大分子胶原蛋白提取工艺 【技术领域】
本发明涉及一种胶原蛋白提取工艺，特别是一种大分子胶原蛋白提取工艺。
背景技术
胶原蛋白是一类在医用外科、美容充填、护肤品、食品、化工等行业广泛应用的原材料。目前我国胶原蛋白生产主要以猪、牛等的皮、腱等为原料经过提取、纯化得到。现有技术中胶原蛋白的提取过程基本都是采用了低温长时间浸泡提取的工艺，一般以0.5M醋酸在4℃左右浸泡72-96小时，提取时间长而且得率底，能耗高。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种提取时间短、得率高、可操作性强的大分子胶原蛋白提取工艺。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种大分子胶原蛋白提取工艺，其特点是，其步骤如下：
(1)选取鱼皮、猪皮、牛皮或切片筋腱为原料，并用清水对原料进行清洗除杂处理；
(2)取清洗后的原料用浓度为0.05-5.0mol/L的NaOH溶液在0℃-30℃条件下浸泡1-30小时，在浸泡过程中，每隔1-5小时，更换浸泡用NaOH溶液1次；浸泡完毕后，滤过，清洗；清洗后向原料中加入有机溶剂对原料进行浸泡、洗涤，原料与有机溶剂的重量体积(g/ml)百分比为0.1-10％，洗涤后再用清水进行清洗；
(3)取步骤(2)所得原料，加入浓度为0.05-10mol/L的酸性溶液在0℃-30℃的条件下进行溶胀处理2-72小时，原料和酸性溶液的重量体积比(g/ml，下同)为1∶2-50；然后将溶胀处理后的原料在0℃--40℃条件下冻结1-12小时；冻结完毕后，向原料中加入适量的0.05-10mol/L的酸性溶液进行打浆破碎至粒径不大于5mm的颗粒料浆，打浆时环境和料浆温度为0℃-30℃；
(4)向颗粒料浆中加入0.05-10mol/L的酸性溶液进行提取，所加入的酸性溶液与原料的体积重量比为5-50∶1，提取温度0℃-30℃，提取时间为1-72小时；提取完毕后，以40-80目纱网过滤，得提取液；再向滤渣中加酸性溶液，按上述操作重复提取1-2次，得提取液和滤渣，向提取液中加入NaCl至浓度为1.5-3.5mol/L进行盐析沉淀，冷冻干燥制得大分子胶原蛋白；
所述的酸性溶液为醋酸、柠檬酸或盐酸溶液；所述的有机溶剂为丙酮、四氯化碳或己烷。
在以上所述的步骤(4)中：还可以取滤渣并向其中加入0.05-10mol/L的酸性溶液，按步骤(4)所述方法重复操作提取1-2次，得提取液；合并提取液，向其中加入NaCl至浓度为1.5-3.5mol/L进行盐析沉淀，冷冻干燥制得大分子胶原蛋白。
在以上所述的大分子胶原蛋白提取工艺中：
1、步骤(2)中，有机溶剂对原料进行浸泡的时间优选为2-10小时。
2、步骤(2)中，浸泡所用的NaOH溶液的浓度优选为0.5-2.0mol/L，在0℃-20℃条件下浸泡5-20小时；在浸泡过程中，优选每隔2-3小时更换浸泡用NaOH溶液1次；洗涤时原料与所加入的有机溶剂的重量体积百分比优选为0.5-5％。
3、步骤(3)中，溶胀处理时加入的酸性溶液的浓度优选为0.5-5mol/L，溶胀处理在0℃-20℃的条件下进行，溶胀处理时间优选为10-24小时，原料和酸性溶液的重量体积比优选为1∶5-40；打浆破碎时所加入的酸性溶液的浓度优选为0.5-5mol/L，打浆时环境和料浆温度优选为0℃-20℃。
4、步骤(4)中，提取时向颗粒料浆中加入的酸性溶液的浓度优选为0.5-5mol/L；原料与酸性溶液的重量体积比优选为1∶10-40，提取温度优选0℃-20℃，提取时间优选为5-36小时。
5、所述的鱼皮可以为水产加工过程中产生的下脚料鱼皮，如鲤鱼皮、鲢鱼皮、鳕鱼皮、鱿鱼皮等；步骤(1)中对原料进行清洗除杂是为了除去原料表面的血污、粘液、鳞片等杂质。
与现有技术相比，本发明工艺具有以下优点：采用NaOH溶液浸泡可以有效地去除杂蛋白；采用有机溶剂洗涤可以有效地去除脂肪；将原料溶胀，进行溶胀处理可以使原料的厚度增加，降低了原材料组织的韧性，结合控温、冻结增加了组织的脆性，进一步降低原料的韧性；然后进行破碎，将破碎后的原料进一步提取。本发明大分子胶原蛋白提取工艺将各处理、提取步骤有机地结合起来，可以较大程度的提高蛋白的提取效率，减少提取的时间，降低提取过程的能耗，提取得到的胶原蛋白分子量不小于10万道尔顿。
【附图说明】
图1为本发明工艺提取的大分子胶原蛋白的SDS-PAGE电泳图。
图中：
1：高分子量标准蛋白(Sigma Co，USA)；
2：牛皮标准I型胶原蛋白(Sigma Co，USA)；
3：本发明工艺提取的鲤鱼皮胶原蛋白。
【具体实施方式】
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1。一种大分子胶原蛋白提取工艺，其步骤如下：
(1)选取鲤鱼皮为原料，并用清水对原料进行清洗除杂处理；
(2)取清洗后的原料用浓度为0.05mol/L的NaOH溶液在0℃条件下浸泡1小时；浸泡完毕后，滤过，清洗；清洗后向原料中加入有机溶剂对原料进行浸泡、洗涤，原料与有机溶剂的重量体积百分比为0.1％，洗涤后再用清水进行清洗；
(3)取步骤(2)所得原料，加入浓度为0.05mol/L的酸性溶液在0℃的条件下进行溶胀处理2小时，原料和酸性溶液的重量体积比为1∶2；然后将溶胀处理后的原料在-40℃条件下冻结1小时；冻结完毕后，向原料中加入适量地0.05mol/L的酸性溶液进行打浆破碎至粒径不大于5mm的颗粒料浆，打浆时环境和料浆温度为0℃；
(4)向颗粒料浆中加入0.05mol/L的酸性溶液进行提取，原料与所加入的酸性溶液的重量体积比为1∶5，提取温度0℃，提取时间为1小时；提取完毕后，以40目纱网过滤，得提取液；再向滤渣中加酸性溶液，按上述操作重复提取1次，得提取液；
(5)合并提取液，向提取液中加入NaCl至浓度为1.5mol/L进行盐析沉淀，冷冻干燥制得大分子胶原蛋白。
所述的有机溶剂为丙酮；有机溶剂对原料进行浸泡的时间为2小时；所述的酸性溶液为醋酸溶液。
实施例2。一种大分子胶原蛋白提取工艺，其步骤如下：
(1)选取猪皮为原料，并用清水对原料进行清洗除杂处理；
(2)取清洗后的原料用浓度为5.0mol/L的NaOH溶液在30℃条件下浸泡30小时，在浸泡过程中，每隔5小时，更换浸泡用NaOH溶液1次；浸泡完毕后，滤过，清洗；清洗后向原料中加入有机溶剂对原料进行浸泡、洗涤，原料与有机溶剂的重量体积百分比为10％，洗涤后再用清水进行清洗；
(3)取步骤(2)所得原料，加入浓度为10mol/L的酸性溶液在30℃的条件下进行溶胀处理72小时，原料和酸性溶液的重量体积比为1∶50；然后将溶胀处理后的原料在0℃条件下冻结12小时；冻结完毕后，向原料中加入适量的10mol/L的酸性溶液进行打浆破碎至粒径不大于4mm的颗粒料浆，打浆时环境和料浆温度为30℃；
(4)向颗粒料浆中加入10mol/L的酸性溶液进行提取，原料与所加入的酸性溶液的重量体积比为1∶50，提取温度30℃，提取时间为72小时；提取完毕后，以80目纱网过滤，得提取液；再向滤渣中加酸性溶液，按上述操作重复提取2次，得提取液；
(5)合并提取液，向提取液中加入NaCl至浓度为3.5mol/L进行盐析沉淀，冷冻干燥制得大分子胶原蛋白。
所述的有机溶剂为四氯化碳；有机溶剂对原料进行浸泡的时间为10小时；所述的酸性溶液为柠檬酸溶液。
实施例3。一种大分子胶原蛋白提取工艺，其步骤如下：
(1)选取牛皮为原料，并用清水对原料进行清洗除杂处理；
(2)取清洗后的原料用浓度为0.5mol/L的NaOH溶液在5℃条件下浸泡5小时，在浸泡过程中，每隔2小时，更换浸泡用NaOH溶液1次；浸泡完毕后，滤过，清洗；清洗后向原料中加入有机溶剂对原料进行浸泡、洗涤，原料与有机溶剂的重量体积百分比为0.5％，洗涤后再用清水进行清洗；
(3)取步骤(2)所得原料，加入浓度为0.5mol/L的酸性溶液在5℃的条件下进行溶胀处理12小时，原料和酸性溶液的重量体积比为1∶10；然后将溶胀处理后的原料在-18℃条件下冻结2小时；冻结完毕后，向原料中加入适量的0.5mol/L的酸性溶液进行打浆破碎至粒径不大于3mm的颗粒料浆，打浆时环境和料浆温度为10℃；
(4)向颗粒料浆中加入0.5mol/L的酸性溶液进行提取，原料与所加入的酸性溶液的重量体积比为1∶10，提取温度5℃，提取时间为5小时；提取完毕后，以50目纱网过滤，得提取液；再向滤渣中加酸性溶液，按上述操作重复提取2次，得提取液；
(5)合并提取液，向提取液中加入NaCl至浓度为2mol/L进行盐析沉淀，冷冻干燥制得大分子胶原蛋白。
所述的有机溶剂为己烷；有机溶剂对原料进行浸泡的时间为5小时；所述的酸性溶液为盐酸溶液。
实施例4。一种大分子胶原蛋白提取工艺，其步骤如下：
(1)选取厚度2-3mm为切片筋腱为原料，并用清水对原料进行清洗除杂处理；
(2)取清洗后的原料用浓度为1.0mol/L的NaOH溶液在15℃条件下浸泡20小时，在浸泡过程中，每隔3小时，更换浸泡用NaOH溶液1次；浸泡完毕后，滤过，清洗；清洗后向原料中加入有机溶剂对原料进行浸泡、洗涤，原料与有机溶剂的重量体积百分比为2％，洗涤后再用清水进行清洗；
(3)取步骤(2)所得原料，加入浓度为1mol/L的酸性溶液在15℃的条件下进行溶胀处理26小时，原料和酸性溶液的重量体积比为1∶20；然后将溶胀处理后的原料在-28℃条件下冻结3小时；冻结完毕后，向原料中加入适量的2mol/L的酸性溶液进行打浆破碎至粒径不大于5mm的颗粒料浆，打浆时环境和料浆温度为15℃；
(4)向颗粒料浆中加入2mol/L的酸性溶液进行提取，原料与所加入的酸性溶液的重量体积比为1∶30，提取温度6℃，提取时间为18小时；提取完毕后，以60目纱网过滤，得提取液；再向滤渣中加酸性溶液，按上述操作重复提取1次，得提取液；
(5)合并提取液，向提取液中加入NaCl至浓度为2.5mol/L进行盐析沉淀，冷冻干燥制得大分子胶原蛋白。
所述的有机溶剂为四氯化碳；有机溶剂对原料进行浸泡的时间为12小时；所述的酸性溶液为醋酸溶液。
实施例5。一种大分子胶原蛋白提取工艺，其步骤如下：
(1)选取鲢鱼皮为原料，并用清水对原料进行清洗除杂处理；
(2)取清洗后的原料用浓度为2.0mol/L的NaOH溶液在20℃条件下浸泡20小时，在浸泡过程中，每隔3小时，更换浸泡用NaOH溶液1次；浸泡完毕后，滤过，清洗；清洗后向原料中加入有机溶剂对原料进行浸泡、洗涤，原料与有机溶剂的重量体积百分比为5％，洗涤后再用清水进行清洗；
(3)取步骤(2)所得原料，加入浓度为5mol/L的酸性溶液在20℃的条件下进行溶胀处理10小时，原料和酸性溶液的重量体积比为1∶5；然后将溶胀处理后的原料在-5℃条件下冻结8小时；冻结完毕后，向原料中加入适量的5mol/L的酸性溶液进行打浆破碎至粒径不大于1mm的颗粒料浆，打浆时环境和料浆温度为20℃；
(4)向颗粒料浆中加入5mol/L的酸性溶液进行提取，原料与所加入的酸性溶液的重量体积比为1∶10，提取温度20℃，提取时间为5小时；提取完毕后，以70目纱网过滤，得提取液；再向滤渣中加酸性溶液，按上述操作重复提取1次，得提取液；
(5)合并提取液，向提取液中加入NaCl至浓度为1.8mol/L进行盐析沉淀，冷冻干燥制得大分子胶原蛋白。
有机溶剂对原料进行浸泡的时间为8小时。
实施例6。一种大分子胶原蛋白提取工艺，其步骤如下：
(1)选取鳕鱼皮为原料，并用清水对原料进行清洗除杂处理；
(2)取清洗后的原料用浓度为3.0mol/L的NaOH溶液在12℃条件下浸泡10小时，在浸泡过程中，每隔2小时，更换浸泡用NaOH溶液1次；浸泡完毕后，滤过，清洗；清洗后向原料中加入有机溶剂对原料进行浸泡、洗涤，原料与有机溶剂的重量体积百分比为2.5％，洗涤后再用清水进行清洗；
(3)取步骤(2)所得原料，加入浓度为2.5mol/L的酸性溶液在10℃的条件下进行溶胀处理15小时，原料和酸性溶液的重量体积比为1∶25；然后将溶胀处理后的原料在-12℃条件下冻结3小时；冻结完毕后，向原料中加入适量的2.5ol/L的酸性溶液进行打浆破碎至粒径不大于2mm的颗粒料浆，打浆时环境和料浆温度为10℃；
(4)向颗粒料浆中加入2.5mol/L的酸性溶液进行提取，原料与所加入的酸性溶液的重量体积比为1∶35，提取温度100℃，提取时间为36小时；提取完毕后，以50目纱网过滤，得提取液；再向滤渣中加酸性溶液，按上述操作重复提取2次，得提取液；
(5)合并提取液，向提取液中加入NaCl至浓度为2.8mol/L进行盐析沉淀，冷冻干燥制得大分子胶原蛋白。
有机溶剂对原料进行浸泡的时间为18小时。
实施例7。一种大分子胶原蛋白提取工艺，其步骤如下：
(1)选取鱼皮为原料，并用清水对原料进行清洗除杂处理；
(2)取清洗后的原料用浓度为7.0mol/L的NaOH溶液在18℃条件下浸泡18小时，在浸泡过程中，每隔4小时，更换浸泡用NaOH溶液1次；浸泡完毕后，滤过，清洗；清洗后向原料中加入有机溶剂对原料进行浸泡、洗涤，原料与有机溶剂的重量体积百分比为7％，洗涤后再用清水进行清洗；
(3)取步骤(2)所得原料，加入浓度为7mol/L的酸性溶液在18℃的条件下进行溶胀处理60小时，原料和酸性溶液的重量体积比为1∶45；然后将溶胀处理后的原料在-35℃条件下冻结2小时；冻结完毕后，向原料中加入适量的7mol/L的酸性溶液进行打浆破碎至粒径不大于3mm的颗粒料浆，打浆时环境和料浆温度为18℃；
(4)向颗粒料浆中加入7mol/L的酸性溶液进行提取，原料与所加入的酸性溶液的重量体积比为1∶45，提取温度18℃，提取时间为50小时；提取完毕后，以40目纱网过滤，得提取液；再向滤渣中加酸性溶液，按上述操作重复提取2次，得提取液；
(5)合并提取液，向提取液中加入NaCl至浓度为2mol/L进行盐析沉淀，冷冻干燥制得大分子胶原蛋白。
所述的有机溶剂为四氯化碳；有机溶剂对原料进行浸泡的时间为6小时；所述的酸性溶液为醋酸溶液。
实施例8。一种大分子胶原蛋白提取工艺，其步骤如下：
(1)选取鱿鱼皮为原料，并用清水对原料进行清洗除杂处理；
(2)取清洗后的原料用浓度为0.05mol/L的NaOH溶液在0℃条件下浸泡1小时；浸泡完毕后，滤过，清洗；清洗后向原料中加入有机溶剂对原料进行浸泡、洗涤，原料与有机溶剂的重量体积百分比为0.1％，洗涤后再用清水进行清洗；
(3)取步骤(2)所得原料，加入浓度为0.05mol/L的酸性溶液在0℃的条件下进行溶胀处理2小时，原料和酸性溶液的重量体积比为1∶2；然后将溶胀处理后的原料在-40℃条件下冻结1小时；冻结完毕后，向原料中加入适量的0.05mol/L的酸性溶液进行打浆破碎至粒径不大于5mm的颗粒料浆，打浆时环境和料浆温度为0℃；
(4)向颗粒料浆中加入0.05mol/L的酸性溶液进行提取，原料与所加入的酸性溶液的重量体积比为1∶5，提取温度0℃，提取时间为1小时；提取完毕后，以40目纱网过滤，得提取液，向提取液中加入NaCl至浓度为1.5mol/L进行盐析沉淀，冷冻干燥制得大分子胶原蛋白。
所述的有机溶剂为丙酮；有机溶剂对原料进行浸泡的时间为2小时；所述的酸性溶液为醋酸溶液。
实施例9。参照图1。鲤鱼鱼皮胶原蛋白的提取工艺。
其步骤如下：
(1)原料处理：取新鲜鲤鱼鱼皮或冷冻鲤鱼鱼皮，鲤鱼鱼皮的厚度为1-2mm，大小基本一致，原料无腐烂、霉变的现象；将冻结原料首先用自来水流水解冻，解冻后的原料用自来水清洗，除去原料表面的血污、粘液、鳞片等杂质，洗涤水温度为4℃；洗后称重并计算得原料干重为172.95克；( 2)除杂蛋白：杂蛋白的去除采用NaOH溶液浸泡，NaOH溶液的浓度为0.5mol/L，浸泡时间20小时，浸泡温度4℃，在浸泡过程中，不断搅拌，每隔5小时，更换NaOH溶液1次；
(3)除脂肪：采用有机溶剂四氯化碳4℃浸泡10小时，脱除脂肪；
(4)去除部分脂肪的原料皮按照1∶30的比例加入醋酸溶液进行溶胀，醋酸溶液的浓度为0.5mol/L，溶胀温度为4℃，溶胀时间为24小时，溶胀后的原料皮厚度增加，柔韧性明显降低；
(5)溶胀后的原料初步冻结，冻结温度为-20℃，冻结时间为4小时，冻结的目的是增加原料的脆性，降低原料的韧性，不需要深度冻结，冻结程度可以依据原料的厚度和溶胀的程度决定；冻结后原料加入适量浓度为0.5mol/L的醋酸溶液，4℃下进行打浆破碎0.5分钟，打浆后颗粒大小在2mm以内，打浆及环境温度为4℃；然后向其中加入0.5mol/L的醋酸溶液进行一次提取48小时，原料与醋酸溶液的重量体积比为1∶20，提取完毕后，以40目纱网过滤，得提取液和滤渣；
(6)向提取液中加入NaCl至浓度为2.5mol/L进行盐析沉淀，冷冻干燥制得大分子胶原蛋白，称重73.60g；
(7)向滤渣中加入醋酸溶液进行二次提取，提取方同一次提取，得提取液，向提取液中加入NaCl至浓度为2.5mol/L进行盐析沉淀，冷冻干燥制得大分子胶原蛋白，称重36.59g；
采用SDS-PAGE电泳检测方法对制得大分子胶原蛋白进行检测，具体过程参考文献：Laemmli，U.K.(1970).Cleavage of structural proteins duringassembly head of bacteriophage T4.Nature，277，680-685，结果参见图1，说明它是一种大分子胶原蛋白。
本实施例大分子胶原蛋白的提取率参见下表：
注：原料干重质量＝新鲜原料质量*[1-水分含量％(48.5％)]