性菌株；方法如下：
1)用筛选培养基悬浮诱变菌体，调整诱变菌体浓度至10²～10³万个/ml，充分摇匀后，分装于96孔培养板中，每孔100～200μl；
2)25～32℃培养5～7天，用分光光度计检测96孔培养板中的诱变菌吸光值，选取96孔培养板中的吸光值为0.2～0.5的诱变菌体进行复筛；
3)将吸光值为0.2～0.5的诱变菌体稀释至10²～10³万个/ml，取100～200μl诱变菌体稀释液涂布于复筛培养基平板上，25～32℃培养3～5天，重复3～5次，出现黄色晕圈菌落为目标菌落，将目标菌落在复筛培养平板上进行2～3次单菌落纯化后获得耐盐性胶质芽孢杆菌。

2、  根据权利要求1所述的耐盐性胶质芽孢杆菌的筛选培养方法，其特征在于，其步骤如下：按照步骤(2)、(3)循环进行四～五级诱变、筛选、复筛，获得在不同浓度的海水或者含钾卤水中保持活力的耐盐性胶质芽孢杆菌；其中：
一级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为：海水或者含钾卤水∶蒸馏水＝1∶100；
二级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为：海水或者含钾卤水∶蒸馏水＝1∶25；
三级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为：海水或者含钾卤水∶蒸馏水＝1∶10；
四级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为：海水或者含钾卤水∶蒸馏水＝1∶5；
五级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为：海水或者含钾卤水∶蒸馏水＝1∶1。

3、  根据权利要求1或2所述的耐盐性胶质芽孢杆菌的筛选培养方法，其特征在于，步骤(3)的1)中所述的筛选培养基为：蔗糖5.0～10.0g，稀释后的海水或者含钾卤水1000ml，pH为7.0～7.5；步骤(3)的3)中所述的复筛培养基为：蔗糖5.0～10.0g，琼脂粉15.0～20.0g；溴酚蓝或甲基红指示剂0.002～0.005g·L-1，稀释后的海水或者含钾卤水1000ml，pH 7.0～7.5。

耐盐性胶质芽孢杆菌的筛选培养方法
技术领域
本发明涉及一种芽孢杆菌的培养方法，特别是一种耐盐性胶质芽孢杆菌的筛选培养方法。
背景技术
胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)是生产有机肥料的重要菌种，能够应用于微生物钾肥的生产，促进经济作物的生长。但该菌的耐盐行较差，在较高盐浓度的培养基中生长受到显著抑制。因此在盐碱性土壤中生长活性较差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种方法简单、可操作性强的耐盐性胶质芽孢杆菌的筛选培养方法，该方法能培养得到耐盐性高的胶质芽孢杆菌。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种耐盐性胶质芽孢杆菌的筛选培养方法，其特点是，其步骤如下：
(1)将胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)在无氮培养基上活化后，转接于抑制荚膜生长的液体培养基中培养至对数生长期，离心收集菌体；
(2)用稀释后的海水或者含钾卤水悬浮菌体，并将菌体浓度稀释至10³～10⁵万个/ml，得菌体悬浮液，将菌体悬浮液用辐射诱变或者化学诱变方法进行诱变，将诱变后的菌体悬浮液离心，获得诱变菌体；
(3)取诱变菌体进行筛选、复筛，获得耐盐性菌株；方法如下：
1)用筛选培养基悬浮诱变菌体，调整诱变菌体浓度至10²～10³万个/ml，充分摇匀后，分装于96孔培养板中，每孔100～200μl；
2)25～32℃培养5～7天，用分光光度计检测96孔培养板中的诱变菌吸光值，选取96孔培养板中的吸光值为0.2～0.5的诱变菌体进行复筛；
3)将吸光值为0.2～0.5的诱变菌体稀释至10²～10³万个/ml，取100～200μl诱变菌体稀释液涂布于复筛培养基平板上，25～32℃培养3～5天，重复3～5次，出现黄色晕圈菌落为目标菌落，将目标菌落在复筛培养平板上进行2～3次单菌落纯化后获得耐盐性胶质芽孢杆菌。
在本发明技术方案中所涉及的各培养基如下：
1、无氮培养基：
甘露醇5.0～10.0g；K₂HPO₄0.5～2.0g；MgSO₄·7H₂O 0.2～0.5g；琼脂粉15.0～20.0g；蒸馏水1000ml；pH为7.0～7.5。
2、抑制荚膜生长的液体培养基：
麦芽糖：10.0～20.0g；(NH₄)₂SO₄0.5～2.0g；酵母粉0.1～1.0g；MgSO₄·7H₂O0.2～1.0g；K₂HPO₄0.5～2.0g；蒸馏水1000ml，pH为7.0～7.5。
3、筛选培养基：
蔗糖5.0～10.0g，稀释后的海水或者含钾卤水1000ml，pH为7.0～7.5。
4、复筛培养基：
蔗糖5.0～10.0g，琼脂粉15.0～20.0g；溴酚蓝或甲基红指示剂0.002～0.005g·L-1，稀释后的海水或者含钾卤水1000ml，pH7.0～7.5。
本发明步骤(2)所述的辐射诱变或者化学诱变的诱变方法可以采用常规的诱变方法。
本发明还可以按照上述步骤(2)、(3)循环进行四～五级诱变、筛选、复筛，获得在不同浓度的海水或者含钾卤水中保持活力的耐盐性胶质芽孢杆菌；其中：
一级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为：海水或者含钾卤水∶蒸馏水＝1∶100；
二级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为：海水或者含钾卤水∶蒸馏水＝1∶25；
三级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为：海水或者含钾卤水∶蒸馏水＝1∶10；
四级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为：海水或者含钾卤水∶蒸馏水＝1∶5；
五级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为：海水或者含钾卤水∶蒸馏水＝1∶1。
本发明将上述通过一级诱变、二级诱变、三级诱变、四级诱变、五级诱变等5级诱变产生的耐盐性胶质芽孢杆菌分别命名为HLS-1、HLS-2、HLS-3、HLS-4、HLS-5。
本发明方法采用海水或者卤水制备的培养基结合化学诱变或辐射诱变，能够定向诱变出可以适应一定浓度的海水和含钾卤水的耐盐性胶质芽孢杆菌，可以有效的利用海水卤水作为钾盐资源，并可以适应普通土壤或者盐碱性土壤，从而可以用于开发一种新型生物有机钾肥的生产菌种。本发明的耐盐性胶质芽孢杆菌可以按常规方法用于生产有机钾肥。
具体实施方式
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1。一种耐盐性胶质芽孢杆菌的筛选培养方法，其步骤如下：
(1)将胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)在无氮培养基上活化后，转接于抑制荚膜生长的液体培养基中培养至对数生长期，离心收集菌体；
(2)用稀释后的海水或者含钾卤水悬浮菌体，并将菌体浓度稀释至10³～10⁵万个/ml，得菌体悬浮液，将菌体悬浮液用辐射诱变或者化学诱变方法进行诱变，将诱变后的菌体悬浮液离心，获得诱变菌体；
(3)取诱变菌体进行筛选、复筛，获得耐盐性菌株；方法如下：
1)用筛选培养基悬浮诱变菌体，调整诱变菌体浓度至10²～10³万个/ml，充分摇匀后，分装于96孔培养板中，每孔200μl；
2)32℃培养7天，用分光光度计检测96孔培养板中的诱变菌吸光值，选取96孔培养板中的吸光值为0.2～0.5的诱变菌体进行复筛；
3)将吸光值为0.2～0.5的诱变菌体稀释至10²～10³万个/ml，取200μl诱变菌体稀释液涂布于复筛培养基平板上，32℃培养5天，重复5次，出现黄色晕圈菌落为目标菌落，将目标菌落在复筛培养平板上进行3次单菌落纯化后获得耐盐性胶质芽孢杆菌。
实施例2。一种耐盐性胶质芽孢杆菌的筛选培养方法，其步骤如下：
(1)将胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)在无氮培养基上活化后，转接于抑制荚膜生长的液体培养基中培养至对数生长期，离心收集菌体；
(2)用稀释后的海水或者含钾卤水悬浮菌体，并将菌体浓度稀释至10³～10⁵万个/ml，得菌体悬浮液，将菌体悬浮液用辐射诱变或者化学诱变方法进行诱变，将诱变后的菌体悬浮液离心，获得诱变菌体；
(3)取诱变菌体进行筛选、复筛，获得耐盐性菌株；方法如下：
1)用筛选培养基悬浮诱变菌体，调整诱变菌体浓度至10²～10³万个/ml，充分摇匀后，分装于96孔培养板中，每孔150μl；
2)28℃培养6天，用分光光度计检测96孔培养板中的诱变菌吸光值，选取96孔培养板中的吸光值为0.2～0.5的诱变菌体进行复筛；
3)将吸光值为0.2～0.5的诱变菌体稀释至10²～10³万个/ml，取150μl诱变菌体稀释液涂布于复筛培养基平板上，28℃培养4天，重复4次，出现黄色晕圈菌落为目标菌落，将目标菌落在复筛培养平板上进行2次单菌落纯化后获得耐盐性胶质芽孢杆菌。
实施例3。实施例1或2所述的耐盐性胶质芽孢杆菌的筛选培养方法中，按照步骤(2)、(3)循环进行四～五级诱变、筛选、复筛，获得在不同浓度的海水或者含钾卤水中保持活力的耐盐性胶质芽孢杆菌；其中：
一级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为：海水或者含钾卤水∶蒸馏水＝1∶100；
二级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为：海水或者含钾卤水∶蒸馏水＝1∶25；
三级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为：海水或者含钾卤水∶蒸馏水＝1∶10；
四级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为：海水或者含钾卤水∶蒸馏水＝1∶5；
五级诱变时悬浮菌体所用的稀释后的海水或者含钾卤水浓度为：海水或者含钾卤水∶蒸馏水＝1∶1。
实施例4。实施例1或2或3所述的耐盐性胶质芽孢杆菌的筛选培养方法中，步骤(3)的1)中所述的筛选培养基为：蔗糖5.0～10.0g，稀释后的海水或者含钾卤水1000ml，pH为7.0～7.5；步骤(3)的3)中所述的复筛培养基为：蔗糖5.0～10.0g，琼脂粉15.0～20.0g；溴酚蓝或甲基红指示剂0.002～0.005g·L-1，稀释后的海水或者含钾卤水1000ml，pH 7.0～7.5。
实施例5。应用辐射诱导胶质芽孢杆菌变异，筛选获得耐盐性为1∶100～1∶1(海水或者含钾卤水∶蒸馏水)的突变菌株。
具体方法如下：在无氮培养基上活化胶质芽孢杆菌，25℃培养36小时后，转接于抑制荚膜生长的液体培养基中。25℃培养18小时后，离心收集菌体，用稀释后的海水或者含钾卤水悬浮菌体，并将菌体浓度稀释为10³～10⁵万个/ml，将菌体悬浮液用Co⁶⁰诱变，诱变剂量为5kGy，将诱变后的菌体离心收集后，用液体筛选培养基悬浮，稀释浓度为10²～10³万个/ml，充分摇匀后，分装于96孔培养板中，每孔100μl，25℃培养5天，用分光光度计，检测96孔培养板中的诱变菌吸光值，将96孔培养板中的吸光值为0.2～0.5的诱变菌体进行复筛。
将96孔培养板中的吸光值为0.2～0.5的诱变菌体稀释至10²～10³万个/ml，取100μl诱变菌体稀释液涂布于复筛培养平板上。25℃培养5天，取出现黄色晕圈的菌落在复筛培养平板上进行3次单菌落纯化后获得耐盐性菌株。
将耐盐性菌株接种于液体复筛培养基中，在25℃、200转/min条件下摇床培养3天，将培养液离心，用原子吸收光谱法测定培养液上清中的钾含量，其中培养液上清中钾含量减少15.0％以上的菌株为高效耐盐突变菌株。取该突变菌株进行下一级诱导突变。
按照上述步骤循环进行4级诱变，获得能够耐受1∶5的海水或者含钾卤水的高效耐盐突变菌株。命名为HLS-4。
所用培养基配方分别如下：
无氮培养基：
甘露醇5.0g，K₂HPO₄ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，琼脂粉15.0g蒸馏水1000ml，pH7.5。
拟制荚膜生长的液体培养基配方：
麦芽糖10.0g，(NH₄)₂SO₄ 1.0g，酵母粉0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5.0g，K₂HPO₄1.0g，蒸馏水1000ml，pH7.5。
筛选培养基：
蔗糖5.0g，稀释后的海水或者含钾卤水1000ml，pH7.0～7.5。
复筛培养基：
蔗糖5.0g，琼脂粉15.0g；溴酚蓝或甲基红指示剂0.002g·L-1，稀释后的海水或者含钾卤水1000ml，pH7.0～7.5。
实施例6。应用化学诱导方法诱导胶质芽孢杆菌变异，筛选获得耐盐性为1∶100～1∶1(海水或者含钾卤水∶蒸馏水)的突变菌株。
其具体方法如下：在无氮培养基上活化胶质芽孢杆菌，25℃培养36小时后，转接于抑制荚膜生长的液体培养基中。25℃培养18小时后，离心收集菌体，用稀释后的海水或者含钾卤水悬浮菌体，并将菌体浓度稀释为10³～10⁵万个/ml，将菌体悬浮液进行化学诱变诱变的方法为：a、紫外线照射3~8分钟，再用日光照射3～8分钟；b、以浓度为0.2～2mg/ml的亚硝基胍处理28～30分钟；c、以1.0～1.2％的硫酸二乙酯处理30～35分钟；d、硫酸二乙加紫外线处理，紫外线处理5分钟以后，加硫酸二乙酯(1％)处理15～20分钟。
将诱变后的菌体离心收集后，用液体筛选培养基悬浮，稀释浓度为10²～10³万个/ml，充分摇匀后，分装于96孔培养板中，每孔100μl，25℃培养5天，用分光光度计，检测96孔培养板中的诱变菌吸光值，将96孔培养板中的吸光值为0.2～0.5的诱变菌体进行复筛。
将96孔培养板中的吸光值为0.2～0.5的诱变菌体稀释至10²～10³万个/ml，取100μl诱变菌体稀释液涂布于复筛培养平板上。25℃培养5天，取出现黄色晕圈的菌落在复筛培养平板上进行3次单菌落纯化后获得耐盐性菌株。
将耐盐性菌株接种于液体复筛培养基中，在25℃、200转/min条件下摇床培养3天，将培养液离心，用原子吸收光谱法测定培养液上清中的钾含量，其中培养液上清中钾含量减少15.0％以上的菌株为高效耐盐突变菌株。取该突变菌株进行下一级诱导突变。
按照上述步骤循环进行5级诱变，获得能够耐受1∶1的海水或者含钾卤水的高效耐盐突变菌株。命名为HLS-5。
所用培养基配方分别如下：
无氮培养基：
甘露醇5.0g，K₂HPO₄ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，琼脂粉15.0g蒸馏水1000ml，pH7.5。
拟制荚膜生长的液体培养基配方：
麦芽糖10.0g，(NH₄)₂SO₄ 1.0g，酵母粉0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5.0g，K₂HPO₄1.0g，蒸馏水1000ml，pH7.5。
筛选培养基：
蔗糖5.0g，稀释后的海水或者含钾卤水1000ml，pH7.0～7.5。
复筛培养基：
蔗糖5.0g，琼脂粉15.0g；溴酚蓝或甲基红指示剂0.002g·L-1，稀释后的海水或者含钾卤水1000ml，pH7.0～7.5。