乙型肝炎病毒（HBV）感染是具有世界范围重要性的公共卫生问题。乙型肝炎病毒造成不可治愈的、有时是致命的肝病，单是在美国每年估计就要有两万名新患者。在远东、非洲和东欧，约10%的人口是慢性HBV携带者，其结果是慢性活动型肝炎和肝硬变成为主要死因。另外，有强有力的证据表明，HBV携带者极易患肝癌，HBV是已知与人类癌症有关的少数病毒之一。 因此，迫切需要生产出安全的和经济上可行的疫苗，以预防HBV感染。已经采用了几种方法生产这类疫苗（参见Tiollais等，Nature 1985年317卷489-495页;Patzer等，Vaccines，1985年85卷261-264页，Cold Spring Harbour;Zuckerman，Infection1986年13卷增刊A61-71页的综述。）
正如以上综述中所述，已生产出的所有疫苗的基本组分都是乙型肝炎表面抗原（HBsAg）。该抗原最初是从慢性HBV感染患者的血浆中分离出来地，用来作为抗HBV感染的有效疫苗。
HBV感染携带者血浆中的HBsAg，以42 nm HBV传染性病毒粒子（Dane粒子）和非传染性22 nm粒子两种形式存在，后者不含HBV-DNA和其它HBV结构蛋白。这些22 nm粒子在人类HBV慢性携带者体内或在HBV病毒血症期间过量产生，它们可由经HBV转化的肝细胞瘤细胞系分泌出来。
这种22 nm HBsAg粒子具有高度的免疫原性，由六种相关蛋白组成：（a）主蛋白P-24和GP-27，前者是分子量为24，000（24K）道尔顿的未糖基化形式，后者是分子量为27，000（27K）道尔顿的糖基化形式的P-24。它们是由HBV基因组的S区编码的，有226个氨基酸;（b）次蛋白GP-33和GP-36，前者是分子量为33，000道尔顿（33K）的单糖基化形式，后者是分子量为36，000道尔顿（36K）的双糖基化形式。它们是由HBV基因组的前-S2区和S区编码的，有281个氨基酸（226个S区+55个前-S2区）;（c）次蛋白P-39和GP-42，前者是未糖基化形式，后者是P-39的糖基化形式，二者的分子量分别为39，000和42，000道尔顿（39K，42K）。它们由HBV基因组的前-S1、前-S2和S区编码，有389至400个氨基酸（226个S+55个前-S2+〔108-119〕个前-S1）。因此，HBsAg 22 nm粒子的所有蛋白质都在HBV基因组DNA的同一不间断顺序中编码，它们的最终形式取决于基因表达（转录和转译）由何处起始，以及它们是否是或者在多大程度上在转译后糖基化。
22 nm HBsAg粒子可以由P-24/GP-27（S区）组装，与前-S2和前-S1产物无关。近来已经证明，前-S2特异蛋白GP-33和GP-36，以及前-S1特异蛋白GP-39和GP-42，具有和P-24无关的抗原决定簇，存在于HBsAg 22 nm粒子中时会使免疫原性增强。
另外，在有前-S2和前-S1蛋白存在时，22 nm HBsAg粒子具有和聚合的人血清清蛋白相结合的能力，这种能力与HBV病毒粒子在HBV感染期间与靶细胞结合的能力直接相关。因此，含有前-S和S区蛋白决定簇的HBsAg粒子能够作为疫苗使用，这种疫苗会诱发出应答反应而中和病毒粒子并阻止这些粒子感染靶细胞。这种疫苗按照这种方式提供了对HBV感染的长期有效预防作用（例如参见Persing等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1985年82卷3440-3444页;Neurath等，Nature，1985年315卷154-156页;Neurath等，Cell，1986年46卷429-436页;Petit等，Mol.Immunol.，1986年23卷511-523页;Milich等，J.Immunol.，1986年137卷315-322页。）HBsAg疫苗的生产方法和用这些方法生产的疫苗
1.来源于血浆的疫苗
一般来说，批准使用并用在免疫接种计划中的原始HBsAg疫苗，是由慢性HBV携带者的血浆得到的。以下是生产来源于血浆的疫苗的方法实例：
（a）Merk、Sharp和Dohme公司生产的Heptavax B疫苗（见Hilleman等的综述，J.Infection，1983年第7卷增刊Ⅰ第3-8页）;
（b）巴斯德研究所生产的Hevac B疫苗（见Adamowicz等的综述，Vaccine，1984年第2卷209-214页;1982年6月15日颁发的美国专利4，335，214）。
以上两种方法都声称得到了来源于血浆的纯度很高的HBsAg 22 nm粒子，其中不含传染性污染物，因此作为人类疫苗使用是安全的。但是，在这些方法中采用的关键步骤既耗时又昂贵，因为它们涉及聚乙二醇（PEG）或硫酸铵分级分离及后续的蔗糖和氯化铯梯度超离心。曾有人描述过生产来源于血浆的HBsAg疫苗的其它更快速、更廉价的方法，但这些方法通常都包括聚乙二醇或硫酸铵分级、用超离心法等密度分离和在各种色谱树脂上色谱分离等步骤。所有这些方法都昂贵而耗时，结果使来源于人血浆的疫苗成本高昂（综述见Maupas和Guesry编著的“乙型肝炎疫苗”，Elsevier/North Holland Biomedical出版社，Amsterdam，New York，Oxford，1981）。最后，来源于血浆的含HBsAg 22 nm粒子的疫苗的主要缺点是它对健康的潜在危害。虽然这些生产方法使用了某些物质使可能的共纯化污染物（可能包括艾滋病毒）失活，但是仍然存在这些疫苗可能引起不良副反应的潜在危险（参见Walgate，Nature 1983年304卷297页）。由于这个原因，已应用DNA重组技术生产供疫苗用的22 nm HBsAg粒子，这提供了一种有效而安全的方法，所得到的HBsAg粒子不含来自人血浆的有潜在危险的污染物。
2.利用在原核生物（大肠杆菌）体系中重组的方法生产HBsAg疫苗
已有人描述了构建表达HBsAg的重组载体和质粒的方法以及纯化来自原核生物体系的HBsAg的方法（例如参见1984年1月31日授予Galilbert等的美国专利4，428，941和武田药品工业株式会社的专利申请：1983年1月5日公开的EPO 068719 A2和1986年1月30日公开的WO 86/00640）。由这些转化的细菌体系生产HBsAg的方法是以先前所述的生产来源于血浆的HBsAg的方法为基础的。但是，因为这些原核生物体系不能分泌所产生的HBsAg，所以必须有一个溶解转化细胞的附加步骤。这就产生了将潜在有害的细菌内毒素共纯化的可能性。另外，原核生物体系既不能将HBsAg产物糖基化，也不能将它们组装成22 nm粒子。因此，用这种方法制得的疫苗不如来源于血浆的产品（见Charnay等，Nature，1980年286卷893-895页）。
因此，已研究出生产重组HBsAg的真核表达体系;这些体系能产生既糖基化又组装成22 nm粒子的HBsAg。
3.用酵母细胞在真核细胞培养物中生产HBsAg疫苗
用酵母细胞在真核细胞培养物中生产的HBsAg疫苗的实例，包括市售的由Merck、Sharp和Dohme（MSD）生产的Recombivax HB疫苗（见Emini等，J.Infection，1986年13卷增刊A第3-9页）和SmithKline Beckman公司生产的重组HBsAg疫苗（见1987年1月10日颁发的美国专利4，649，192和1986年10月29日公开的欧洲专利申请199698A）。
但是，用这些方法生产的HBsAg粒子只是S区的产物，没有前-S1或前-S2决定簇，因为转化质粒只含有S区顺序。因此，这些粒子不象来源于血浆的“天然”粒子那样具有免疫原性。酵母细胞也不能分泌HBsAg粒子，而且尽管它们能将HBsAg蛋白糖基化，这种糖基化作用也与哺乳动物细胞不同。虽然在酵母中发生了22nm粒子的组装，但是这些粒子不稳定。这种生产方法需要对酵母产生的HBsAg进行化学处理，才能得到与来源于血浆的产品相类似的最终产品;福尔马林处理也被认为是必需的，以便使产品对人类使用安全。这些方法和使用洗涤剂和尿素的纯化步骤，都会从结构上改变HBsAg分子，导致抗原性丧失，生产成本提高。
最近，利用酵母体系生产了除S区决定簇之外还含有前-S2决定簇的HBsAg粒子（例如参见EPO 171908 A3，1986年2月19日公开，日本武田药品工业株式会社;以及EPO 175261 A2，1986年3月26日公开，Chiron公司）。虽然所提出的这些疫苗确实含有前-S2区决定簇，但是它们仍缺乏前-S1区的决定簇。另外，因为使用酵母体系，这些生产方法仍存在上述问题。
因此，哺乳动物细胞培养法看来是生产HBsAg粒子疫苗的最优越的体系。
4.在哺乳动物细胞培养体系生产的疫苗及其生产方法
在哺乳动物细胞培养体系中，HBsAg粒子的糖基化与人类携带者的“天然”HBV粒子的糖基化相同。生产出的HBsAg粒子也以“天然”方式组装，不需要进一步的化学处理。最后，22 nm HBsAg粒子由这些细胞分泌到培养基中，容易从培养基中纯化出这些粒子而不必溶解细胞。
但是，在哺乳动物组织培养中合成重组HBsAg疫苗时，主要问题是组装成真实22 nm HBsAg粒子的全谱HBsAg蛋白的合成。看来含前-S1的蛋白质（P-39和GP-42）会抑制22 nm HBsAg粒子的分泌（例如参见Ou和Rutter，J.Virol，1987年61卷782-786页;Persing等，J.Virol，1987年61卷1672-1677页）。
用哺乳动物细胞体系生产的一些可能的HBsAg疫苗，使用异源致癌病毒表达载体（例如SV 40、腺病毒）来指导HBsAg的表达。这些方法使生产出的HBsAg粒子只表达出前-S2和S区，不含前-S1决定簇。使用异源调控成分来表达HBsAg粒子造成了低效率的组装，从而使收率降低。因为收率低和缺乏前-S1区，它的免疫原性也差。最后，在这些体系中描述的纯化方法既耗时又昂贵，一般要涉及到用聚乙二醇或硫酸铵分级，随后超离心处理，以得到纯化的HBsAg（例如参见EPO 0389765 A1，1981年10月28日公开;EPO 145589 A3，1985年6月19日公开;EPO 201416 A1，1986年11月12日公开;EPO 185573 A1，1986年6月25日公开，全都转让给巴斯德研究所）。
曾有人描述了由重组哺乳动物细胞培养物生产HBsAg粒子的其它方法（例如参见EPO 168234 A2，1986年1月15日公开，转让给Genentech公司）。但是这种体系也采用硫酸铵或聚乙二醇分级及离心等耗时而昂贵的步骤来得到纯化的产物。这种体系中的HBsAg粒子最终产物只含S区蛋白。
近来又有人描述了一种体系，据称它成功地采用哺乳动物细胞培养体系生产了HBsAg粒子，其中含有带有所有免疫原性决定簇即前-S1、前-S2和S的蛋白质。但是，这一体系也使用异源基因表达调控顺序（一种小鼠金属硫因启动子），它需要在重金属离子和/或类固醇激素存在下培养细胞）。如果不把这些离子和/或激素从最终产物中除掉，可能有潜在的危害。此外，所述的生产方法也包括聚乙二醇分级和随后离心以纯化产物的步骤，耗时而且昂贵。再者，因为在表达体系中使用异源基因调控顺序，前-S1、前-S2和S决定簇的化学计量对于得到具有高度免疫原性的HBsAg产物可能不理想（例如参见EPO 198474 A1，1986年10月22日公开，转让给Endotronics公司）。
5.在哺乳动物细胞培养体系中生产疫苗的新方法
鉴于生产重组哺乳动物细胞疫苗的上述缺点，申请人研究出一种新的廉价方法，用以生产大量的高度纯化的HBsAg粒子，它们具有高度的免疫原性，而且与“天然”产物非常相近。这种粒子为极其有效和廉价的疫苗提供了基础。此外，这种新产品含有所有的抗原决定簇，即前-S1、前-S2和S区决定簇，它们是在采用“天然”HBV基因调控顺序的表达体系中产生的，形成的粒子在化学计量上和来源于血浆的“天然”粒子相似。
本发明提供了一种生产纯化的乙型肝炎表面抗原粒子的新方法，该方法包括：
（a）在培养基中培养产生这些粒子的哺乳动物细胞，使细胞向培养基中分泌乙型肝炎表面抗原粒子，培养基中添加有不含分子量大于约3×105道尔顿的分子的血清;
（b）从所得的含有乙型肝炎表面抗原粒子的培养基中去除全细胞、细胞碎片和颗粒聚集体;
（c）处理得到的培养基，以浓缩和纯化其中存在的乙型肝炎表面抗原粒子;
（d）回收所得的浓缩和纯化的乙型肝炎表面抗原粒子。
在本发明的一种特别优选的方法中，采用以下步骤可以得到纯化和浓缩的人乙型肝炎表面抗原：
（a）在培养基中培养产生所述粒子的哺乳动物细胞，使细胞向培养基中分泌人乙型肝炎表面抗原粒子，培养基中添加有不含分子量大于约3×105道尔顿的分子的血清;
（b）从所得的含有人乙型肝炎表面抗原粒子的培养基中去除全细胞、细胞碎片和颗粒聚集体;
（c）对所得的培养基进行处理，以得到含有浓缩的人乙型肝炎表面抗原粒子的溶液;
（d）对所得的含浓缩抗原粒子的溶液进行处理，以减少溶液中的DNA含量;
（e）如有必要，调节如此形成的含有浓缩和纯化表面抗原粒子的溶液的pH，以使其pH在约3.0和7.0之间;
（f）纯化所得溶液中存在的浓缩表面抗原粒子;
（g）回收纯化和浓缩的人乙型肝炎表面抗原粒子。
更具体地说，本发明涉及一种纯化乙型肝炎表面抗原粒子，尤其是具有高度免疫原性的22 nm HBsAg粒子的新方法。这些粒子用来作为抗原诱发免疫反应，以中和HBV病毒对靶细胞的感染。更具体地说，这种纯化方法的特征在于采用一种新的预分级步骤，即利用超滤，从乙型肝炎表面抗原粒子分泌于其中的培养基中去除分子量大于约3×105道尔顿的分子。
本发明的纯化方法涉及各种步骤。在第一步中，使HBsAg粒子生长并分泌到添加有生长血清的培养基中。此培养基先经过预分级以去除高分子量（即300K以上）的细胞污染物。补给性培养基的预分级是一个重要步骤，有了这个步骤，就能以最少数目的纯化步骤达到高纯度。分子量大于约3×105道尔顿的分子包括高分子量的蛋白质复合污染物，这些污染物来自培养基中使用的胎牛血清，事先将其去除有以下好处：
（1）细胞可以在含有高含量胎牛血清（FCS）的培养基中生长;
（2）促进了细胞生长，因为高分子量复合物可能对细胞生长有抑制作用;
（3）简化了HBsAg的纯化，因为这些高分子量的蛋白质复合物通常是纯化过程中去除的主要污染物。
随后的纯化步骤主要要求高分子量的HBsAg粒子与分子量较低的分子（即，蛋白质污染物）相分离。首先，从所形成的含乙型肝炎表面抗原粒子的培养基中去除全细胞、细胞碎片和颗粒聚集体。然后，处理所得的培养基，以将其中存在的乙型肝炎表面抗原粒子浓缩和纯化，然后移出所得的浓缩和纯化的乙型肝炎表面抗原粒子。这些步骤在以后的实施例中，特别是在实施例5中，将有更详细的叙述。
在本发明的一项特别优选的实施方案中，生产出了纯化和浓缩的人乙型肝炎表面抗原。在该方法中，在实施例5提到的纯化方法的头三步（即，培养基的预分级;从收集到的含HBsAg粒子的培养基中去除全细胞、细胞碎片和颗粒聚集体;处理所得的培养基以得到含有浓缩人HBsAg粒子的溶液）之后，还包括上述纯化方法的一种变型。对所得的含有浓缩抗原粒子的溶液进行处理，以减少溶液中的DNA含量，然后若有必要，调节pH，使pH值处在约3.0和7.0之间。在本发明的一项优选实施方案中，用酸处理溶液来调节pH，使溶液出现混浊。混浊物中含有蛋白质污染物，可以与乙型肝炎表面抗原粒子分开。随后回收纯化和浓缩的人乙型肝炎表面抗原粒子。在实施例11中更详细地叙述了这些差别，以及这些差别与实施例5中所用的方法相比所具有的优点。
利用本发明的方法，实现了在含有胎牛血清的培养基中促进细胞生长，同时能以简化的方式将这些细胞分泌的HBsAg粒子高度纯化。此方法不使用聚乙二醇或硫酸铵分级;也无需用离心法（包括超离心）或亲合色谱法分离。此方法快速而有效，以高收率生产高度纯化的产物，而且因为它以可循环使用的组分为基础，所以很便宜。因此申请人能以很低的成本制得高纯度的产物。这就使申请人能为范围宽得多的潜在用户提供有效的HBV疫苗，这些用户以前可能负担不起现有的贵得多的疫苗。
最后，本发明提供了用哺乳动物细胞体系生产的HBsAg粒子，它含有天然存在的所有抗原决定簇（前-S1、前-S2和S），其数量与“天然”化学计量相似。此产品对于所有的潜在用户都具有免疫原性，而且由于还具有前-S1决定簇，可以克服对S区或前-S2区决定簇无反应的问题。
图1：示意表示了pSPHBV8-1的构建。p7.5AL26（11，800碱基对）用PstI消化，分离出3800碱基对的片段。此片段含有HBV顺序，与人Alexander DNA邻接，通过用T4DNA连接酶连接而亚克隆在pSP 64的PstI位点。
图2：示意表示了pSPHBVB8的构建。pSPHBV8-1用EcoRI和XbaI充分消化，接着分离出500碱基对的片段，其中含有HBV-AL 26启动子和前-S1编码顺序。在另一个反应中，pSPHBVB8-1用EcoRI和PstI消化，分离出含前-S2和S编码顺序的2400碱基对片段以及HBV-AL 26增强子和多聚腺苷酸化信号。两个片段都以三连接法串联亚克隆到用XbaI和PstI切割后的pSP 65中。
图3：示意表示了pSPHBVA 13和pSPHBVB 813的构建。利用EcoRI消化pSVE 100-dhfr，用Klenow片段填平末端，再用SmaI消化，从pSVE 100-dhfr中分离出与SV 40PE和SV 40多腺苷酸化信号邻接的dhfr基因。将1300碱基对的平末端片段亚克隆到pSPHBV 8-1和pSPHBVB 8的PvuⅡ位点，形成质粒pSPHBVA 13和pSPHBVB 813，它携有HBsAg及dhfr的顺序。
图4：说明生产和纯化HBsAg粒子的优选方法A的流程图。
图5：HBsAg的蔗糖梯度分离-纯化的HBsAg粒子。将粒子加到50-5%蔗糖的蔗糖梯度上，在16-21℃下，以27000转/分的转速于Beckman SW 27转子中超离心18小时。以1.8ml为一级分从底部收集各级分，分析HBsAg的存在和蔗糖浓度（用折射仪）。
图6：HBsAg的固相放射免疫测定：使用固相放射免疫测定试剂盒（Travenol）。
（a）将已知标准物（Abbott）与申请人的重组HBsAg（CHO）的校准曲线相比较。
（b）在CHO细胞中产生的重组HBsAg疫苗-申请人的疫苗（CHO）的校准曲线与来源血浆的（HBsAg）疫苗-HeptavaxB和酵母重组疫苗-Recombivax HB的校准曲线相比较。
图7：利用血清转化测定HBsAg效力：申请人的疫苗（CHO）与来源于血浆的疫苗-Heptavax B及酵母重组疫苗-Recombivax HB相比较。
用1毫升疫苗在Balb/c小鼠腹膜内注射（每个疫苗浓度用10只小鼠）。注射后30天抽小鼠血，用对照参考血清（WHO）校正过的Ausab EIA试剂盒（Abbott）试验血清中抗HBsAg抗体的存在。
图8：说明生产和纯化HBsAg粒子的特别优选方法（优选方法B）的流程图。
图9：说明生产和纯化HBsAg粒子的优选方法C的流程图。
图10：与酵母重组疫苗-Recombivax HB相比，注射申请人疫苗的无反应小鼠体内抗S抗体的检测和定量。
本发明提供生产纯化的乙型肝炎表面抗原粒子的新方法，该方法包括：
（a）在培养基内培养产生这些粒子的哺乳动物细胞，使细胞向培养基中分泌乙型肝炎表面抗原粒子，培养基中添加有不含分子量大于约3×105道尔顿的分子的血清;
（b）从所得的含有乙型肝炎表面抗原粒子的培养基中去除全细胞、细胞碎片和颗粒聚集体;
（c）对所得的培养基进行处理，以将其中存在的乙型肝炎表面抗原粒子浓缩和纯化;
（d）回收所得的浓缩和纯化的乙型肝炎表面抗原粒子。
用以上方法生产的粒子可以是人乙型肝炎表面抗原粒子。
本发明还提供一种回收纯化HBsAg粒子的方法，该方法包括，进一步纯化步骤（c）中得到的HBsAg粒子以除去低分子量污染物，其作法是使含有粒子的溶液通过一个色谱柱并回收这些粒子。步骤（c）的浓缩在适当的条件下进行，以便能在非间歇式纯化系统中将粒子进一步纯化。
本发明的一个要素是，在含有分泌肝炎病毒粒子的哺乳动物细胞的培养基中加入血清，例如胎牛血清，在将哺乳动物细胞置于培养基中之前，血清中应不含高分子量的污染蛋白（即，分子量大于约300，000道尔顿的蛋白）。利用（例如）将血清预分级，即利用超滤，从血清中除去这些蛋白。
不除去血清中分子量大于约300K的污染蛋白，会使后继的纯化步骤中污染蛋白的含量很高，降低收率和纯度。
虽然在本发明中利用超滤进行预分级，但本领域技术人员会理解，任何能减少加到培养基中的血清中高分子量污染蛋白的方法都会得到同样的效果。
乙型肝炎表面抗原粒子与全细胞、细胞碎片和颗粒聚集体的分离，也可以用本领域技术人员已知的任何方法进行，但优选超滤法。滤液中含有由超滤步骤得到的HBsAg粒子，将其收集起来进一步纯化。
因为在分离步骤（b）中使用的批料的体积对于后继的在色谱柱上纯化的优选步骤（例如凝胶色谱步骤）来说太大了，所以可以将HBsAg粒子进一步浓缩和纯化。进行纯化时最好是将分离步骤（b）之后得到的滤液进行超滤，除去分子量低于约300K的污染分子。保留物中含有所要的HBsAg粒子，可以将其进一步纯化。在本发明的一项优选实施方案中，进一步纯化是通过透析进行的，透析之后最好进行另一次超滤，以进一步浓缩。
然后可以用色谱法，最好是用凝胶过滤柱，进一步纯化这种浓缩和纯化的HBsAg粒子，以进一步除去小分子量的污染粒子。凝胶过滤步骤最好再重复一次以进一步纯化。凝胶过滤色谱最好是在用N，N′-亚甲基双丙烯酰胺共价交联的烯丙基葡聚糖柱上进行。这种凝胶过滤柱排除分子量大于约1×106道尔顿的分子。在下面的实施例中，尤其是实施例5中，将更详细地描述此方法。
在本发明的一种特别优选的方法中，通过以下步骤可以得到纯化和浓缩的人乙型肝炎表面抗原：
（a）在培养基中培养产生粒子的哺乳动物细胞，使细胞向培养基中分泌人乙型肝炎表面抗原粒子，培养基中添加有不含分子量大于约3×105道尔顿的分子的血清;
（b）从所得含有人乙型肝炎表面抗原粒子的培养基中除去全细胞、细胞碎片和颗粒聚集体;
（c）对所得的培养基进行处理，以得到含有浓缩的人乙型肝炎表面抗原粒子的溶液;
（d）对所得的含浓缩抗原粒子的溶液进行处理，以减少溶液中的DNA含量;
（e）如有必要，调节如此形成的含有浓缩和纯化表面抗原粒子的溶液的pH，使pH值处在约3.0和约7.0之间;
（f）对存在于所得溶液中的浓缩表面抗原粒子进行纯化;
（g）回收纯化和浓缩的人乙型肝炎表面抗原粒子。
实施例11中对这一特别优选的实施例作了进一步的描述。根据这一特别优选的方法，从步骤（c）回收的含浓缩抗原袜子的溶液在回收前进一步纯化。这一特别优选方法的步骤a、b和c与实施例5中所述的方法相同，上面对实施例5的方法所作的说明也适用于实施例11的方法中。实施例13中叙述了另一个优选方法。
在将培养基进行处理以得到含有浓缩人乙型肝炎表面抗原粒子的溶液之后，对所得的溶液进行处理以减少溶液中的DNA含量。在一种优选方法中（见实施例11），这种减少DNA含量的处理包括向溶液中加入DNA酶。在另一个优选方法中（见实施例13），减少DNA含量的处理包括对溶液进行阴离子交换色谱处理，最好是在具有二乙氨基乙基官能团的交联琼脂糖柱上进行。这一阴离子交换色谱步骤也可以在用DNA酶溶液处理后进行。
如果有必要，对如此得到的含浓缩和纯化表面抗原粒子的溶液的pH进行调节，使pH达到约3.0至约7.0之间。在本发明的一项优选实施方案中，用酸处理如此形成的溶液来调节pH，产生混浊。混浊物中含有蛋白质污染物，可以与人乙型肝炎表面抗原粒子分离，最好是用离心法分离。这一步骤是对酸处理过的抗原粒子的进一步纯化。
或者是，可以利用离子交换色谱法，最好是用阴离子交换色谱法，从上述抗原粒子溶液中除去DNA和蛋白质污染物，从而使HBsAg粒子与洗脱液一起流出，而DNA和蛋白质污染物则被柱子结合或阻留。阴离子交换柱最好是DEAE阴离子交换柱。在本发明的一项特别优选的实施方案中，用来除去DNA和其它污染物的阴离子交换柱是带有DEAE官能团的交联琼脂糖柱。这类柱的一个实例是DEAE-Sepharose。该方法在实施例13中有更详细的说明。
另一种替代方法是将以上两个步骤相结合，即，用DNA酶处理减少DNA含量之后进行酸化，接着在DEAE柱上除去DNA。
本领域技术人员显然可以使用任何纯化方法在除去DNA之后作进一步的纯化，例如利用阳离子或阴离子交换色谱法，但优选强阳离子交换色谱法，例如用带有磺酸官能团的柱。在本发明的一项特别优选的实施方案中，用于进一步纯化的阳离子交换柱是N-丙烯酰-2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇的共聚物，它具有以下化学基团作为磺酸官能团：
-CONH-C（CH3）2-CH2-SO3H
这类柱的一个实例是SP-Trisacryl LS。
这种高度纯化和浓缩的抗原粒子也可以先用甲醛处理以使存在的任何活有机体和病毒灭活，然后进一步浓缩，最好用超滤法浓缩。所得的进一步浓缩的粒子随后用色谱法纯化，最好用凝胶过滤色谱法。一种优选的凝胶过滤柱是用N，N′-亚甲基双丙烯酰胺共价交联的烯丙基葡聚糖柱。
正如在实施例10中所述，当使用本发明优选步骤的替代步骤时，出现很多问题。例如，当用离心法来分离而不用超离心法时，未去除主要的细胞污染物，例如细胞膜和脂类复合物，这造成总收率降低，并降低了HBsAg粒子的纯度。离心法也是昂贵而耗时的。使用0.22微米膜灭菌体系造成了在实施例中说明的不同问题。
类似地，当使用聚乙二醇浓缩而不用超滤法时，HBsAg粒子的回收率仅有75%。另外，纯度较低，而且该方法更费时。
因此，虽然可以使用诸如实施例10中所述的方法和本领域技术人员会理解的方法等替代方法，但是优选的方法是实施例5中讨论的方法。另外，正如上面所讨论的，实施例11中详细叙述了本发明的一项特别优选的实施方案。
任何能表达cDNA编码的乙型肝炎表面抗原的哺乳动物细胞均可使用。优选的细胞是中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，尤其是CHO-HB200细胞。
乙型肝炎表面抗原是通过培养哺乳动物细胞（例如CHO-HB200）得到的。培养条件是本领域技术人员已知的。培养可以在摇瓶或发酵罐中用微型载体（microcarriers）进行。
由上述方法回收纯化的乙型肝炎表面抗原粒子。如上所述，这些纯化的粒子含有乙型肝炎表面抗原的前-S1、前-S2和S表面抗原多肽，所达到的纯度水平可以高到95%到98-99%（95%到98-99%不含蛋白质污染物）。这种纯化的乙型肝炎表面抗原粒子含有的前-S1、前-S2和S表面抗原多肽的化学计量数量还与来源于血浆的粒子相近。
更具体地说，纯化的乙型肝炎表面抗原粒子可以含有表面抗原多肽，其中S表面抗原多肽构成粒子的75-80%，前-S2表面抗原多肽构成粒子的10-15%，前-S1表面抗原多肽构成粒子的5-10%。在本发明的一项具体的实施方案中，S表面抗原多肽构成粒子的78%，前-S2表面抗原多肽构成粒子的14%，前-S1表面抗原多肽构成粒子的8%。
在本发明的一项更具体的实施方案中，本发明包括纯化的乙型肝炎表面抗原粒子，其中的表面抗原多肽的数量如下：
S 24KD未糖基化 62.4%
S 27KD糖基化 15.6%
前-S2 33KD单糖基化 10.8%
前-S2 36KD双糖基化 3.2%
前-S1 39KD未糖基化 6.1%
前-S1 41KD糖基化 1.9%
本领域技术人员会理解，以上段落中讨论的数量可以随回收产物的纯度而变化。
本发明还提供了一种乙型肝炎表面抗原疫苗，其中含有用上述方法制得的有效免疫量的乙型肝炎表面抗原粒子和合适的载体。
实施例
以下实施例用来帮助理解本发明，决不是要限制本发明的范围，不应造成误解。这些实施例不包括对构建载体、编码多肽的基因插入这些载体中或将所形成的质粒引入宿主中所用的常规方法的详细说明。这些实施例也不包括对这些宿主载体体系产生的多肽进行测定所用的常规方法的详细说明。另外，这些实施例不包括对哺乳动物组织培养常规方法或这些组织培养细胞的重组DNA转化常规方法的详细说明。最后，这些实施例不包括对超滤和凝胶过滤以对由转化组织培养细胞产生的多肽进行纯化的常规方法的详细说明。
这类方法是本领域普通技术人员所熟知的，在许多出版物中都有说明，例如：
一般分子生物学方法：
Maniatis等，“分子克隆”（Molecular Cloning）：实验室手册，纽约冷泉港实验室;Davis等，“分子生物学中的基本方法”（Basic Methods in Molecular Biology），Elsevier，New York，Amsterdam（1986）。
哺乳动物组织培养方法：
Uslaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.1980年77卷4216-4220页;Pellicer等，Science，1980年209卷1414-1422页;Laub等，J.Virol，1983年48卷271-280页;Petzer等，在Vyas等编著的“病毒性肝炎和肝病”中477-485页，Grune和Stratton公司，Orlando，Florida（1984）;Michel等，Bio/Technology，1985年第3卷561-566页。
超滤方法
Trudel等，Process Biochem.1983年18卷2-9页。
凝胶过滤方法
Fisher的“凝胶过滤色谱法”一书，Elsevier，Amsterdam（1980）。
哺乳动物细胞系
申请人使用了称作CHO200Mrp7.5 AL 26和CHO50Mrp7.5 AL 26的细胞系，它们是由Weizman Institute/Yeda Research and Development Company建立的，保藏在巴斯德研究所，保藏号分别为I-574和I-575。在几份未决欧洲专利申请中说明了这些质粒的构建。在可选择的转化质粒上类似地含有HBsAg基因区的其它哺乳动物细胞系也可以用来实施本发明。
实施例1
在本发明中建立和使用的细胞系和质粒
申请人使用CHO细胞系CHOMr200p7.5 AL 26（图1）来生产和纯化HBsAg粒子。但是，申请人发现此细胞系被支原体污染，因此在使用前必须进行处理。
这一细胞系是通过用质粒p7.5 AL 26的DNA和含dhfr基因质粒的DNA转染而构建的。p7.5 AL 26 DNA和含dhfr基因质粒的DNA之比是10∶1。
p7.5 AL 26质粒是通过在pBR 322的EcoRI位点插入一个7.5千碱基对的EcoRI片段而构建的，该片段含有整个HBV表面抗原整合基因，包括前-S1和前-S2区以及称为“TATA”启动子和“SV-40样”启动子的HBV启动基因。另外，它还含有HBV增强子成分和在3′末端下游的2-3个多聚腺苷酸化位点。按照Shaul等的方法（J.Virol，1984年51卷776-787页）从Alexander细胞中分离DNA，该DNA在HBV DNA的5′和3′末端含有邻接的宿主顺序（来自Alexander细胞）。然后用氨甲蝶呤（200 nM）处理转化细胞，选择出抗性细胞。
其它细胞系用同样的HBV DNA转化，该DNA已经过处理而除去了大部分或全部邻接的宿主细胞（Alexander）DNA顺序。例如，将p7.5 AL 26的3.8千碱基对Pst DNA片断引入到pSP 64中。所形成的质粒pSPHBV 8-1含有100碱基对的位于HBV启动子TATA盒上游的人DNA和600碱基对的在基因3′末端下游Pj区之外的人DNA。
A.细胞系CHO200Mrp7.5 AL 26的处理
被支原体污染的细胞系CHO200Mrp7.5 AL 26用抗生素试剂盒BM-CYCLINE（Boehringer，Mannheim）处理。处理过程完全按照该试剂盒所提供的程序（Boehringer Mannheim产品目录799050号，这里引用作为参考）进行。处理后成功地形成了我们称之为CHO-HB 200的细胞系，它不含支原体，并且以高水平产生HBsAg粒子。
B.用处理过的CHOMr2007.5 AL 26 细胞系-CHO-HB 200生产的HBsAg的产量
用此细胞系制得的免疫活性HBsAg的组成表达最初通过测定汇合培养物的培养基来确定。使用Travenol固相放射免疫测定试剂盒来检测HBsAg，确定了汇合CHO-HB 200培养物的培养基中含有3-5毫克/升免疫活性HBsAg。
C.处理过的CHOMr2007.5 AL 26克隆-CHO-HB 200的稳定性
所选择的克隆CHO-HB 200在至少6个月内稳定地产生HBsAg。
D.新的HBsAg表达质粒的建立
对质粒pSPHBV 8-1（图1）作进一步的操作，去除剩下的上游Alexander细胞DNA顺序。操作方法是，使pSPHBV 8-1的500碱基对XbaI-EcoRI片段和2400碱基对EcoRI-PstI片段亚克隆到pSP 65中，生成pSPHBVB 8（图2）。
将SV 40早期启动子和SV 40多聚腺苷酸化位点控制下的dhfr基因亚克隆到pSPHBV 8-1和pSPHBVB8中，分别产生pSPHBV AL 3和pSPHBVB 813（图3）。这是通过将已插入的pSVE 100-dhfr的1300碱基对填平EcoRⅠ-SmaⅠ片段亚克隆到适当HBV质粒的PvuⅡ位点中而实现的，上述片段含有带所有调控顺序的dhfr基因。
这种缩短的构建体含有受其天然启动子控制的HBsAg基因以及受SV 40早期启动子控制的dhfr基因。将这些构建体转染到dhfr CHO细胞中。
实施例2
组织培养方法
申请人在本发明中使用的下列方法通常是在哺乳动物组织培养中使用的标准方法。曾有人描述过这些方法的许多变型，这些变型也可以用于同一目的（关于包括本发明方法在内的各种方法的实例，参见以下文献：Uslaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.1980年77卷4216-4220页;Pellicer等，Science，1980年209卷1414-1422页;Laub等，J.Virol.1983年48卷271-280页;Petzer等在Vyas等编著的“病毒性肝炎和肝病”一书的477-485页，Grune和Stratton公司，Orlando，Florida，1984;Michel等，Bio-Technology，1985年第3卷561-566页）。
A1.胰酶消化
汇合培养物在传代培养或冷冻贮存之前先进行胰酶消化。从培养容器中倒出培养基即Dulbecco改良型伊格耳氏基本培养基（DMEM），加入胰蛋白酶在磷酸盐缓冲液中的冷溶液（0.25%稀释成1∶3）（加入的胰蛋白酶的体积约是原始生长培养基体积的1/10）。快速洗涤附着的细胞，除去多余的胰蛋白酶。在37℃下残留的胰蛋白酶与细胞接触5-10分钟，然后在培养容器中加入添加有5-10%胎牛血清的生长培养基（DMEM）以停止胰酶消化。轻轻摇动使附着的细胞从壁上脱下并悬浮在培养基中。将这些细胞或是传代培养，或是冷冻长期贮存。
0.25%胰蛋白酶溶液（储液）的配制
胰蛋白酶溶液中含有：
80克 NaCl
4克 KCl
10克 右旋糖
35克 NaHCO3
25克 胰蛋白酶（1∶300 ICN）
将以上所有成分溶于10升水中，调节pH至8.5。
然后将以上溶液经过0.22微米滤器过滤，冷冻（-20℃），可以贮存数年。
A2.配制胰蛋白酶工作溶液（1∶3稀释）
用与上述储液配方相同、但不含胰蛋白酶的溶液，将储液按1∶3稀释。
B.细胞的长期储存
当需要将细胞长期储存时，进行以下步骤：将汇合培养物按第1部分中所述进行胰酶消化。将悬浮细胞在添加有10%胎牛血清的DMEM培养基中洗一次或两次。洗过之后，将细胞再悬浮于含有20%胎牛血清+10%二甲基亚砜的培养基中，使细胞的最终浓度达到3-4×106个细胞/毫升。将培养瓶在室温下放置1小时，然后转移到-20℃的冷冻箱中。次日上午将冷冻的培养瓶在-70℃再放置24小时。最后，将培养瓶放在液氮中长期贮存。一周之后，取1-3个培养瓶解冻，估测细胞的成活率。
按此方式建立主细胞库和工作细胞库。
C.储存细胞的解冻
将盛有储存冷冻细胞的小瓶从液氮储罐中迅速取出，放在37℃水浴中。细胞快速熔化，将其转移到T形瓶（75-150 cm2）中，瓶内装有25-50毫升添加有10%胎牛血清的DMEM。几小时后看得出大多数细胞附着在底部。在细胞解冻4小时后更换培养基。约5-8天后培养物达到汇合。
实施例3
摇瓶细胞培养系统
A.生长培养基
所有CHO细胞系都在Dulbecco改良型伊格耳氏培养基（DMEM）中进行培养，该培养基中含有10 mM谷氨酰胺（Gibco公司）、20 mM HEPES（Raught公司）、30 mM NaHCO3（Merck公司）、150微克/毫升脯氨酸（Sigma公司）和40微克/毫升庆大霉素（Sigma公司）。在该培养基中添加2-10%胎牛血清（Bocknek公司）以满足培养需要。该培养基的最佳工作pH是在7.15-7.25之间。
B.接种和培养的维持
使用850cm2或490cm2塑料摇瓶（Corning公司）来培养细胞和生产HBsAg。汇合培养物经胰酶消化，细胞悬浮在DMEM培养基中用于再培养，该培养基添加有10%胎牛血清。每个摇瓶用50-100毫升培养基接种，培养基中添加有10%胎牛血清，含有至少5×106个细胞。接种量决定了培养物再次达到汇合所需的时间长短（可以在2-10天范围内）。在接种几小时之后，大多数细胞已附着并开始蔓延。24小时后可以观察到细胞分裂。
建议使用添加有10%胎牛血清的培养基，直到培养物达到汇合;然后在此阶段将胎牛血清的含量降到2-5%。降低胎牛血清含量对于长期的细胞维持和生产最为适宜。这样的培养物可以维持6个月而不丧失产生HBsAg的能力。
汇合培养物中的细胞数目在每摇瓶2×108-109个细胞之间变化。
典型的CHO细胞的剧烈代谢作用，和高细胞密度一起，造成了培养基pH的快速下降。其后果大概一方面会造成培养基消耗，另一方面会释放出不希望有的毒性代谢产物。为了防止对细胞的潜在危害，建议逐日更换汇合培养物中的培养基。
实施例4
在摇瓶体系中生产HBsAg
利用CHO-HB 200细胞的HBsAg组成生产（实施例1）来连续地长期生产HBsAg。在每日一次更换培养基的情况下，HBsAg在汇合培养物中的生产在至少6个月内是稳定的。生产速度是4-5毫克HBsAg/升/24小时，在6个月连续培养期间内不变。
虽然在摇瓶培养体系中可以大量生产HBsAg，但此方法仅适合于有限的工业生产。主要的限制是所涉及的劳动量大和操作效率低。
因此，建议用摇瓶体系来培养供大规模生产体系接种用的细胞，例如用摇床和使用微载体的发酵罐。
实施例5
生产和纯化HBsAg粒子的优选方法A
如本实施例的题目所示，在以下实施例中公开的方法只是一种优选方法。一种更优选的方法在实施例11中给出，它是本发明的特别优选的方法。图4和8分别图示说明了这两个方法的流程图。
A.方法概述
使用摇瓶体系生产HBsAg（如实施例3、4所述）。所用的培养基含有2-10%胎牛血清，最好是2%胎牛血清，已经用带有截止分子量为300，000的膜的Pellicon系统（Pellicon切向流动超滤器，Millipore公司）进行超滤预分级，以除去高分子量污染蛋白（步骤1）。
逐日收集培养基并合并起来。收集到的含HBsAg粒子的培养基利用带有0.22微米膜的Pellicon切向流动超滤器（Millipore）澄清，除去细胞和大的细胞碎片（步骤2）。最后，澄清的粗制培养基用带有截止分子量为300，000的膜的Pellicon切向流动超滤器（Millipore）浓缩和透析（用磷酸盐缓冲液）（步骤3）。在Sephacryl S-400柱（2.6cm×190cm，Pharmacia）上进行两次连续的凝胶过滤色谱，将浓缩物进一步纯化。每次色谱之后，用带有截止分子量为300，000的膜的Minitan切向流动超滤系统（Millipore）将含有HBsAg粒子的峰级分浓缩。此纯化步骤总结在图4。使用这种新方法来纯化HBsAg粒子的结果在实施例6中说明，该实施例叙述了100毫克批量的高度纯化的HBsAg粒子的生产。
在Pellicon和Minitan切向流动超滤步骤中使用的方法如制造商（Millipore公司）提供的手册所述。凝胶过滤方法使用床体积为1升的Sephacryl S-400柱，该方法如制造商（Pharmacia Fine Chemicals）所述。在整个纯化过程中，申请人只使用磷酸盐缓冲液（PBS）作为超滤、透析和凝胶过滤色谱（加样和洗脱）的缓冲液。申请人使用无钙（Ca++）和镁（Mg++）的PBS缓冲液。
B.PBS缓冲液，无Ca++和Mg++
无Ca++、Mg++的PBS缓冲液（×1）按下列方式配制：
8克 NaCl
0.2克 KCl
1.15克 Na2HPO4
0.2克 KH2PO4
将以上组分溶于1升水（重蒸水，无热原）中。溶液的pH调节到7.25。
C.生产和纯化HBsAg的新方法的详细说明
步骤1：细胞培养基的预分级
产生并且向培养基中分泌HBsAg粒子的CHO-HB 200细胞（实施例1所述）在摇瓶培养体系中进行培养（实施例3和4所述）。申请人一般使用20个这样的摇瓶培养细胞。
培养基以下列方式添加胎牛血清：将添加有10%胎牛血清的培养基用于对摇瓶接种。为了逐日更换细胞培养基（用新鲜培养基替换用过一天的培养基），使用添加有2-5%、最好是2%胎牛血清的培养基。在以上两种情形，添加有胎牛血清的培养基先用带有截止分子量为300，000的膜的Pellicon切向流动超滤系统预分级。入口与出口的表压一般在0磅/平方英寸的范围内。只把滤液（添加有胎牛血清的培养基中分子量低于300，000的组分）加到细胞中。
为了对摇瓶接种，在每只摇瓶中倒入100毫升预分级的培养基，其中添加有10%胎牛血清，含有至少5×106个CHO-HB 200细胞。细胞在此培养基中生长，直到达到汇合（在2-10天之间）。
当细胞达到汇合时，每个摇瓶中有2×108-1×109个细胞，这时开始纯化这些细胞产生的HBsAg粒子。从细胞培养物中取出添加有10%胎牛血清的接种培养基并弃去，用预分级过的添加有2%胎牛血清的培养基代替。细胞在此培养基中生长至少6个月，逐日更换培养基。汇合细胞每天每升（10个摇瓶）产生4-5毫克HBsAg粒子。逐日从摇瓶中取出培养基（每天20×100毫升＝2升），其中含有分泌出的HBsAg粒子。将收集的这些培养基合并，在4℃下贮存。当逐日收集和合并的汇合培养基累积达到25升时（80-100毫克HBsAg，培养13天），按步骤2所述开始对合并培养基中的HBsAg粒子分批纯化。
上述的对添加有胎牛血清的培养基进行预分级的独特步骤使申请人能用最少数目的纯化步骤将HBsAg粒子纯化到高纯度。其原因可总结如下。
在含有分泌出的HBsAg粒子的培养基中，主要污染物是来源于胎牛血清的蛋白质。胎牛血清是达到最佳培养条件所必需的，因此不能从培养基中排除。分泌出的HBsAg粒子具有高分子量，因此在纯化期间污染HBsAg级分的蛋白质应是高分子量的蛋白质。利用上述用截止分子量为300，000的膜进行预分级的步骤，申请人除去了培养基中大部分高分子量蛋白质污染物。事实上，申请人加到培养物中的只是添加了胎牛血清的培养基中分子量低于300，000的组分。这样就从细胞培养物中排除了高分子量的蛋白质复合物，例如抗体复合物和多聚清蛋白聚集体。实际上，将在预分级培养基中培养的细胞的生长和HBsAg生产特性与在相应的未经预分级的培养基中培养的细胞相比，申请人观察到前一培养基在两方面都优越。因此，预分级的培养基具有两个主要优点：细胞生长情况更好;在HBsAg纯化中污染物含量减少。
最后，后继的纯化步骤主要要求将高分子量的HBsAg粒子与低分子量的蛋白质污染物分离。这些污染物包括作为主要级分的来源于胎牛血清的清蛋白，它的分子量约为97，000道尔顿。
步骤2：所收集的含HBsAg粒子培养基的澄清
这实际上是HBsAg纯化过程的第一步，借此将收集到的培养基（含HBsAg）中存在的分散全细胞和细胞碎片从培养基中除去。这通常称作粗制培养基的澄清。申请人使用带有0.22微米滤膜的Pellicon切向流动超滤系统来澄清含HBsAg的培养基。通常在此系统中每次过滤25升批料（80-100毫克HBsAg粒子）。入口和出口的表压读数保持为0磅/平方英寸。在此系统中可以处理更大的批量或是更多的批数，因为它每小时能滤过数百升培养基。在每批过滤之后，用5-10升PBS洗涤该系统。因此这是一个很快的过程，可在工业上应用。
只有全细胞和大的细胞碎片（＞220纳米）聚集体（例如细胞膜和膜复合物、大的细胞器）被0.22微米滤膜（220纳米）阻留。只收集这一澄清超滤步骤的滤液（含有22纳米HBsAg粒子）。按步骤3-5进一步纯化。滤液的体积与起始体积相同，即每批25升。采用这种超滤澄清步骤，HBsAg粒子或总的培养基蛋白质均不受损失（100%回收）。
步骤3：浓缩和纯化澄清培养基中的HBsAg粒子
澄清的粗制培养基（步骤2）的体积与它在澄清之前的体积相同，即，每批25升。为了专一纯化这一培养基中的HBsAg粒子，先需要一个浓缩步骤。象申请人所用体积那样大的批料体积不能直接用于在最后纯化步骤（步骤4、5）中使用的纯化用凝胶过滤柱。因此需要一个浓缩步骤，而且希望浓缩步骤还能从培养基的其余组分中专一纯化出HBsAg粒子。这样一个步骤是通过在带有截止分子量为300，000的膜的Pellicon切向流动超滤系统中将澄清的粗制培养基浓缩而实现的。利用此系统也使申请人能够在封闭的超滤系统内将被截止分子量为300，000的膜阻留的HBsAg粒子透析。
申请人向截止分子量为300，000的Pellicon过滤系统（如上）中加入25升澄清的粗制培养基，弃去滤液（包括分子量低于300，000的清蛋白在内的分子）。将滤膜上的保留物（包括分子量大于300，000的HBsAg粒子在内的分子）对10升PBS（10×1升）透析。透析后保留物的体积为660毫升，浓缩了近40倍。
然后收集600毫升浓缩物（或保留物），在带有截止分子量为300，000的膜的Minitan切向流动超滤系统中进一步浓缩。Minitan系统比Pellicon系统更适合于小体积（最高1升）。弃去Minitan超滤的滤液，只收集保留物。一般来说，当加入660毫升Pellicon系统浓缩物（或保留物）时，从Minitan系统回收到约150毫升保留物（或浓缩物）。这意味着又浓缩了约4.5倍。因此，串联使用Pellicon和Minitan系统的整个浓缩过程，使澄清的粗制培养基浓缩了约180倍。在每批试验之后，用5-10升PBS洗涤Pellicon和Minitan系统。
上述系统不仅浓缩了澄清的培养基，而且也专一地从培养基组分中纯化出HBsAg粒子。在上述系统中用截止分子量为300，000的膜浓缩之后，只回收到全部澄清培养基蛋白质的2.5%。但是，回收到培养基中全部HBsAg粒子的95%。这表明了从HBsAg粒子中除去来源于培养基的污染物的专一性纯化作用（约35倍）。虽然回收了原始HBsAg粒子的95%，但它们只构成回收到的2.5%原有总蛋白质的一部分。也就是说，在总计636毫克蛋白质中有95毫克HBsAg（约15%）。因此用凝胶过滤法将以上的150毫升浓缩物（Minitan保留物）进一步纯化，以完成最终的HBsAg粒子纯化步骤（步骤4、5）。
步骤4：用凝胶过滤法从浓缩和澄清的培养基中纯化HBsAg粒子
为进一步纯化HBsAg粒子，申请人利用它们的化学-物理性质，即它们处于在1-2×106道尔顿范围内的有效分子量。因此，使用Sephacryl S-400（Pharmacia）凝胶过滤柱，它排除分子量大于1×106道尔顿的分子。Sephacryl S-400是用N，N′-亚甲基双丙烯酰胺共价交联的烯丙基葡聚糖凝胶过滤柱。因此，象HBsAg粒子这样的大分子被排阻，迅速洗脱出来。诸如清蛋白和其它蛋白质等较小的污染分子进入柱树脂中，洗脱缓慢，结果使HBsAg粒子和低分子量污染物有效地分离。申请人使用的Sephacryl S-400柱的大小为2.6厘米×190厘米，有效柱床体积为1升。对于更大体积的浓缩物或浓缩物中更大量的蛋白质，可以使用容量更大的Sephacryl S-400柱。
申请人采用的浓缩培养基每批体积一般约为150毫升（步骤3），在总计约640毫克蛋白质中含有约95毫克HBsAg粒子。作为浓缩期间透析步骤（步骤3）的结果，浓缩物是含有HBsAg粒子和污染蛋白的PBS溶液（即，在150毫升PBS中有95毫克HBsAg）。对于每批浓缩物，申请人只使用1个Sephacryl S-400柱，但是也可以用更多的柱子以提高纯化速度。申请人在每次凝胶过滤时加入1/3浓缩物（大约32毫克HBsAg在50毫升PBS中）滤过柱子。这约占柱床体积的5%（体积）。将流速调节到每小时约10厘米以实现最佳分离，这造成约为25-30厘米水柱的低操作压。
使用最多达1个床体积（1升）的PBS从柱中洗脱HBsAg粒子。在洗脱之后和重新使用同一柱之前，用2-3个床体积（2-3升）的PBS洗柱。
HBsAg粒子因为体积大而不进入柱床树脂，于是很快从柱中洗脱出来。紧接在外水体积之后分部回收HBsAg粒子峰。洗脱出的级分通常是每级分10毫升。HBsAg粒子总是分14-15个级分（140-150毫升）洗脱出。
从Sephacryl S-400柱中回收HBsAg粒子的速度很快，纯化程度相当高。由混在50毫升PBS中的约32毫克HBsAg回收到在140毫升流出液中的30毫克HBsAg，回收率为92%。在一个柱上通过后，HBsAg粒子纯化了4-5倍，洗脱出的HBsAg峰级分中总蛋白质中的特异组分HBsAg占60-70%（由上柱前浓缩物中总计仅15%增加到此值）。为了将HBsAg粒子进一步纯化得到纯度高于95%，按步骤5中所述通过同样的Sephacryl S-400柱进行第二次凝胶过滤。
步骤5：对第一次凝胶过滤柱的洗脱峰中的HBsAg作第二次凝胶过滤纯化
使用在第一次凝胶过滤操作（步骤4）中使用的同样的Sephacryl S-400柱进行第二次凝胶过滤操作。在第一次凝胶过滤操作后，用3-5个床体积（3-5升）的PBS洗柱，除去所有结合的分子。每批典型的浓缩和澄清的培养基需要通过第一个柱3-4次，每次用1/3体积的浓缩物。为进行第二次凝胶过滤操作，将两份第一次凝胶过滤操作的峰级分合并（每份140-150毫升）。接着，一般是先将280-300毫升合并的HBsAg粒子洗脱峰浓缩，然后加到Sephacryl S-400柱上进行第二次凝胶过滤操作。（第三份第一次凝胶过滤HBsAg洗脱峰与下一批的洗脱峰合并，供第二次凝胶过滤操作用。因此，对于每两批含HBsAg粒子的浓缩培养基，第一次凝胶过滤需要6次操作，第二次凝胶过滤需要3次操作）。
为了在加入到第二个凝胶过滤柱之前将合并的洗脱峰浓缩，使用带有截止分子量为300，000的膜的Minitan切向流动超滤系统（如步骤3中所述）。这将使体积从280-300毫升减少到约60毫升（浓缩5倍）。这60毫升中含有约57-60毫克HBsAg粒子，将其加到Sephacryl S-400柱中进行第二次凝胶过滤操作。
从第二次凝胶过滤操作洗脱出（用PBS）的HBsAg粒子峰含有在140毫升PBS中的约48.5毫克HBsAg粒子。这表明HBsAg的回收率为85%。另外，这个第二次凝胶过滤峰含有95%以上（约98-99%）纯的HBsAg特异蛋白。
因此，总的说来，使用2个接续的凝胶过滤柱从浓缩和澄清的粗制培养基中纯化HBsAg粒子，申请人达到了高收率（78%）和很高的纯度（大于95%）。
在整个纯化过程中，各个阶段的HBsAg粒子回收率、收率和纯度都用实施例7、8和9中所述的分析方法测定。
纯化流程图概述在图4中，典型的HBsAg粒子批料的生产和纯化表述在实施例6中。
在本文所述的纯化方法中，可以将步骤1-5扩大规模进行用于疫苗的HBsAg粒子的工业化生产。这由以下步骤完成：
（1）在更大数目的摇瓶或带有微载体接合体的发酵罐中培养培养物;
（2）用与工业规模体积相适应的Pellicon和Minitan系统（Millipore公司）或与其相当的系统进行超滤;
（3）用更大床体积的Sephacryl S-400柱或串联在一起的大量所述柱（步骤4、5）进行凝胶过滤纯化。
最后，申请人的生产和纯化方法的一些新特征可以总结如下：
培养基的预分级除去了令人讨厌的高分子量蛋白质污染物，这使申请人能以大大简化的方式纯化HBsAg粒子。纯化前的浓缩步骤是高度有效的，并且完成了很大程度的预纯化。这些纯化步骤在一个可重复使用的系统中很快完成。
包括澄清、浓缩和纯化步骤（步骤2-5）的所有部件可以机械地（用管道）连在一起，形成一个密闭系统。因为所有部件都可以灭菌，所以申请人的纯化方法是在一个封闭系统内自始至终于无菌条件下进行。
因此，申请人能以很高的效率和很低的成本生产大量高度纯化的由重组DNA生成的HBsAg粒子。
实施例6
生产和纯化100毫克HBsAg-第一批
下述生产和纯化HBsAg粒子的方法，在实施例5中有更详细的说明。
使用20只摇瓶来生产HBsAg。使用的培养基含有添加了胎牛血清的培养基的滤液，该培养基已用带有截止分子量为300，000的膜的Pellicon超滤系统预分级。
表1总结了由第一批料得到的结果。
＊HBsAg在粗制培养基中的浓度为4.0毫克/升。粗制培养基是指逐日收集和合并的细胞培养基，直到累积了25升，此时进行纯化。用带0.22微米膜的Pellicon超滤系统澄清该培养基-澄清的粗制培养基。
＊＊澄清的粗制培养基在带有截止分子量为300，000的膜的Pellicon系统上浓缩并对10升PBS（10×1升）透析。滤膜上的保留物（660毫升）用Minitan系统（截止分子量为300，000的膜）进一步浓缩成148毫升最终浓缩物。注意HBsAg粒子的专一性纯化是通过浓缩步骤完成的。
＊＊＊第二批100毫克按同样方式浓缩，得到的结果相似。
将浓缩物在Sephacryl S-400柱（2.6×190厘米）上用凝胶过滤法进一步纯化。在柱上加入32.5毫克HBsAg（1/3体积的浓缩物）。在140毫升流出液中回收到30.0毫克HBsAg（回收率为92%）。将两个柱的流出液合并，用Minitan系统（截止分子量为300，000的膜）浓缩到58毫升，在同样的Sephacryl S-400柱上进行第二次同样的凝胶过滤操作。由加在第二个柱上的57毫克HBsAg回收到48.5毫克（回收率为85%）。HBsAg粒子在第一个柱上纯化了3-4倍（从总蛋白质的15%增加到约60%），在第二个柱上又纯化了1.5倍（从总蛋白质的约60%增加到高于95%）。
用SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，15%凝胶）对纯化过的HBsAg粒子进行分析。按实施例7中所述，用家兔抗体，采用银染色和Western印迹法使HBsAg特异蛋白质条带显色。
实施例7
纯化的HBsAg粒子的分析
A.用SDS-PAGE（15%凝胶）和凝胶银染色法，对纯化过程中每一步骤（见实施例5和6）之后的HBsAg粒子的纯度进行分析。凝胶显示出在第二个凝胶过滤步骤之后（实施例5和6）得到的HBsAg粒子的纯度约为98-99%。
用SDS-PAGE和银染色法对以下样品进行比较：澄清的粗制培养基;粗制澄清培养基的浓缩物;第一次Sephacryl S-400凝胶过滤的浓缩流出液;第二次Sephacryl S-400凝胶过滤的浓缩流出液;经过蔗糖梯度分离的培养基浓缩物的峰级分（见实施例11）。每个样品在凝胶上的加样量为用标准方法测定的相同数量的蛋白质。在粗制培养基中，主要条带对应于污染物蛋白质（清蛋白），HBsAg特异蛋白质条带只是次要条带。在浓缩的粗制培养基中，HBsAg特异蛋白质条带加强（总量的15%），污染物条带明显减弱。在第一个Sephacryl S-400柱之后，HBsAg特异条带占蛋白质条带的约60%，在此阶段污染物条带是次要条带。在第二个Sephacryl S-400柱之后，所有的HBsAg特异条带均清晰可见：24K、27K、33K、36K、39K和42K。它们占全部蛋白质条带的95%以上。主要的HBsAg特异条带是24K、27K、33K和36K，39K和42K是次要但是很显著的条带。经过蔗糖梯度分离的样品与第一个Sephacryl S-400柱的流出液有很相似的图谱，说明蔗糖梯度分离只使HBsAg达到60%的纯度。
B.用Western印迹法对纯化过程中每一步之后（实施例5和6）的纯化HBsAg粒子作进一步的分析，使用针对来源于血浆的HBsAg粒子而制备的家兔抗体。印迹显示了具有以下分子量的对HBsAg粒子特异的六种主要蛋白质条带的存在：24K、27K、33K、36K、39K和42K。
使用HBsAg粒子特异性抗体的Western印迹法能对HBsAg粒子条带进行特异性鉴定。每个样品都用相同数量的蛋白质。所用的抗体也具有抗清蛋白特异性。这可以用来测定主要蛋白质污染物清蛋白在整个纯化过程中的特异性减少。
粗制的培养基样品只清楚地显示清蛋白条带，HBsAg粒子特异性条带低于此方法的检测水平。对于蛋白质条带的抗体特异性检测，每个条带的蛋白质含量及其在测定条件下的抗原性决定了检测水平。申请人断定，粗制培养基含有很少量的HBsAg粒子特异性条带（如同在A中用银染色法所观察到的，该方法的检测水平约为50纳克/条带），而且这些条带在我们的测定条件下不具有高抗原性。浓缩培养基样品的清蛋白含量减少，HBsAg特异性条带24K和33K是主要条带，27K和36K是次要条带。在第一个Sephacryl S-400柱流出液中，清蛋白只是次要条带，HBsAg特异性条带24K和33K是主要条带，27K、26K、39K和42K是次要条带。蔗糖梯度分离样品的图谱与第一个Sephacryl S-400柱流出液很相似。第二个Sephacryl S-400柱流出液几乎完全没有可见的清蛋白条带，HBsAg特异性条带24K、27K、33K是主要条带，36K、39K和42K是次要但明显的条带。因此，在这一样品中条带几乎完全是HBsAg粒子特异性的，表明其纯度很高。所以这证实了在上述A部分中用凝胶银染色法观察到的结果。
对Western印迹条带强度的进一步鉴定（尤其是对和第一及第二Sephacryl S-400柱流出液相应的样品），表明了用申请人的方法生产和纯化的HBsAg粒子的化学计量：即，24K、27K和33K是主要条带，36K、39K和42K是次要条带。
这些发现与Heermann等人的数据（J.Virol.1984年52卷396-402页）完全一致，他们描述了在来源于血浆的HBV粒子和只含有HBsAg的大丝状体中有以下蛋白质（他们提到的较小的20 nm HBsAg粒子不含39K和42K）。
24K-未糖基化 （S）
27K-糖基化 （S）
33K-单糖基化 （前-S2）
36K-双糖基化 （前-S2）
39K-未糖基化 （前-S1）
42K-糖基化 （前-S1）
应当指出，在申请人对银染色凝胶和用家兔抗体得到的Western印迹进行的比较中，观察到HBsAg粒子的前-S2区33K蛋白的免疫原性增加。在银染色凝胶上，与24K和27K主要条带相比，33K条带是次要条带。在Western免疫印迹上，与24K和27K主要条带相比，33K条带是主要条带。这与前-S2区决定簇免疫原性增加的发现是一致的，上述发现曾在“发明背景”部分讨论过，例如见Milich等，J.Immunol.1986年137卷315-322页。
C.利用Western印迹法，用抗前-S1区的特异性单克隆抗体进一步证实了前-S1蛋白（39K、42K）的存在。印迹显示出比糖基化形式42K的量至少高两部的未糖基化前-S1 39K。（这表明单克隆抗体等同地与糖基化和未糖基化的蛋白反应。）
D.进一步鉴定纯化过的HBsAg中来源于胎牛血清和CHO细胞的污染物的存在。利用Western印迹法，用两种分别抗胎牛血清和CHO细胞蛋白的家兔抗体，有可能证实，与阳性对照相比，纯化过的HBsAg中的污染物含量在两种情形下均低于检测水平。这里所说的检测水平是指每个条带的蛋白质数量和它在测定条件下的抗原性。
实施例8
A.用申请人的新生产和纯化方法（在实施例5和6中说明）生产的HBsAg粒子的固相放射免疫测定
使用用于检测HBsAg的固相放射免疫测定试剂盒（Travenol）进行HBsAg粒子免疫原性测定。申请人测定的HBsAg粒子是浓缩的第二次凝胶过滤流出液中的粒子（实施例5步骤5，或图4步骤5）。该试剂盒用已知标准物（Abbott）校正。将申请人的由重组DNA生产的HBsAg（CHO）的校准曲线与Abbott校准曲线相比较。与Abbott标准物相比，申请人的HBsAg（CHO）与Travenol试剂盒的黑猩猩抗体的亲合性似乎更高（图6A）。
B.用申请人的新的生产和纯化方法（实施例5）在CHO细胞中生产的重组HBsAg疫苗的校准曲线
申请人利用在下面实施例9中说明的方法，将高度纯化的HBsAg粒子（实施例5步骤5中得到的浓缩HBsAg粒子）与明矾佐剂相结合，制得HBsAg疫苗。
将申请人的HBsAg疫苗与来源于血浆的HBsAg疫苗-Heptavax B和酵母重组疫苗-Recombivax HB的校准曲线相比较。结果再次表明，与市售的疫苗（Heptavax、Recombivax）相比，申请人的疫苗（CHO）对Travenol试剂盒的黑猩猩抗体的亲合性最高。看来重组酵母疫苗Recombivax HB在测定中不反应，这大概是由于对Travenol RIA试剂盒的抗体的亲合性很低。
实施例9
在小动物（小鼠）体内的血清转化
A.利用小鼠体内的血清转化测定HBsAg的效力
将CHO-HB 200细胞产生的乙型肝炎表面抗原（HBsAg）（实施例3和4）高度纯化（约98%，实施例5和6）。用检测HBsAg的固相放射免疫测定试剂盒（Travenol）和蛋白质测定法（实施例7和8）测定HBsAg浓度。HBsAg用明矾佐剂复合，构成重组HBsAg疫苗。明矾佐剂是用过量的1M磷酸氢二钠（Na2HPO4，约1毫升）滴定1.5毫升10%明矾（硫酸铝钾·18H2O）溶液而制得的。将所形成的悬浮液用水稀释10倍，离心。将明矾沉降物再悬浮于10毫升PBS中，形成约2.5毫克/毫升的Al（OH）3溶液。在1毫升该溶液中加入50微克申请人的重组CHO HBsAg，用PBS将体积调节到5毫升。
将申请人的重组疫苗（CHO）与来源于血浆的疫苗-Heptavax（Merck，Sharp和Dohme）和酵母重组疫苗-Recombivax HB（Merck，Sharp和Dohme）相比较。
用1毫升疫苗样品对Balb/c小鼠作腹膜内注射，每份疫苗样品含有以下数量的HBsAg：0.01、0.03、0.09、0.27、0.81、2.4微克（每组10只小鼠）。注射30天后抽小鼠血，用Ausab EIA试剂盒（Abbott）试验血清中抗HBsAg抗体的存在，并且与参考血清（WHO）对照进行校准，参考血清得自荷兰中央血库。
结果总结在图7。可以推断，申请人的重组（CHO）疫苗比市售的两种疫苗的效力至少高10倍。
利用申请人的重组（CHO）疫苗制品以更大规模重复以上实验，该疫苗是用详述在实施例11中的特别优选的方法制备的。得到的结果与上述结果相似。
B.鉴定在血清转化测定（如上面A部分所述）中诱发的抗体的质量
在小鼠血清转化测定中诱发出三类抗体：
（a）抗Heptavax B（血浆）的抗体
（b）抗Recombivax HB（酵母）的抗体
（c）抗申请人疫苗（CHO）的抗体。
以相同的效价分析这三类抗体的质量和特异性。申请人的高度纯化的HBsAg（CHO）粒子（实施例5步骤5）在SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳分级，并转移到硝化纤维素滤膜上。利用Western印迹法，使滤膜与三类抗体接触。
抗Heptavax B（血浆）和Recombivax HB（酵母）的小鼠抗体只识别HBsAg粒子中存在的S蛋白（24K），而抗申请人疫苗（CHO）的小鼠抗体识别S和前-S2（24K、33K）两种蛋白。
这些发现再次证实，与商品疫苗相比，这种疫苗诱发出更高效价的抗体。另外，申请人疫苗诱发出的抗体的质量和特异性不同，因为它们除了S（24K）蛋白质之外还识别前-S2（33K）蛋白质，后者被认为对病毒的传染力有重要作用。
C.用无反应小鼠作的实验
用同类系B10S品系小鼠（得自Harlan Olac公司，Bicester，英国）进行实验，已知这些小鼠对S蛋白无反应，即，对不含前-S蛋白的任何HBsAg疫苗都无反应（Milich等，Science，1985年228卷1195-1198页）。将这些小鼠分成两组，每组26只。一组小鼠用1微克来源于酵母的Recombivax HB疫苗（在发明背景中说明）腹膜内注射，该疫苗没有前-S1或前-S2决定簇;另一组小鼠用1微克按实施例11所述生产的申请人的HBsAg疫苗腹膜内注射（这约为小鼠正常剂量的50倍）。在初次免疫三十天之后，将每组小鼠的一半抽血，如下所述测定血清中的抗体效价。剩下的小鼠再次免疫（加强免疫），第二次免疫两周之后抽血，如下所述测定血清中的抗体效价。
用测定HBsAg抗体的市售试剂盒Ausab RIA（Abbott）分析血清;这种测定能检测和定量测定抗S抗体。示于图10的结果表明，在初次免疫之后，两组小鼠中的抗体效价只略有提高。但是，在第二次免疫之后，申请人的疫苗诱发的抗体效价几乎比Recombivax高10倍;这在统计上有显著性差异（p＜0.001）。这些结果表明，申请人的疫苗克服了现有疫苗存在的无反应问题。
D.进一步鉴定在血清转化测定中诱发的抗体的质量
在进一步的实验中，在用来源于酵母的Recombivax HB和申请人的HBsAg疫苗作第二次免疫之后收集上述无反应小鼠的血清，用固相酶联免疫吸附分析法（ELISA）测定抗前-S1抗体的存在。在这种测定中，将相应于HBsAg前-S1区的合成二十一肽涂在96孔聚苯乙烯微量滴定板上（Nunc公司，Covalink板，产品编号478042），每孔0.5微克。然后用不同的血清，包括作为阴性对照的正常小鼠血清，按1∶5稀释后铺到各小孔上，每种血清作两个平行试验。接着用作为第二抗体的生物素化抗小鼠亲合性纯化IgG和ExtrAridin过氧化物酶（Bio-Makor染色试剂盒，产品编号7801-1）连续保温。示于下面表Ⅲ中的结果表明，在用申请人的HBsAg疫苗免疫的无反应小鼠的血清中有抗前-S1抗体存在，相比之下，在用来源于酵母的Recombivax接种的小鼠血清中不存在这种抗体。
表Ⅲ
无反应小鼠体内抗前-S1抗体的固相ELISA结果
光密度(405纳米)
血清来源 实验1 实验2
接种申请人疫苗后 0.797;0.811 0.608;0.575
接种Recombivax后 0.422;0.399 0.363;0.352
正常小鼠血清 0.397;0.399 0.389;0.386
这些结果表明，申请人疫苗诱发产生抗前-S1抗体，而来源于酵母的疫苗不诱发产生这种抗体。在实施例12的最后将讨论这些发现的新颖性和意义。
实施例10
纯化由哺乳动物细胞培养物分泌的HBsAg粒子的替代方法
如图4所说明的，“HBsAg粒子的纯化示意图”由5个关键步骤组成。每一步都可以采用不同于实施例5中详述方法的替代方法。
另外，可以将这些替代方法进行各种组合用于生产纯化的HBsAg粒子。
这些替代方法与申请人的优选纯化方法（在实施例5和图4中说明）的对比总结在本实施例末尾的表Ⅱ中。
下面是对纯化示意图中每一步骤的可能替代方法的详细说明。
A.步骤1（培养基的预分级）的替代方法
产生HBsAg粒子的CHO细胞（在实施例3和4中说明）可以换一种方式在以下培养基中培养：
1）实施例3（a）中所述的生长培养基，其中含有2-10%胎牛血清，最好是含2%胎牛血清，该生长介质不经预分级（实施例5中所述的生长培养基预分级）。
但是，这种替代方法造成了进一步纯化的问题。
当培养基未经预分级时，在后继的纯化步骤中污染蛋白的含量很高，最终收率减少，最终产物的纯度降低。在以下步骤中叙述的替代性纯化步骤包括使用聚乙二醇分级;亲合色谱（Affigel Blue，Blue-Sepharose，Phenyl-Sepharose）;离子交换色谱（Heparin-Sepharose，DEAE-Sephacel）;凝胶过滤（Sephacryl S-400）。这些步骤都与不把培养基预分级的第一步结合使用。只是凝胶过滤（Sephacryl S-400）替代方法是对预分级培养基产生的HBsAg粒子进行的（实施例5，优选方法A）。
2）实施例3和5所述的生长培养基，其中含有2-10%、最好是2%的胎牛血清，它用Pellicon超滤系统预分级（实施例5），但所述预分级中使用截止分子量为10000或100000的膜代替截止分子量为300，000的膜。
但是这一替代方法造成了细胞培养物生长的问题。
当在培养基的Pellicon超滤预分级中使用截止分子量为10，000或100，000的膜时，细胞的生长受到显著抑制，造成HBsAg的收率较低。
因此，申请人的步骤1的优选方法是图4和实施例5中所述的方法。
B.步骤2（含HBsAg粒子培养基的澄清）的替代方法
产生分泌到培养基中的HBsAg粒子的CHO细胞培养基可以用可能的替代步骤澄清：
1）用Sorvall离心机（RC-3B型，摆桶型转子）在1升的料管中将收集的培养基在4000转/分下离心15-20分钟。然后将上清液（澄清除去细胞和部分细胞碎片）按图4说明的纯化方法的步骤3-5进行后继的加工处理。
但是，用这些替代方法产生了以下问题。
将收集的培养基离心只除去了培养基中的全细胞，其它的主要污染物（例如细胞膜和类脂复合物）仍留在上清液中。这干扰了后续的凝胶过滤纯化步骤（步骤4、5），导致HBsAg粒子的总收率减小和HBsAg粒子纯度下降。另外，离心步骤是耗时过程，对于大体积不能有效地使用（每个离心机每小时只能处理12升左右）。
2）用通常供灭菌用的0.22微米过滤系统（Millipore）过滤。（这与用0.22微米膜的Pellicon系统进行切向流动超滤不同-实施例5）。
但是，用这种替代方法产生以下问题。
用0.22微米膜灭菌系统（与带有截止孔径为0.22微米的膜的Pellicon切向流动超滤系统不同）过滤，能有效地澄清培养基，除去全细胞、细胞膜和类脂复合物，但是有下列缺点：该系统不能处理大体积，因为这种0.22微米灭菌型膜很快就会堵塞，需要频繁更换。这会使产物收率受损失，而且也耗时。
因此，申请人的优选系统是在图4和实施例5的步骤2中叙述的系统。在该步骤中申请人使用带有截止孔径为0.22微米的膜的Pellicon切向流动超滤系统。这是一种工业规模的系统，能够处理大体积的培养基，而且培养基的处理很迅速（每小时数百升）。该系统较不易堵塞，HBsAg粒子的回收率为100%。
C.步骤3（澄清培养基的浓缩步骤）的替代方法
1）使用10%聚乙二醇（PEG 6000，Sigma公司）进行聚乙二醇分级，以便使包括HBsAg粒子在内的高分子量蛋白质复合物沉淀。将溶在PBS中的浓缩形式的PEG（25-30%）加到澄清的培养基中（步骤2），使PEG的最终浓度为10%W/V。可以用离心法（在Sorvall RC-38离心机中，固定角度转子，50毫升离心管，在6000-7000转/分下20分钟）或用带有截止分子量为300，000的膜的Pellicon切向流动超滤系统过滤收集PEG沉淀物（如图4步骤3和实施例5所述）。将溶液充分混合并且在4℃下放置至少30分钟。注意这一PEG分级步骤只是对未经步骤1预分级的培养基中产生的HBsAg粒子进行的。
用这种替代浓缩方法得到以下结果。
澄清的培养基用10%PEG分级的作法，仅使用小体积的澄清培养基时（最多1升）才有效。另外，更重要的是，PEG分级只回收到75%的HBsAg粒子。10%PEG分级造成了总蛋白质损失约80%（包括全部HBsAg粒子的25%），而HBsAg粒子的纯度在用10%PEG分级后仅为0.5-1%。最后，在PEG分级后，必须将含有HBsAg的沉淀物重新悬浮在PBS中并透析，以除去PEG。此步骤之后必须接着另一个浓缩步骤，然后才能进行最后的纯化步骤（步骤4、5）。因此，PEG分级是耗时的，造成了HBsAg粒子的明显损失，它至多是一个需要后继浓缩步骤的预浓缩步骤，而且总的来说，可以认为是一种昂贵的步骤。注意在下面的某些步骤中PEG浓缩与其它替代方法结合进行（即，与离子交换色谱、亲合色谱及凝胶过滤一起进行）。
2）使用截止分子量为10，000、100，000或300，000的膜进行切向流动超滤（Millipore公司制造的Minitan和Pellicon系统）。这些使用Minitan或Pellicon系统的方法能在超滤过程中对保留物（未透过膜的物质）进行透析。此系统的典型应用如下：
a）带有截止分子量为10，000的膜的Minitan系统：6.4升澄清培养基（步骤2）超滤，用2升磷酸盐缓冲液（PBS，4×500毫升）透析。这样得到260毫升最终浓缩物（浓缩约25倍）。
b）带有截止分子量为100，000的膜的Pellicon系统：34升澄清培养基（步骤2）超滤，用8升PBS（8×1升PBS）透析。这样得到660毫升最终浓缩物（浓缩约50倍）。
c）带有截止分子量为300，000的膜的Pellicon系统：34升澄清培养基（步骤2）超滤，用10升PBS（10×1升PBS）透析。这样得到500毫升最终浓缩物（浓缩约70倍）。
用替代的浓缩方法得到以下结果：
a）带有截止分子量为10，000的膜的Minitan系统超滤和透析很慢。因此该系统不能用于HBsAg粒子的工业规模生产。虽然HBsAg粒子的工业规模生产。虽然HBsAg粒子的回收率很高（高于96%），但是总蛋白质回收率也很高（高于95%）。因此，此系统在将起始物浓缩而不损失产物方面很有效，但是不能纯化起始物中的HBsAg粒子，HBsAg粒子与总蛋白质之比保持不变（HBsAg粒子的纯度只有约0.4%）。
当澄清培养基的体积增加时，留在膜上的蛋白质的数量增加到使流速显著减小的程度。
b）用带有截止分子量为100，000的膜的Pellicon系统超滤和透析比上述（a）中用带有截止分子量为10，000的膜的Minitan系统更有效。可以处理较大的体积，而且流速较快。阻留在膜上的蛋白质较少，因此当处理含有大量蛋白质的大体积培养基时，流速不受严重限制。
但是，虽然对培养基的浓缩很有效，但该系统不能专一地纯化HBsAg粒子：HBsAg粒子的回收率为100%，而总蛋白质回收率在95%以上。因此，HBsAg粒子与总蛋白质的比例保持与起始物中相同（HBsAg粒子的纯度仅为约0.4%）。
c）用带有截止分子量为300，000的膜的Pellicon系统超滤和透析是优选的方法，比上述两种方法（a、b）都更有效。该系统同时实现了HBsAg粒子的浓缩和专一性纯化：HBsAg粒子回收98%，而原始总蛋白质仅回收10%。这使HBsAg与总蛋白质之比增加了9倍（HBsAg粒子的纯度为3-4%）。
d）为了在这一浓缩步骤实现HBsAg的进一步纯化，在用上述的带有截止分子量为300，000的膜的Pellicon系统超滤和透析之后，申请人增加了另一个任选的替代步骤。这一附加步骤是用10%PEG进行PEG分级（此法如本节的第一部分所述，但区别是在超滤之后使用PEG而不是用它代替过滤）。
但是这造成了HBsAg粒子的回收率减少28%（由98%降至70%），虽然总蛋白质由10%减少到了2.5%的理想水平。（HBsAg粒子的纯度约为7-10%）。在超滤之后进行PEG分级这一替代步骤不打算用于前面a和b中叙述的替代系统，因为它们的总蛋白质含量在超滤后很高（超过98%）。
总的看来，浓缩步骤是纯化过程的一个关键步骤。为了使最后的凝胶过滤纯化（实施例5，图4）能够进行，必须先将澄清培养基浓缩。注意上述的所有替代浓缩方法都是用于在细胞培养时未经预分级的澄清粗制培养基。使用所述系统对所述培养基预分级的方法（图4和实施例5，步骤1）是作为一个独特的步骤而建立的，用来克服在浓缩步骤（步骤3）和最后的纯化步骤（步骤4、5）中遇到的问题。所述预分级除去了分子量约为300，000的培养基污染物（在细胞培养之前）。
申请人的优选浓缩方法（实施例5、图4）使用带有截止分子量为300，000的膜的Pellicon系统，当将此方法用于原来预分级过的澄清粗制培养基时，得到以下结果：由25升培养基得到148毫升浓缩物（在超滤浓缩期间用PBS透析时使用10升PBS）。这就浓缩了170倍，HBsAg的回收率约为96%，而总蛋白质回收率只有2.5%，达到了理想的水平。（在这一阶段HBsAg粒子的纯度约为15%-也见表Ⅰ。）这比上述的所有替代步骤（1、2a、2b、2c、2d）都优越得多。因此，申请人的优选方法在一个步骤中同时实现将HBsAg浓缩和纯化到高水平，而HBsAg粒子没有重大损失。
D.步骤4和5（凝胶过滤纯化）的替代方法
1）使用疏水柱的亲合色谱
使用三种亲合柱：Blue-Sepharose（Pharmacia）、Affigel Blue（Biorad）、Phenyl-Sepharose（Pharmacia）。（按照Pharmacia和Biorad公司提供的说明书使用这些柱。）
Affigel Blue和Blue-Sepharose柱用于以下纯化方法（与申请人优选方法的各种替代步骤相结合）。
HBsAg粒子由培养基未经预分级的培养物生成，培养物用10%PEG浓缩（见前面的C1，浓缩步骤的替代方法）。将PEG沉淀物溶于最小体积的PBS中（每毫升PBS 250微克蛋白质），加在Affigel Blue或Blue-Sepharose柱上。申请人使用35毫升的装填柱，每柱加5毫升HBsAg/PBS溶液（每柱1.25毫克HBsAg粒子）。用2倍体积（70毫升）的PBS洗柱，先用硫氰化钠（NaSCN）缓冲液、接着用40%的PEG/PBS溶液洗脱。洗脱时先用1体积（35毫升）0.1M NaSCN缓冲液洗第一次，接着用0.25M NaSCN（35毫升）洗第二次。这样有效地除去了诸如清蛋白等蛋白质，但未从柱中除去HBsAg。HBsAg粒子用含1M NaCl 的40%PEG/PBS溶液从柱中洗脱。用这种方法只回收到10-20%的HBsAg粒子，Affigel Blue与Blue-Sepharose柱之间没有明显差别。HBsAg的纯度低（5%-7%）,因为它与清蛋白一起洗脱。Phenyl-Sepharose柱（2.7毫升床体积的微型柱）用于以下纯化方法：HBsAg粒子得自培养基未经预分级的细胞培养物，在带有截止分子量为300，000的膜的Pellicon系统上进行浓缩并对PBS透析。然后用10%PEG/PBS进一步浓缩，将PEG沉淀物溶于最小体积的PBS中（最终体积1.8毫升，约0.5毫克HBsAg粒子）。然后将它加到柱上，用19毫升PBS（7倍体积）洗。用13.5毫升水（5倍体积）洗脱。只洗脱出22%的HBsAg，它的纯度低（7%），因为清蛋白和HBsAg级分一起洗脱。
因此这些方法不如申请人的优选方法（实施例5、图4）。
2）离子交换色谱
使用两种离子交换柱：Heparin-Sepharose 3毫升床体积柱（Pharmacia）和DEAE-Sephacel 2.5毫升床体积柱（Pharmacia）（根据制造商Pharmacia公司提供的说明书使用这些柱）。
对于这两种柱，所加入的HBsAg粒子样品均按以下方式制备：
HBsAg粒子得自培养基未经预分级的培养物。将收集的培养基在带有截止分子量为300，000的膜的Pellicon系统上浓缩和透析，再用10%PEG/PBS进一步浓缩。将PEG浓缩物（HBsAg样品）溶于稀PBS（0.3×PBS）中，按以下方式加到柱上：
将6毫升HBsAg样品（约1.5毫克）加到Heparin-Sepharose柱上。11毫升（约2.75毫克）加到DEAE-Sephacel柱上。HBsAg粒子从柱中洗脱如下：
用4体积（12毫升）的0.3×PBS洗Heparin-Sepharose柱，用0.3×PBS和2×PBS之间的PBS梯度溶液（30毫升，10倍体积）洗脱。由该柱只回收到10%-20%HBsAg，其纯度低（5-7%）。DEAE-Sephacel柱用PBS阶式梯度溶液洗脱;用0.2×PBS、0.3×PBS、0.5×PBS、0.75×PBS、1×PBS、1.5×PBS、2×PBS各1体积（2.5毫升）洗柱。这使HBsAg粒子释放出来，回收率为70%，但是分布在许多级分中（拖尾）。另外，因为在所有HBsAg级分中都有污染物存在，所以纯度低（约5-10%）。
因此，用这些方法不能有效地纯化HBsAg粒子。
注意，后来试验了另外几个离子交换柱（见实施例11）。使用SP-Trisacryl得到了出乎意料的好结果，将该柱并入优选方法B中（实施例11）。
3）凝胶过滤色谱
a）使用Sepharose CL-6B（Pharmacia，500毫升床体积柱，按制造商说明书使用）作为优选的Sephacryl S-400凝胶过滤的替代方法。
按以下方式将使用Sepharose CL-6B柱的凝胶过滤与Sephacryl S-400柱（本方法中为500毫升床体积类型）直接比较：
HBsAg粒子由培养基未经预分级的培养物得到。收集到的含HBsAg培养基先在Pellicon系统（带有截止分子量为300，000的膜）或Amicon XM300系统（带有截止分子量为300，000的膜，Amicon公司）上浓缩，然后用10%PEG分级（与事先不在带有截止分子量为300，000的膜的Pellicon系统上浓缩就用PEG分级相比，这样作减少了HBsAg粒子的损失）。Pellicon或Amicon XM300得到的结果相同。将PEG沉淀物（含HBsAg粒子的样品）溶解在1×PBS中，最好溶解在高盐Tris-NaCl缓冲液中（50mM Tris-Trizma Base，Sigma公司;3M NaCl，分析纯，Merck公司）。将8.1毫升HBsAg样品（约2毫克）加到Sepharose或Sephacryl柱上。在两种情况下，加到PBS缓冲液中的样品的分离和纯化都比加到Tris-NaCl缓冲液中的样品好（2倍）。这些柱在纯化HBsAg粒子方面的差别可以总结如下：
用1体积（500毫升）PBS洗柱使HBsAg粒子洗脱出（两个柱均为500毫升床体积）。以10毫升为一个样品收集洗脱出的各级分，对每份样品试验HBsAg特异性（Travenol试剂盒，在实施例8和9中有说明，蛋白质测定在实施例7中说明）。Sephacryl S-400柱的HBsAg粒子回收率（收率）高于90%，而Sepharose CL-6B柱仅为75%。当样品加到PBS中时，Sephacryl柱得到的粒子纯度为45%（加到Tris-NaCl缓冲液中时为20%）;而当样品加到PBS中时用Sepharose柱得到的粒子纯度只有20-30%（样品加到Tris-NaCl缓冲液中时纯度为10-15%）。
为了用Sephacryl或Sepharose柱达到更高的HBsAg粒子纯度，进行第二次凝胶过滤。将第一次凝胶过滤洗脱出的峰级分用10%PEG/PBS浓缩，将PEG沉淀物重新溶解在PBS中。象上面对第一个柱所述的那样将样品加到第二个柱上，但是这次只用PBS作为加样缓冲液。象对第一个柱子那样洗脱和分析HBsAg粒子。观察到以下结果：
当第一个柱是Sephacryl S-400，第二个柱是Sephacryl S-400时，回收到约95%HBsAg粒子，纯度为60-70%。
当第一个柱是Sephacryl S-400，第二个柱是Sepharose CL-6B时，只回收到约60-70%的HBsAg粒子，纯度只有约50%。
当第一个柱是Sepharose CL-6B，第二个柱也是Sepharose CL-6B时，只回收到70%HBsAg粒子，峰很宽（拖尾峰），纯度低到约30%。
应该再次指出，上述的这些纯化方法是对在培养基未经预分级的培养物中产生的HBsAg粒子进行的。预分级步骤使申请人能将HBsAg粒子纯化得到高得多的水平，在任何阶段都不需要PEG分级/浓缩，只采用在实施例5和图4中所述的步骤。如本实施例的C1部分所述（步骤3的替代方法），PEG分级/浓缩要求以离心和/或结合透析的超滤作为一个必要步骤。因此这既费时又增加生产成本。
最后，如上所述，欲用凝胶过滤法纯化的HBsAg样品在制备时采用一个浓缩步骤，这利用带有截止分子量为300，000的膜的Pellicon系统或Amicon XM 300系统来进行。二者得到同样的结果，但是所用的Amicon系统只能处理50毫升样品，并且要求50磅/平方英寸的操作压力。Pellicon系统能处理大得多的体积，并且在0磅/平方英寸的压力下操作。这对于工业应用和低成本生产是理想的。
因此，优选的方法是用Sephacryl S-400进行两次连续的柱色谱操作，以此来制备从培养基经过预分级的培养物中得到的HBsAg。这使得在第二次操作后的最终HBsAg粒子纯度高于95%（实施例5和图4）。这一步骤也更为经济合算，因为两次连续操作使用同一个柱。
4）作为对第二个凝胶过滤步骤（图4和实施例5中的步骤5）的另一替代方法，将从第一个Sephacryl S-400柱洗脱出的HBsAg粒子（步骤4）如下加到蔗糖梯度上：
HBsAg粒子得自培养基经过预分级的培养物。按实施例5中直到步骤4末尾所述（即，步骤1-4）处理含HBsAg的培养基。
将纯化过的HBsAg粒子（在第一个Sephacryl S-400柱上凝胶过滤之后）加到Beckman SW 27超离心管中的50%至5%蔗糖梯度（用PBS配制）上。将蔗糖梯度在27000转/分下于16-21℃超离心18小时。离心之后由管底以1.8毫升为一个级分进行收集，测定它们的蔗糖浓度（用折射仪）和HBsAg特异性（用实施例7的方法）。HBsAg粒子特异峰以尖锐峰位于级分6-7中。HBsAg在蔗糖梯度中的这一条带图形表明用申请人方法生产的HBsAg粒子高度均一（示于图5）。
进一步鉴定（详述于实施例7）蔗糖梯度分离后HBsAg的纯度表明，用这种方法制备的HBsAg粒子的纯度（60-70%）没有改进（如实施例7中所述用SDS-PAGE和Western印迹分析）。另外，收率也比用凝胶过滤法达到的低-回收率只有约70%。再者，蔗糖法很费时，要使用贵重的仪器。
5）为得到高纯度的HBsAg粒子，作为对第二个凝胶过滤步骤（图4和实施例5中的步骤5）的另一个可能替代方法，将从第一个Sephacryl S-400柱洗脱出的HBsAg粒子加到CsCl梯度上，用超离心法分离（CsCl梯度超离心法详述在Hilleman等，J.Infection，1983年第7卷增刊I 3-8页;Adamowicz等，Vaccine，1984年第2卷209-214页）。
用CsCl梯度分离法（等密度梯度分离）所得的结果是：回收到高纯度的HBsAg粒子（高于90%），但是回收率低（约40-50%）。回收率降低是由于从CsCl梯度回收的HBsAg粒子必须透析，HBsAg粒子粘附在进行透析用的透析袋上。另外，CsCl梯度超离心很昂贵和费时，因此在工业上不适用。因此，优选的方法是实施例5和图4中叙述的方法。
表Ⅱ对比了申请人的纯化HBsAg粒子的优选新方法和在HBsAg粒子纯化中使用的替代方法。所包括的是申请人在建立自己体系的过程中曾用过的可能替代方法。在实施例5和图4中提供了优选方法A的细节。替代方法的细节在上述实施例10中说明。在实施例11和图8中提供了一种特别优选的方法（优选方法B）的细节。
实施例11
生产和纯化HBsAg粒子的优选方法B（特别优选的方法）
A.HBsAg生产和纯化方法的详细描述
图8画出了这一方法的流程图。
注意，在所有步骤中均使用无热原的水和容器。
步骤1至3：
这些步骤与优选方法A（实施例5）中所述的步骤1至3相同。
步骤4：对浓缩和澄清的培养基中的HBsAg粒子进行DNA酶处理
用一小瓶11，700单位不含蛋白酶的DNA酶（美国Biochemical公司）处理步骤3由Minitan系统回收的150毫升保留物（或浓缩物）。在室温下保温2小时。通过这一处理，DNA含量由20纳克/微克HBsAg减少到2皮克/微克HBsAg。
在DNA酶处理结束时，用pH＝4.5的20 mM NaAc按1∶5将蛋白质溶液稀释。如有必要，将pH调节到4.5。稀释操作在硅烷化瓶中进行，以防止HBsAg吸附。在稀释和酸化后出现混浊，在Sorvall离心机上于12，000转/分下离心30分钟除去混浊物。上清液（约850毫升）含有HBsAg。
注意，进行稀释和酸化是为了使溶液适合步骤5中的Trisacryl柱，加到该柱上的必须是低盐、低pH溶液。出人意料的是，在这些条件下生成的混浊物含有清蛋白和其它污染物，但是不含HBsAg。因此，离心除去这些混浊物实现了纯化而不损失HBsAg。
步骤5：在DNA酶处理后HBsAg粒子的离子交换纯化
在这一步骤中，将前一步骤的离心上清液加到阳离子交换柱SP-Trisacryl LS（法国IBF公司）上。试验了很多离子交换树脂来纯化HBsAg（见下面的C部分）。出乎意料的是，SP-Trisacryl LS阳离子交换柱是唯一的具有高容量、能以高收率和高纯化度生产HBsAg的柱;SP-Trisacryl LS是N-丙烯酰-2-氨基-2-羟甲基-1，3丙二醇的共聚物，带有以下化学基团作为磺酸官能团：
所用的柱是5厘米×21.5厘米柱（Pharmacia），装填有430毫升SP-Trisacryl LS，最大线性流速为3.6（720毫升/小时）。
在上述流速下用5倍床体积的20 mM NaAc（pH＝4.5）使柱平衡。加样之后，用3倍床体积的50 mM NaCl在20 mM NaAc中的溶液（pH＝4.5）洗柱。
将加样和洗柱步骤的流出液（其中含DNA和DNA降解产物）弃去。开始洗脱HBsAg时，缓冲液改为140-200 mM NaCl在20 mM NaAc中的溶液（pH＝4.5）。洗脱步骤的线性流速为6.3（1260毫升/小时）。通过监测流出液在280纳米处的光吸收连续监测实验进程。出现两个峰，第一个含有纯的HBsAg，第二个含有一些清蛋白污染物，其数量取决于所用的NaCl浓度。通过这一步骤，约80%的HBsAg从柱中被置换到1个床体积的流出液中。收集含有很纯HBsAg的第一个峰用于下一步骤。
步骤5A：
SP-Trisacryl柱的HBsAg流出液与1∶4000稀释的37%甲醛（美国药典级）一起在30℃保温48小时。这一处理使蛋白质溶液中可能存在的病毒灭活，只作为预防措施进行。
步骤6：浓缩和纯化
将前一步骤的含HBsAg的溶液在使用截止分子量为100，000的膜的Minitan或Pellicon超滤系统上浓缩。渗流速度为1升/小时。HBsAg不透过膜，收集在保留物中。将保留物溶液浓缩到原体积的约50%。
浓缩的保留物溶液现在象优选方法A中步骤4一样处理。将溶液加到两个相连的5厘米×100厘米Sephacryl-400超细凝胶过滤柱上，柱中装填有总体积为4升的树脂，流速为140毫升/小时（也可以用一个更大的柱子）。
用至少2个床体积的PBS缓冲液以上述流速使柱平衡（实施例5）。
在外水体积之后洗脱出HBsAg，它具有高纯度（98%以上）。甲醛被阻留在柱上，在大约1个床体积后洗脱出。申请人认为可以省略这一Sephacryl-400色谱步骤而纯度不会有明显损失，在这种情况下利用在Minitan或Pellicon超滤系统上透滤将甲醛除去。
由Sephacryl-400柱流出的含HBsAg的流出液可以通过一个Gelman ACRO 50A（0.2微米）滤器滤入玻璃瓶中灭菌。
B.上述优选方法B比优选方法A（实施例5）优越之处
这种新方法生产出了比先前的方法生产的产品更纯的高度有效的产品。其纯度（就蛋白质而言）超过98%，DNA污染物低于每毫克HBsAg 0.3皮克。因此产物是临床级的。这一新的特别优选的方法仍很简单，只涉及5-6个步骤，快速而非常有效。这样生产的产品是成本很低的高纯度产品。
C.步骤5中使用的SP-Trisacryl LS柱比其它离子交换柱优越之处
试验了很多柱，比较了它们将步骤1到3的最初纯化之后的HBsAg粒子进一步纯化的能力。SP-Trisacryl被证实是唯一对HBsAg既有足够高的容量，又能实现高收率和高纯度的离子交换树脂。
为了说明SP-Trisacryl柱在纯化HBsAg粒子方面出乎意料的成功应用，下面对所试验的所有柱的使用情况作出说明。这些结果清楚地表明，SP-Trisacryl柱比所试验的所有其它柱都出乎意料地优越。
在步骤3之后用来纯化HBsAg粒子的试验柱
（a）S-Sepharose
问题：（1）回收率低-对粒子亲合性高。
（2）DNA与粒子结合，一起洗脱。
（b）硫酸葡聚糖
问题：（1）容量很低。
（2）回收率随不同的缓冲条件而变。
（c）HA Ultragel
问题：（1）容量很低。
（2）回收率差。
（d）HTP Biogel
问题：回收率仅50%-HBsAg对HTP-Biogel的亲合性高。
（e）DEAE Sepharose
问题：容量低-未测定回收率。
（f）SP-Trisacryl
优点：高容量和高回收率（收率）。
实施例12
人体内的血清转化
将申请人的重组HBsAg疫苗（按实施例11所述生产）注射给成年志愿者，用测定抗HBsAg抗体的商品试剂盒Ausab EIA或Ausab RIA（Abbott），证实诱发出了针对疫苗的高效价抗体。
另外，鉴定出一名无反应者，即，一名对先前的来源于酵母的重组HBsAg疫苗无反应的实验对象。注射了申请人的重组HBsAg疫苗后，诱发了抗HBsAg抗体的产生。这表明申请人的重组HBsAg疫苗比现有的疫苗产生更高比例的免疫对象。
进一步鉴定在人体内诱发的抗体的质量
从用申请人的HBsAg疫苗免疫的个体收集人血清，与用Recombivax疫苗免疫的个体及乙型肝炎感染患者的人血清相比较。用固相ELISA（如实施例9D部分中所述）分析血清中抗前-S1抗体的存在，以生物素化的经亲合纯化的抗人IgG（Sigma公司，产品编号B-9015）作为第二抗体。结果示于下面的表Ⅳ中。
表 Ⅳ
固相ELISA分析人血清中抗前-S1抗体的结果
光密度(405纳米)
血清来源 实验1 实验2
注射申请人的疫苗后 0.556;0.572 0.840;0.843
患者 0.530;0.538 未测
注射Recombivax疫苗后 0.365;0.377 未测
正常人血清 0.362;0.367 0.389;0.386
表Ⅳ表明，用申请人的疫苗免疫的个体血液内有抗前-S1抗体，而且这些抗体的含量与乙型肝炎感染患者血液中的相似。但是，用来源于酵母的Recombivax免疫的个体血液不含抗前-S1抗体。
申请人相信这是第一次表明一种重组HBsAg疫苗诱发产生了抗前-S1抗体，这些发现证实申请人的疫苗比现有的疫苗更有效，因为它由于还具有前-S1决定簇，能克服对S区或前-S2区决定簇无反应的问题（例如见Zuckerman，J.Infection 1986年第13卷增刊A第61-67页）。
实施例13
生产和纯化HBsAg的优选方法C
A.HBsAg生产和纯化方法（优选方法C）的详细说明
图9画出了说明此方法的流程图。
步骤1到3：
这些步骤与优选方法A（实施例5）和优选方法B（实施例11）中所述的步骤1到3相同。
步骤4：在DEAE阴离子交换柱上纯化HBsAg粒子
将步骤3从Minitan或Pellicon系统回收的保留物或浓缩物（100-400毫升）加到装有400-900毫升DEAE快速流动树脂的离子交换柱上，树脂悬浮并平衡在1×PBS（pH7.35±0.05）中。
收集过柱体积，然后用1×PBS洗柱（0.5倍加样体积），收集流出液，加到过柱体积中（总体积＝1.5倍加样体积）。
在DEAE柱之后，用10 mM NaAc（pH＝4.5）将蛋白质溶液按1∶3稀释，并酸化到pH＝4.5（在稀释之后无可见的混浊，与优选方法B步骤4结束时的类似方法不同;这是因为几乎所有的清蛋白都已被DEAE柱除去。因此，离心除去混浊物的步骤现在可以省略。）
注意，在DEAE色谱步骤之前，一个任选的附加步骤是，用DNA酶处理步骤3的浓缩物（如优选方法B步骤4中所述）。
步骤5：HBsAg粒子的离子交换纯化
在此步骤中，将前一步骤中稀释和酸化的过柱溶液如优选方法B（实施例11）步骤5中所述加到阳离子交换柱SP-Trisacryl LS上。
步骤5A：甲醛处理
如优选方法B（实施例11）的步骤5A中所述，用甲醛处理从SP-Trisacryl柱洗脱出的HBsAg。
步骤6：除去甲醛和灭菌
用透析法从最后一步的经过甲醛处理的HBsAg溶液中除去甲醛。透析在Minitan（或Pellicon）超滤系统上用截止分子量为30，000或100，000的膜进行。对1×PBS进行透析，在开始透析前将保留物浓缩到约50毫升。在浓缩和透析3-4个循环后透析完全，此时保留物浓缩到约50毫升。用1×PBS洗涤超滤系统，将洗涤液加到保留物中，使保留物的最终总体积为100毫升。将这个HBsAg溶液通过0.2微米滤器灭菌，在4℃贮存。
B.上述优选方法C比优选方法B（实施例11）优越之处
这种新方法得到的产物与先前方法（优选方法B）的纯度大致相同。产物收率也与优选方法B达到的收率相近。另外，对用方法C制得的HBsAg粒子所作的分析表明，它们与用方法B制得的相同。这一新方法的优点在于方法更为简单，因此以很低的成本生产出纯度很高的产物。此方法更为简单是因为：
（a）用DEAE柱代替优选方法B中的DNA酶步骤也省去了繁琐的离心步骤;因为省去了DNA酶的成本，此方法的总成本也降低了。
（b）省去了甲醛步骤之前的浓缩步骤;该步骤不是必要的，因为后续的凝胶过滤步骤被省掉了。
（c）省去了耗时的Sephacryl柱的平衡、操作和再生等步骤。
（d）省去了Sephacryl柱色谱（凝胶过滤）之后的浓缩步骤。
C.DEAE Sepharose柱的优点
据信这一离子交换步骤是HBsAg粒子纯化中的新步骤。此步骤的新颖之处在于HBsAg粒子既不与柱结合也不被柱阻留，而是直接通过。因为污染物与柱结合或被柱阻留，所以实现了纯化。DNA与柱结合（因此可以省去方法B中的DNA酶步骤），主要的蛋白质污染物清蛋白被柱阻留，在HBsAg之后洗脱出。类似地，其它阴离子污染物，例如蛋白质、带电类脂、多糖和膜碎片，也与HBsAg粒子分开。另外，细胞培养基中的pH指示剂（染料）也与柱结合，从而与HBsAg粒子分离开。在这个易于实施的纯化步骤之后，HBsAg粒子的纯度大于90%。
注意，这里所用的DEAE柱具有大容量，因为所选择的条件（pH、离子强度）使粒子直接过柱。（这与在实施例11部分C（e）中提到的试图使用DEAE柱不同，在实施例11中申请人试图通过使HBsAg粒子与DEAE柱相结合实现纯化）。