ZNRD1基因的小干扰RNA序列及其真核表达载体 【技术领域】
本发明属于生物技术领域，涉及胃癌细胞ZNRD1表达的逆转，尤其涉及ZNRD1基因的小干扰RNA序列及其真核表达载体。
背景技术
ZNRD1(zinc ribbon domain-containing 1 protein)是一种锌带蛋白，能够通过调节转录起始位点的选择，或通过RNA合成的延长和终止，在转录中发挥重要调节作用；作为转录相关蛋白，ZNRD1能够参与对多种生理病理过程的调控。ZNRD1基因定位于人的HLA位点，具有潜在的MHC基因治疗的作用。
迄今为止，化疗仍是胃癌的主要治疗方法之一。在反复接触某种抗癌药物后，肿瘤细胞可以获得对该药物以及其他结构和作用机制不尽相同的多种药物的耐受性，即多药耐药性(MDR)。肿瘤细胞对药物的抗药性是目前化疗最棘手的问题，所以，进一步研究肿瘤细胞抗药性的分子基础，已成为提高肿瘤治疗和预后的热点问题。目前，许多药物可以用来逆转肿瘤细胞的MDR，但不能从根本上解决问题，效果欠佳，而且具有一定的毒副作用。与传统的药物治疗相比，基因治疗具有作用特异、敏感、毒副作用低等诸多优点，在MDR逆转中有广阔的发展前景。
ZNRD1基因在对化疗药物长春新碱耐药的胃癌细胞SGC7901/VCR中的表达比非耐药胃癌细胞SGC7901明显增高，提示ZNRD1基因的表达可能在胃癌细胞多药耐药中扮演重要角色。将ZNRD1基因的反义核酸转染胃癌细胞SGC7901/VCR，可降低ZNRD1蛋白的表达，致使胃癌细胞SGC7901/VCR对化疗药物的敏感性增强。但因为反义核酸下调ZNRD1蛋白表达的能力有限，所以还需寻找能高度抑制ZNRD1蛋白表达的分子工具。
【发明内容】
本发明的一个目的在于提供一种ZNRD1基因的小干扰RNA(siRNA)序列，它能够显著抑制胃癌细胞ZNRD1基因的表达。
本发明的另一个目的在于提供一种含有上述ZNRD1基因的小干扰RNA序列的真核表达载体，转染该载体的胃癌细胞对化疗药物更加敏感，能够逆转胃癌细胞的MDR。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
1、一种ZNRD1基因的小干扰RNA(siRNA)序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
该小干扰RNA序列以ZNRD1cDNA为模板，以正反向引物对：
F：ttgag ccgca atctg ccaac aacat ctctt cagat tgcgg ctctt ttt，
R：ctaga aaaag agccg caatc tgaag agatg ttgtt ggcag attgc ggct，
通过PCR扩增得到。
2、含有上述ZNRD1基因的小干扰RNA(siRNA)序列的真核表达载体，该载体的通过Xba I、Bbs I多克隆位点，将上述的ZNRD1siRNA序列构建于mU6pro载体质粒中，构建成mU6pro-ZNRD 1siRNA真核表达载体，其引入mU6pro载体质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
将mU6pro-ZNRD1siRNA真核表达载体通过脂质体转染胃癌细胞株SGC7901/VCR，通过RT-PCR和Western blot进行鉴定、筛选，经过两个月的筛选后获得了1个稳定转染ZNRD1的小干扰RNA、降低了胃癌细胞ZNRD1表达的胃癌细胞克隆SGC7901/VCR-siRNA，说明mU6pro-ZNRD1siRNA载体在真核宿主中表达成功。
MTT法对上述的SGC7901/VCR-siRNA细胞进行体外药物敏感性实验，表明mU6pro-ZNRD1siRNA载体表达下调ZNRD1的胃癌细胞对长春新碱(VCR)、阿霉素(ADR)，5-氟尿嘧啶(5-Flu)和顺铂(CDDP)的敏感性显著增强了。
将SGC7901/VCR-siRNA细胞和SGC7901/VCR-mU6细胞制备成纤维蛋白肿瘤细胞凝块，然后移植正常免疫力小鼠，进行体内药物敏感性实验；结果表明，mU6pro-ZNRD1siRNA载体表达下调ZNRD1，并显著减少了移植瘤体积，说明下调ZNRD1显著增强了胃癌细胞的体内药物敏感性。
流式细胞仪检测SGC7901/VCR-siRNA细胞内阿霉素的蓄积，结果表明，mU6pro-ZNRD1siRNA载体表达下调ZNRD1的胃癌细胞的药物蓄积浓度显著增强了。
SGC7901/VCR-siRNA凋亡细胞的DNA ladder的检测以及Annexin/PI染色法，表明mU6pro-ZNRD1siRNA载体表达下调ZNRD1的胃癌细胞对抗凋亡能力降低。
综上体内体外试验表明，转染mU6pro-ZNRD1siRNA载体构建成功且成功表达。转染宿主后，胃癌细胞对化疗药物阿霉素和长春新碱更加敏感，与同样剂量的化疗药物共同培养，未转染的细胞没有明显变化，而转染后的细胞则明显凋亡。本发明提供的ZNRD基因的siRNA序列能够与ZNRD1的RNA结合，降低ZNRD1的表达；mU6pro-ZNRD1siRNA载体是一种能高度抑制ZNRD1蛋白表达的分子工具，相较于反义核酸对下调ZNRD1表达有显著地进步，为胃癌细胞MDR的逆转提供一种新的分子工具，为实现胃癌的基因治疗提供坚实的基础。
【附图说明】
图1是mU6pro载体质粒图谱。
图2是mU6pro-ZNRD1siRNA真核表达载体琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
图3是mU6pro-ZNRD1siRNA真核表达载体DNA测序图。
图4a是SGC7901/VCR-siRNA细胞的RT-PCR鉴定图，图4b是SGC7901/VCR-siRNA细胞的免疫印迹鉴定图。
图5是SRCA小鼠体内SGC7901/VCR-siRNA细胞对抗肿瘤药物的敏感性检测图；横坐标：ADR+，药物试验组；纵坐标：移植瘤体积(mm3)。
图6是流式细胞仪检测SGC7901/VCR-siRNA细胞内阿霉素的蓄积检测图；横坐标为阿霉素蓄积状态，纵坐标为流式细胞仪测量值。
图7是SGC7901/VCR-siRNA凋亡细胞DNA ladder琼脂糖凝胶电泳图。
图8是SGC7901/VCR-siRNA凋亡细胞Annexin/PI染色后流式细胞仪检测结果图。
【具体实施方式】
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明
1、克隆ZNRD1基因小干扰RNA(siRNA)序列
本发明根据GenBank提供的ZNRD1基因cDNA序列为模板，通过人工PCR设计合成发卡样ZNRD1小干扰RNA(siRNA)，克隆ZNRD1基因的siRNA的正向引物(forward primer)、反向引物(reverse primer)为：
F：ttgagccgca atctgccaac aacatctctt cagattgcgg ctcttttt
R：ctagaaaaag agccgcaatc tgaagagatg ttgttggcag attgcggct
反应体系为5μl的forward primer+5μl的reverse primer+2×缓冲液(Buffer)20μl+10μl的去离子水，95℃孵育4～5min后缓慢(约1.5～3h)降温至室温。反应条件：95℃预变性5分钟，30个循环(94℃变性30秒，56℃退火1分钟，72℃延伸1分钟)，72℃延伸10分钟。扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，按凝胶回收试剂盒说明书操作进行，获得的扩增的退火产物(引物对+siRNA)溶液-20℃保存备用。
2、构建mU6pro-ZNRD1siRNA真核表达载体
(1)mU6pro载体质粒酶切
mU6pro载体由美国密歇根大学的Turner教授惠赠，其多克隆位点分布如图1所示。mU6pro载体质粒酶切具体为：13μl mU6pro质粒+2μl的10×Buffer+1μl的限制性核酸内切酶Xba I+1μl的限制性核酸内切酶Bbs I+3μl的灭菌去离子水，37℃孵育5h。7％琼脂糖凝胶电泳，回收线性化载体约3320bp。
(2)以DL2000(DNA分子量标准物DL2000)将回收的线性化载体和siRNA扩增的退火产物(引物对+siRNA)定量。
(3)连接反应
siRNA退火产物与线性化载体的摩尔比为10∶1，反应体系为1μl的siRNA退火产物+1.6μl的线性化载体+0.5μl的T4ase(T4连接酶)+1μl的Buffer，16℃孵育12～16h。
(4)转化
将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，37℃培养12～18h。随机挑选数株单克隆菌落接种到约5ml的LB/Amp+培养基中，37℃剧烈摇菌培养过夜。
(5)mU6pro-ZNRD 1siRNA载体鉴定
单克隆菌落扩大培养后提取DNA并测序，构建的质粒命名为mU6pro-ZNRD1siRNA真核表达载体，引入mU6pro载体质粒的核苷酸是前引物+siRNA+后引物，即引物对+siRNA序列，其序列如SEQ ID NO.2所示，其插入的序列与设计的ZNRD1基因的小干扰RNA序列相符。
将mU6pro-ZNRD1siRNA真核表达载体和空载体mU6pro分别Xba I和Bbs I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定。如图2所示，泳道1为DNAmark，泳道2为mU6pro空载体双酶切，泳道3为mU6pro-ZNRD1siRNA表达载体双酶切；泳道3分别形成的400bp左右的DNA插入片段和ZNRD1的cDNA长度相同。如图3所示，载体的DNA测序结果，符合预期序列。
3、mU6pro-ZNRD1siRNA真核表达载体转染胃癌细胞
3.1脂质体法转染胃癌细胞
(1)将耐药胃癌细胞株SGC7901/VCR接种于6孔板中，待细胞生长到体积比80～90％时进行转染；
(2)以mU6pro空载体+PCDNA3.1载体作为空白对照，250μl无血清培养液RPMI1640(购自美国英杰生命技术公司)稀释mU6pro-ZNRD1siRNA载体+PCDNA3.1载体，和mU 6pro空载体+PCDNA3.1载体；
(3)250μl无血清RPMI 1640培养液稀释脂质体(LipofectamineTM 2000，购自美国Invitrogen公司)，室温放置5min；
(4)将稀释好的mU6pro-ZNRD1siRNA载体+PCDNA3.1载体和脂质体，mU6空载体+PCDNA3.1载体和脂质体，混匀室温放置20min；
(5)每孔加入无血清RPMI 1640培养液1.5ml，再加入载体和脂质体混悬液0.5ml；
(6)于37℃培养4～6h后换含10％胎牛血清(购自杭州四季青生物工程材料有限公司)的RPMI 1640培养液继续培养48～60h。
3.2转染细胞的鉴定
(1)蛋白浓度测定
取SGC7901/VCR-siRNA对数生长期的细胞，三去污裂解液裂解细胞，提取蛋白质，Bradford法测定蛋白浓度。
10ml的三去污裂解液配方如下：50mmol/L Tris-cl(pH 8.0)：0.07882g，150mmol/L NaCl：0.08775g，0.2g/L叠氮钠：0.002g，1g/LSDS 0.01g，100mg/L Aprotin 0.001g，10g/LNP-400.1g，5g/L去氧胆酸钠0.05g，100mg/L苯甲基磺酰氟(PMSF)0.001g。
总蛋白抽提程序：a、PBS磷酸缓冲液洗细胞3次；b、加入三去污裂解缓冲液(1.5x106个细胞大约加入100μL裂解液，或100ml细胞瓶中加入100μL裂解液)，冰上放置20min；c、收集裂解液；d、离心12000转/min，2～10min；e、吸取上清，用UV-2201紫外分光光度计(购自日本岛津公司)测定蛋白浓度，蛋白定量以保证实验样品的蛋白量相等，进行分装，保存在-80℃备用。
(2)反转录聚合酶连锁反应(RT-PCR)和免疫印迹实验(Western blot)进行鉴定
利用脂质体转染法将mU6pro-ZNRD1siRNA载体转染进耐药胃癌细胞系SGC7901/VCR，转染后将细胞1∶10传代同时培养液中加入G418(终浓度为1000μg/m)，每3-5天换一次含G418的培养液，待长出克隆后将其挑出扩大培养并进行RT-PCR和Western blot鉴定。
经过两个月的筛选后分别获得了1个稳定转染ZNRD1的小干扰RNA载体的细胞克隆SGC7901/VCR-siRNA及1个稳定转染对照空载体的细胞克隆SGC7901/VCR-mU6pro。RT-PCR和Western blot的结果分别如图4a、图4b所示；其中，泳道1：SGC7901/VCR细胞；泳道2：SGC7901/VCR-mU6pro细胞；泳道3：SGC7901/VCR-siRNA细胞。图4a、图4b显示，以β-actin作为对照，β-actin的表达在三个泳道没有明显变化，说明RT-PCR和Western blot的实验结果可信。如图4a所示，SGC7901/VCR-siRNA细胞中的ZNRD1的RNA水平比SGC7901/VCR细胞和SGC7901/VCR-mU6pro细胞明显下降，说明ZNRD1的小干扰RNA载体可以显著抑制胃癌细胞SGC7901/VCR中的ZNRD1表达。图4b从蛋白水平上说明，SGC7901/VCR-siRNA细胞中的ZNRD1的表达水平比SGC7901/VCR细胞和SGC7901/VCR-mU6pro细胞明显下降，ZNRD1的小干扰RNA载体可以显著抑制胃癌细胞SGC7901/VCR中的ZNRD1表达。以上说明mU6pro-ZNRD1siRNA真核表达成功表达，成功构建了低表达ZNRD1的SGC7901/VCR-siRNA胃癌细胞模型。
4、MTT法mU6pro-ZNRD1siRNA表达对胃癌细胞的体外药物敏感性的影响实验
4.1抗肿瘤药物选择
根据各种药物的血浆高峰浓度分别设置4个浓度梯度，如表1所示，实验中每种药物的每一浓度设4个复孔。
表1体外药物敏感性实验抗肿瘤药物浓度设置(μg/mL)
4.2实验步骤
(1)收获SGC7901/VCR-siRNA对数生长中期的细胞，按照每孔8×103个细胞/200μL接种入96孔板，置于细胞培养箱内培养过夜；
(2)加入不同浓度的抗肿瘤药物，继续培养3～4天；
(3)每孔加新鲜配制MTT溶液(5g/L)20μL，37℃继续培养4小时；
(4)吸弃孔内培养上清，每孔加入150μL的DMSO或异丙醇，振荡10min，使结晶物充分溶解；
(5)波长490nm，在ELISA仪上测各孔光吸收值，取每4个孔光吸收值的平均数，计算细胞的存活率：细胞存活率＝(实验组A值-空白对照组A值)/(阴性对照组A值-空白对照组A值)×100％；
(6)统计软件计算细胞对每种药物的IC50值，并进行显著性检验。
4.3mU6pro-ZNRD1siRNA表达对胃癌细胞的体外药物敏感性的影响
根据胃癌细胞对不同抗肿瘤药物的细胞存活率计算不同药物的IC50值，结果如表2所示，表中每组数据以“均数±标准差(x±s)”表示。
表2.胃癌细胞对抗肿瘤药物的敏感性(IC50值，μg/ml)
细胞模型 VCR ADR 5-Flu CDDP SGC7901/VCR 44.24±0.21 7.16±0.12 5.33±0.52 6.21±0.43 SGC7901/VCR-mU6 42.33±0.18 5.06±0.23 4.38±0.45 5.99±0.65 SGC7901/VCR -siRNA 12.17±0.22b 1.37±0.09b 2.41±0.16b 2.07±0.28b
b，p＜0.05vs SGC7901/VCR细胞和SGC7901/VCR-mU6细胞的IC50值
采用SPSS10.0软件对上述数据t检验，p＜0.05则被认为有显著差异。结果表明，SGC7901/VCR-siRNA细胞的IC50值比SGC7901/VCR细胞和SGC7901/VCR-mU6细胞的IC50值显著下降。这些结果说明，mU6pro-ZNRD1siRNA表达下调ZNRD1，显著增强了胃癌细胞SGC7901/VCR-siRNA对长春新碱(VCR)、阿霉素(ADR)，5-氟尿嘧啶(5-Flu)和顺铂(CDDP)的敏感性(p＜0.05)；而转染空载体的对照细胞则没有明显变化。
5.mU6pro-ZNRD1siRNA表达对胃癌细胞的体内外药物敏感性的影响实验
5.1正常免疫力小鼠(SRCA)体内药物敏感性实验
(1)制备纤维蛋白肿瘤细胞凝块
收获对数生长期SGC7901/VCR-siRNA细胞和对照细胞SGC7901/VCR-mU6，用PBS冲洗2次，细胞计数后离心1000rpm×5min，弃去上清。将纤维蛋白原溶液(按20mg/ml浓度溶于PBS中)和凝血酶溶液(200u/ml)按2∶1的体积比混均，加入细胞团中，加入量约占总体积的10％。将混合液置于37℃孵育5～10min，待形成纤维蛋白肿瘤细胞凝块后，在RPMI1640中将凝块切割成1mm3大小，置于容器中备用。
(2)小鼠肾包膜下肿瘤移植
小鼠称重后用戊巴比妥钠(70mg/kg)经腹腔麻醉或乙醚吸入麻醉。无菌条件下剖腹暴露肾脏，将纤维蛋白肿瘤细胞凝块小心置入肾包膜下，每侧置入2～3块。测量并记录瘤块的长径(L)和横径(W)。还纳肾脏，以无损伤缝线分别缝合腹膜和皮肤及皮下组织。
(3)于术后第一天尾静脉给药，阿霉素用量为60mg/m3体表面积。连续给药5天。于术后第6天处死动物，测量瘤块的大小(L和W)。
(4)药物敏感性分析，按下列公式计算：
V＝(LW2)/2； ΔTS＝V1-V2
ΔTS：用药前后移植瘤体积的变化率(mm3)；
V1：移植当天移植瘤的体积(mm3)；
V2：移植术后第6天移植瘤的体积(mm3)。
5.2mU6pro-ZNRD1siRNA表达对胃癌细胞的体内药物敏感性的影响
实验结果如图5所示，横坐标：ADR+，药物试验组；纵坐标：移植瘤体积(mm3)。mU6pro-ZNRD1siRNA表达下调ZNRD1，显著减少了移植瘤体积，说明显著增强了胃癌细胞的体内药物敏感性。
6、mU6pro-ZNRD1siRNA表达对细胞内药物蓄积的影响
6.1细胞膜药物转运实验：细胞内阿霉素蓄积和泵出的检测
(1)收获对数生长中期的SGC7901/VCR-siRNA和细胞，按照每孔105个细胞接种入6孔板中；
(2)培养过夜后，每孔加入(阿霉素)ADR至终浓度为5mg/L，继续培养1h；
(3)收获细胞用于ADR蓄积的检测，或换新鲜无药培养液继续培养1h后再收获细胞用于ADR潴留的检测，实验中以未加药物的细胞为阴性对照；
(4)以冷PBS洗涤细胞后，流式细胞仪检测细胞内的ADR荧光强度，检测的激发波长为488nm，接收波长为575nm；实验同时设置未接触药物的细胞为阴性对照。根据如下公式计算药物的泵出率：细胞药物泵出率＝(阿霉素的蓄积量-阿霉素的潴留量)/阿霉素的蓄积量，实验同时设置未加药物的细胞为阴性对照。
6.2mU6pro-ZNRD1siRNA表达对胃癌细胞的体内药物敏感性的影响
流式细胞仪检测胃癌细胞内阿霉素的蓄积，结果如图6所示，横坐标为阿霉素蓄积状态，纵坐标为流式细胞仪测量值。mU6pro-ZNRD1siRNA表达下调ZNRD1，显著增强了胃癌细胞的药物蓄积浓度。
7、mU6pro-ZNRD1siRNA表达对胃癌细胞的凋亡的影响
7.1凋亡细胞的DNA ladder(DNA梯度)的检测
(1)收获SGC7901/VCR-siRNA和对照细胞SGC7901/VCR-mU6对数生长期的细胞，接种于6孔板中；
(2)细胞贴壁后加入ADR，剂量为1.5ug/ml，37℃培养36h；
(3)细胞刮小心刮取细胞，PBS洗细胞2次，离心弃上清；
(4)提取细胞的DNA(按DNA ladder试剂盒说明书操作)；
(5)1.2％琼脂糖凝胶电泳。
7.2mU6pro-ZNRD1siRNA表达对胃癌细胞的凋亡的影响结果
结果如图7所示，泳道1：SGC7901/VCR-vector；泳道2：SGC7901/VCR-siRNA；泳道3：DNA marker。如泳道2所示，mU6pro-ZNRD1siRNA表达下调ZNRD1的SGC7901/VCR细胞出现凋亡条带，说明下调ZNRD1显著降低了胃癌细胞的抗凋亡能力。而转染空载体的细胞没有呈现凋亡变化，如泳道1所示。
7.3Annexin/PI染色法检测
(1)收获SGC7901/VCR-siRNA和对照细胞SGC7901/VCR-mU6对数生长期的细胞，接种于6孔板中；
(2)细胞贴壁后加入ADR，剂量为1.5μg/ml，37℃培养36h；
(3)加入5μl的Annexin V-FITC于含1.5mmol CaCl2的细胞培养液中，37℃孵育10min；
(4)收集细胞前用含1.5mmol CaCl2的细胞培养液洗涤2次；
(5)橡皮细胞刮小心刮取并收集细胞，加490μl的结合缓冲液重悬细胞；加入5μl的PI染液，轻轻混悬，4℃孵育10min；流式细胞仪FCM分析。
7.4mU6pro-ZNRD1siRNA表达对胃癌细胞的凋亡的影响结果
结果如图8所示，第一象限为机械损伤细胞区，第二象限为继发性坏死和晚期凋亡细胞区，第三象限为活细胞区，第四象限为凋亡细胞区；图8a：SGC7901/VCR空载体；图8b：SGC7901/VCR-siRNA；可以明显看出图8b第四象限所表达的凋亡细胞明显增多，说明mU6pro-ZNRD1siRNA表达下调ZNRD1降低了胃癌细胞的抗凋亡能力。
核苷酸序列表
<110>中国人民解放军第四军医大学
<120>ZNRD1基因的小干扰RNA序列及其真核表达载体
<160>2
<210>1
<211>381
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
atgtctgtca tggacctcgc caatacttgc tccagctttc agtcggacct ggatttctgt 60
tcagattgcg gctcggtcct gcctctgccc ggggctcagg atacggtcac ctgtattcgc 120
tgtggcttca acatcaacgt tcgggacttt gaggggaagg ttgtgaagac ttcggttgtg 180
ttccaccaac tggggacagc catgcctatg tcggtggagg aagggcctga gtgccaggga 240
cctgtggttg acaggcgctg ccctcgatgt ggtcatgaag gaatggcata ccacaccaga 300
cagatgcgtt cagccgatga agggcaaact gtcttctaca cctgtaccaa ctgcaagttc 360
caggagaagg aagactctta a 381
<210>2
<211>478
<212>DNA
<213>人工合成
<400>2
ttgagccgca atctgccaac aacatctctt cagattgcgg ctctttttat gtctgtcatg 60
gacctcgcca atacttgctc cagctttcag tcggacctgg atttctgttc agattgcggc 120
tcggtcctgc ctctgcccgg ggctcaggat acggtcacct gtattcgctg tggcttcaac 180
atcaacgttc gggactttga ggggaaggtt gtgaagactt cggttgtgtt ccaccaactg 240
gggacagcca tgcctatgtc ggtggaggaa gggcctgagt gccagggacc tgtggttgac 300
aggcgctgcc ctcgatgtgg tcatgaagga atggcatacc acaccagaca gatgcgttca 360
gccgatgaag ggcaaactgt cttctacacc tgtaccaact gcaagttcca ggagaaggaa 420
gactcttaac tagaaaaaga gccgcaatct gaagagatgt tgttggcaga ttgcggct 478