一种改进的检测炭疽芽孢杆菌的基因液相芯片及其制备方法和应用 【技术领域】
本发明涉及一种检测炭疽芽孢杆菌的基因液相芯片及其制备方法。本发明还涉及利用所述的基因液相芯片进行检测的方法。
背景技术
液相芯片检测是近几年发展起来的新兴技术，具有快速、特异、敏感的特点。悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特的色彩编号，每颗微球大小约5.5μm，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。
炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)是急性传染病炭疽的病原体，为粗大的革兰氏阳性杆菌，具有强烈的致病性、传染性和生存能力。人类可以通过直接或间接接触炭疽杆菌引起皮肤、肺和肠道感染，导致皮肤炭疽、肺炭疽和肠道炭疽病。炭疽杆菌有两个毒素相关质粒，即编码炭疽毒素的pXO1质粒(181kb)和编码荚膜合成酶的pXO2质粒(96kb)。pXO1和pXO2对毒性是必须的，失去任何一个质粒都将减弱毒性或使其变为无毒株。炭疽杆菌的致病力主要取决于产生荚膜和毒素的能力。
目前，炭疽芽孢杆菌的实验室诊断方法主要是靠涂片显微镜检查、培养性状、噬菌体试验等，这些方法用于检出非临床样品耗时长，而且要具备相应的技术素质。
【发明内容】
本发明涉及一种改进的基因液相芯片及其制备方法，该基因液相芯片可以用于病原体炭疽芽孢杆菌的检测。本发明还涉及利用所述的基因液相芯片进行检测的方法。
经过深入和大量的研究和实验，本发明以pXO2和染色体上的特异基因为靶序列，建立了炭疽芽孢杆菌液相芯片和检测方法，为炭疽芽孢杆菌的检测提供一条可行的途径。
本发明所述的基因液相芯片包括：微球、捕获探针、引物、PCR反应体系、链亲和素-藻红蛋白，该基因液相芯片可检测炭疽芽孢杆菌。
本发明还涉及上述可检测检测炭疽芽孢杆菌的基因液相芯片，该芯片包括：荧光编码的微球、捕获探针、引物、PCR反应体系、链亲和素-藻红蛋白，其中
(1)PCR反应体系包括：10×PCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶。
(2)引物包括：
其中，下游引物是5’生物素标记的BA-1-R，BA-2-R，
具体是，BA-1-R：5’-生物素-TGCTTTAGCGGTAGCAGAGG
BA-2-R：5’-生物素-TTACCCAACATCATCTTCGCA
(3)捕获探针，所述的捕获探针具有特异性：
探针 名称 探针靶位 探针序列(5’-3’) BA-1 炭疽芽孢杆菌str.A2012质粒 pXO2 capB的bp415-437 GAAGAACGCAGGCTTAGATTGGT BA-2 炭疽芽孢杆菌str.′Ames Ancestor′AE017334的 bp742-764 CTCGCTTTCATCGCATTTCTCCC
上面所述探针在合成时在5’端进行氨基修饰，并且连接15-20个T或连接C12作为间隔链，然后将探针与所选的编码微球进行偶联。
(4)微球，一般选择荧光编码的微球，例如来源于Luminex或其他代理公司的任何编号的微球，特异性探针与荧光编码微球偶联形成检测微球，由此构成检测芯片。
(5)链亲和素-藻红蛋白(Streptavidin-R-phycoerythrin，SA-PE)为一种荧光蛋白，能被液相芯片检测系统中的绿色激光激发发光，由此可以进行定性或定量检测。
本发明涉及上述基因液相芯片的制备方法，该方法包括：
1.选取编码微球，取适量如约1.25×106个于离心管内，离心弃上清后，加入0.1mol/L的2-(n-吗啉代)乙磺酸溶液使之重悬；
2.用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针(即捕获探针1和2)稀释，分别加至两种微球悬浮液中，振荡混匀；
3.加入10mg/mL的EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)溶液至微球与探针混和液中，振荡混匀，室温孵育30分钟；
4.用0.02％PBST洗涤，14000g下离心；移弃上清液，将上述微球重悬于1ml 0.1％ SDS(即十二烷基磺酸钠)中，洗涤，离心；
5.移弃上清液，微球重悬于100∏l pH8.0 TE中，振荡悬起混匀，得到偶联好的检测微球，即本发明的基因液相芯片。4℃避光保存。
另一方面，本发明还涉及上述炭疽芽孢杆菌检测基因液相芯片的检测方法，该方法包括：样本核酸的提取，PCR扩增，检测病原体。本发明对上述三个步骤的操作和条件进行了改进和优化。
样本核酸的提取：
采用NaI裂解-玻璃粉吸附法提取样本的核酸。具体如下：
1)向每管样本中加入6mol/L NaI，振荡混匀，煮沸；
2)离心，转上清液至另一含20％玻璃粉液的离心管中；
3)充分混匀，室温放置10分钟，使暴露的DNA吸附于玻璃粉上；8000r/分钟离心，小心倾去上清液；
4)向玻璃粉-DNA沉淀中加入75％乙醇1ml，充分混匀，离心，小心倾去上清液；
5)重复步骤(4)，然后置于37℃恒温箱内干燥；
6)向上述干燥的玻璃粉-DNA沉淀中加20μl TE，充分混匀，65℃加热，离心，回收上清液备用。
PCR扩增：
以上述核酸提取步骤中制备的上清液作为PCR反应的模板，PCR反应体系以及反应条件：
PCR体系：
10×PCR缓冲液： 3∏l
Taq DNA聚合酶： 0.3∏l
dNTPs： 0.3∏l
上游引物： 0.3∏l
下游引物： 0.3∏l
模板DNA： 2∏l
双蒸水ddH2O： 补足30∏l
反应条件：
预变性：
94-96℃ 10分钟
35个循环：
94-96℃ 30-40秒
55-58℃ 30-40秒
72℃ 30-40秒
延伸：
72℃ 4-7分钟
同时，PCR空白对照品为如下：
10×PCR缓冲液： 3∏l
Taq酶： 0.3∏l
dNTPs： 0.3∏l
上游引物： 0.3∏l
下游引物： 0.3∏l
双蒸水ddH2O： 补足30∏l
反应结束后以1％的琼脂糖凝胶电泳检查扩增情况。
检测方法：
1)取上述两种偶联微球混合，装于PCR管中，根据微球计数结果计算相应加入量，使每种微球的量相同，每次反应每种3000-5000个；
2)向各管中加5～17∏l上面的PCR扩增得到的产物，混匀；
3)95℃变性10分钟；随后45～60℃反应10～30分钟；
4)离心或抽滤去掉未结合的PCR产物；
5)再向各孔加SA-PE，室温避光孵育，抽滤去掉未结合的SA-PE；
6)再向各孔加入75∏lTE悬浮液，振荡使微球重悬；
7)反应结束后上LUMINEX检测仪器进行检测。例如使用Bio-plex检测设备，通过红、绿两束激光检测，红色激光激发微球基质的染料从而对微球编号进行识别，绿色激光对结合体的荧光蛋白进行识别，实现捕获探针捕获的PCR产物的定量分析。
附图说明：
图1：用探针1检测炭疽芽孢杆菌核酸地剂量-反应曲线，即模板DNA的量与发生反应的荧光信号值MFI之间的对应关系；横轴代表PCR反应体系中模板DNA的浓度(fg/test)，纵轴代表荧光信号值MFI。
图2：用探针2检测炭疽芽孢杆菌核酸的剂量-反应曲线；横轴代表PCR反应体系中模板DNA的浓度(fg/test)，纵轴代表荧光信号值MFI。
【具体实施方式】
实施例1、基因液相芯片的制备
1.选取编码微球，如044，042号，取约1.25×106个置于离心管，14000g下离心，例如离心3-5分钟，小心吸出上清液；
2.加入50∏l 0.1mol/L的2-(n-吗啉代)乙磺酸溶液，振荡混匀。
3.用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针稀释到0.1mmol/L；将1∏l稀释的探针1和2分别加于044，042号微球悬浮液中，振荡混匀。
4.加入2.5∏l新鲜配制的10mg/mL的EDC溶液至微球与探针混和液中，振荡，室温孵育30分钟。
5.用0.02％ PBST 1ml洗涤1次，离心14000g 3-5分钟。
6.移弃上清液，微球重悬于1ml 0.1％SDS中，洗涤，离心。
7.移弃上清液，微球重悬于100∏l pH8.0 TE中，振荡悬起混匀，即得到偶联好的检测微球。
8.用血球计数器计数微球的数量，换算出每种微球的单位浓度。
9.把偶联好的检测微球放在4℃避光保存，一般每种探针偶联的微球单独保存，使用时，根据检测项目选择要混合的微球种类。
实施例2、样本核酸的提取
采用NaI裂解-玻璃粉吸附法提取样本的核酸。具体如下：
1)向每管样本中加入6mol/LNaI 100μl，振荡混匀，煮沸30分钟。
2)将上述煮沸处理的样本于10000r/分钟离心5分钟，将上清液转至另一含20％玻璃粉液的离心管中。
3)充分混匀，置室温10分钟，8000r/分钟离心2分钟，小心倾去上清液。
4)向玻璃粉DNA沉淀中加入75％乙醇1ml，充分混匀，洗涤玻璃粉，8000r/分钟离心2分钟，小心倾去上清液。
5)重复清洗一次后，放置于37℃恒温箱使彻底干燥。
6)向上述晾干的玻璃粉-DNA沉淀中加20μlTE，充分混匀，65℃加热15分钟。8000r/分钟离心2分钟，回收上清液备用。
实施例3、PCR扩增
以回收的上清液作为PCR反应的模板，PCR反应体系以及反应条件：
PCR体系：
10×PCR缓冲液： 3∏l
Taq酶： 0.3∏l
dNTPs： 0.3∏l
上游引物： 0.3∏l
下游引物： 0.3∏l
模板DNA： 2∏l
双蒸水ddH2O： 补足30∏l
反应条件：
预变性：
94℃ 10分钟
35个循环：
94℃ 30秒
58℃ 30秒
72℃ 40秒
延伸：
72℃ 7分钟
同时设置PCR空白对照，如下：
10×PCR缓冲液： 3∏l
Taq酶： 0.3∏l
dNTPs： 0.3∏l
上游引物： 0.3∏l
下游引物： 0.3∏l
双蒸水ddH2O： 补足30∏l
反应结束后以1％的琼脂糖凝胶电泳检查扩增情况。
实施例4、检测
1.取偶联微球042，044号各5000个混合，分装于PCR管中(根据微球计数结果计算相应加入量)
2.向各管中加5～17∏l上面的PCR产物使其终体积为50∏l。
3.95℃变性10分钟。
4.45～60℃反应10～30分钟。
5.转移至滤板抽滤去掉未结合的PCR产物。
6.再向各孔加75∏l 4ng/∏l SA-PE，室温避光孵育10分钟，抽滤去掉未结合的SA-PE。
7.再向各孔加入75∏l悬浮液，振荡使微球重悬。
8.反应结束后上机检测。
9.Bio-plex检测系统，通过红、绿两束激光检测，红色激光激发微球基质的染料从而对微球编号进行识别，绿色微球对表面结合的荧光染料进行识别，实现捕获探针捕获的PCR产物的定量分析。
在检测时，同时以PCR阴性对照进行检测做为检测本底。对于每个检测体系和检测本底，仪器输出的数据是相应反应体系内一种编号微球群的荧光强度中位值(Median Fluorescence Intensity，MFI)，亦即读取的这种编号的微球群(100个或以上)的每个微球信号强度的统计平均值。结果判断：当待检测样本孔的MFI值为本次检测背景信号强度三倍以上时即判为阳性。
实施例5、定量检测：
提取炭疽芽孢杆菌的基因组DNA，利用核酸蛋白分析仪测定其浓度，进行系列稀释，PCR扩增后，同上面检测步骤进行检测，Bio-Plex Version4.0分析，拟合出剂量-反应曲线和曲线方程。样本检测值代入方程实现定量检测。
结果
针对炭疽芽孢杆菌的检测，本发明分别设计了位于染色体和质粒的两条探针进行检测，即探针1和探针2。炭疽芽孢杆菌强毒株17003-10基因组DNA测定浓度后进行10倍系列稀释，16fg～160ng，按上述确定的方法进行PCR扩增和检测，拟合曲线，得出曲线方程：
探针1的曲线方程：FI＝-9.77647+(1527.96+9.77647)/[(1+(Conc/1.23743E+006)-1.05785]0.774541；
探针2的曲线方程：FI＝-5.51506+(3841.16+5.51506)/[(1+(Conc/280994)-0.954295)]1.44612。
从标准曲线推算检出限，PCR反应管中模板浓度为30pg/test时，探针1信号阳性；PCR反应管中模板浓度为17pg/test时，探针2信号阳性。因此，对质粒pXO2阳性的炭疽芽孢杆菌强毒株，本体系的检出限为30pg/test；而对于质粒pXO2阴性株，检出限为17pg/test。
从上述结果可以得出，本发明的悬浮芯片和检测方法具有以下优越性：
1.灵敏：较之于普通的多重PCR反应，本发明的灵敏度提高从以下两个方面体现：1)检测仪器存在信号的放大系统；2)PCR产物带上的生物素与荧光染料藻红蛋白连接的亲和素结合的放大作用。
2.特异：采用核酸探针技术对标记上生物素的PCR产物进行特异性的识别，而非传统的电泳方法通过PCR产物片段大小进行识别。
3.准确高效：整合核酸体外扩增、核酸分子杂交、编码微球、生物素标记、荧光检测和流式细胞技术于一体，同时实现核酸样品的检测、鉴定，使结果准确，工作高效。
4、芯片制作方便：只用设计好待检目标菌的引物，优化PCR条件，标记对应的探针于编码微球，即可组装成检测体系。
5、本发明涉及的方法同样适用于其他病原体或目标物的核酸检测。
6、可实现多重检测，待检目标灵活可调：可根据不同检测目标，选择对应的引物和微球，组成不同目标组合的检测体系。
【序列表】
<110>中国检验检疫科学研究院
<120>一种改进的检测炭疽芽孢杆菌的基因液相芯片及其制备方法和应用
<130>五种生物恐怖细菌基因悬浮芯片多重检测方法的建立
<160>6
<170>Patentln version 3.3
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>上游引物-1
<400>1
tggacgcata cgagacataa t 21
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>上游引物-2
<400>2
tttcataatc atggatttcc cg 22
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>下游引物-1
<400>3
tgctttagcg gtagcagagg 20
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>下游引物-2
<400>4
ttacccaaca tcatcttcgc a 21
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>探针-1
<400>5
gaagaacgca ggcttagatt ggt 23
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>探针-2
<400>6
ctcgctttca tcgcatttct ccc 23