无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒及无机磷(磷酸根)浓度测定方法 【技术领域】
本发明涉及一种无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定无机磷(磷酸根)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术
人体内磷的87％都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持动态平衡，血中钙、磷浓度之间有一定关系，正常人血钙升高则血磷降低，反之亦然。血浆中[钙]、[磷]浓度的乘积保持在一定范围；大约每100毫升血浆钙磷浓度地乘积为35-40。当二者乘积大于40时，钙和磷以骨盐形式沉积在骨组织，＞70时，可发生转移性钙化。当乘积＜35时，则将妨碍骨组织的钙化，甚至使骨盐再溶解，影响成骨作用，引起佝偻病或软骨病。血浆[Ca]、[Pi]的恒定，主要受维生素D，甲状旁腺激素及降钙素的调节。
由于人体的磷目前还不能直接测定，所以无机磷的检测实际上是分析磷酸盐阴离子(H2PO41-，HPO42-)。常用的方法有磷钼酸还原法，非还原法，染料结合法，酶法，同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度法和流动注射分析法等。决定性方法是同位素稀释质谱法，WHO推荐的中等实验室测定无机磷的常规方法是比色法。
磷钼酸还原法又有无蛋白学滤液法和不去蛋白法，后者需在试剂中加入非离子型表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂种类很多，性能比较稳定的还原剂有硫酸亚铁，硫酸亚铁铵，硫酸肼，米吐尔等。表面活性剂则以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。
磷钼酸非还原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接测定磷钼酸杂聚化合物，方法简便，便于自动化。但黄疸，溶血，脂浊血清在340nm有光吸收，必须做标本空白，否则结果偏高。
酶法测定无机磷是发展趋势，其优点是无机磷酸盐化合物在酶作用下的中性范围内是稳定的，可用于常规样品的自动化分析。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)所导致在400-700nm波长处吸光度的上升，得以测定无机磷(磷酸根)浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行无机磷(磷酸根)浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明无机磷(磷酸根)浓度测定方法原理如下：
磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸 丙酮酸羧化酶 腺苷三磷酸+
丙酮酸+二氧化碳
丙酮酸+辅酶A+氧 丙酮酸氧化酶 过氧化氢+二氧化碳+
乙酰辅酶A
过氧化氢+还原型色原体组合 过氧化物酶
吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水
这个方法应用丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase；EC 6.4.1.1)(偶)联丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase；EC 1.2.3.6)、及过氧化物酶(peroxidase；EC 1.11.1.7)酶促反应终点比色法。丙酮酸羧化酶酶解无机磷(磷酸根)反应产生丙酮酸，再通过(偶)联合丙酮酸氧化酶、过氧化物酶的作用，最后生成的过氧化氢在过氧化物酶的作用下，将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)波长处，测定染料-吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)-含量高低的光吸收大小；通过测量400-700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)处吸光度上升的程度，得出无机磷(磷酸根)浓度大小测定结果。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，如下成分关系的本发明无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒较为理想：
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
过氧化物酶 30000U/L
丙酮酸羧化酶 10000U/L
丙酮酸氧化酶 12000U/L
腺苷二磷酸 8mmol/L
草酰乙酸 12mmol/L
辅酶A 4mmol/L
还原型色原体组合 0.1-20mmol/L
所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任何一个配对组合：
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N，N-双乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4-双氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
双甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3-甲基-乙基-羥基苯胺
4-氨基抗砒
石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒
N，N-双乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，4-双氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
4-氨基抗砒
仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒
双甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
4-氨基抗砒
3-甲基-乙基-羥基苯胺
本发明的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、辅酶A、还原型色原体组合。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、腺苷二磷酸、草酰乙酸、辅酶A。
试剂2
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶。
还原型色原体组合、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、腺苷二磷酸、草酰乙酸、辅酶A。
试剂2
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶。
还原型色原体组合、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶、腺苷二磷酸、草酰乙酸、辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
【具体实施方式】
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
丙酮酸羧化酶 10000U/L
丙酮酸氧化酶 12000U/L
过氧化物酶 30000U/L
腺苷二磷酸 8mmol/L
草酰乙酸 12mmol/L
辅酶A 4mmol/L
4-氨基抗砒 2mmol/L
石碳酸 10mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长505nm，测试副波长600nm，被测无机磷(磷酸根)样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点法，延迟时间0分钟，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长505nm吸光度上升的程度，从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大小。
实施例二
本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
腺苷二磷酸 8mmol/L
草酰乙酸 12mmol/L
辅酶A 4mmol/L
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸 0.2mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
丙酮酸羧化酶 10000U/L
丙酮酸氧化酶 12000U/L
过氧化物酶 30000U/L
4-氨基抗砒 0.6mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长546nm，测试副波长600nm，被测无机磷(磷酸根)样品与试剂的体积比例为1/20，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点法，延迟时间0分钟，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长546nm吸光度上升的程度，从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大小。
实施例三
本实施例的无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
腺苷二磷酸 8mmol/L
草酰乙酸 12mmol/L
辅酶A 4mmol/L
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 0.6mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
丙酮酸氧化酶 12000U/L
过氧化物酶 30000U/L
双甲基苯胺 2mmol/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
丙酮酸羧化酶 10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长578nm，测试副波长660nm，被测无机磷(磷酸根)样品与试剂的体积比例为1/30，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点法，延迟时间0分钟，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长578nm吸光度上升的程度，从而测算出无机磷(磷酸根)的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明：采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(ΔA/min)≤0.0016；吸光度时间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(R≥0.99)线形范围可达20mmol/L；试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±6％；试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)≤4％；试剂的灵敏度可达0.005±0.0004ΔA/mmol/L；试剂在2-8℃下保存，活性可以稳定一年；——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。