一种活菌种诱变非真空离子注入方法 【技术领域】
人工射线菌种诱变，活菌种诱变非真空离子注入方法。
背景技术
目前，辐射菌种诱变包括伽玛射线辐照菌种诱变、电子射线辐照菌种诱变、微波辐照菌种诱变、X射线辐照菌种诱变、紫外光照射菌种诱变、中子辐照菌种诱变、离子注入菌种孢子诱变和太空航天菌种诱变等。快中子辐照这种射线，属于非带电粒子，伽玛射线和快中子的穿透力都非常强，它们很少停留在菌种内部，只是对菌种的组织，及细胞内的DNA造成辐射损伤产生少量变异。电子射线辐照、微波辐照、X射线辐照、紫外光照射特点均是无静止质量，其射线辐照在菌种内无质量停留，只是对菌种的组织造成辐射损伤和电离损伤，产生遗传性变异几率比较低。航天菌种诱变，是利用太空的宇宙射线(多种带电粒子及伽玛射、中子等)及微重力等综合因素，菌种在适当的太空条件下会产生变异，可选育培养出新菌种。但是，航天菌种诱变成本太高，是陆地辐射育种成本的上千倍；再有航天菌种诱变存在许多不确定性，由于宇宙风和太阳黑子的随机性，菌种接受宇宙射线的剂量难以控制，何种射线或带电粒子引起的变异，很难测定，不确定性的因素使航天菌种诱变的效果难以重复。科学界提出新的研究方法：分别应用各种带电粒子，以不同的能量、不同的剂量对菌种进行辐射注入，离子注入既有辐射损伤变异，又有质量沉积参加DNA分子链的断裂重组，这可使菌种产生永久性变异，从中选出人类感兴趣的特性品种。研究自然界生命产生及生物进化，追逆到原始大气由于雷电、火山爆发、地壳放射性元素的衰变，可产生各种能量的运动离子或粒子，如C+离子注入水，可形成甲酸、乙酸，N+离子注入水可形成氨水，而C+离子注入氨水可形成三种氨基酸。实验证明，N、C、H、O、O2-、CO、CO2、CH4等离子、粒子注入水可形成丰富有机分子；离子注入在生命化学起源中发挥了重要作用。
离子束作为一种新技术应用于生物菌种改良的研究是由我国科学家在上世纪八十年代开创的。离子束具有质量、能量双重诱变效应的特征不同于以往的射线辐射，离子注入引发的生物效应，既有能量沉积，动量传递；又有元素质量沉积。离子注入与γ射线、X射线束、微波、紫外光明显不同。注入离子与生物体作用，首先有能量的沉积，即注入离子与生物大分子发生一系列碰撞，生物大分子获得能量时，生物基因键断裂，DNA分子击出原位，留下断键或缺陷；注入元素有一定几率同基因断键或DNA被打出的缺位相结合，伴随各种元素的生化反应，产生基因突变和DNA及染色体变异；离子注入有机分子，只要实验系统中有氮参与，都有一定的几率形成带有氨基的有机分子，有一定几率形成氨基酸；注入离子和靶细胞的电荷交换，可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和膜电位的改良；离子束打入生物体产生的Braag峰，具有较强的电离作用，还能产生活性高的自由基间接损伤作用，因此它对生物体的作用可导致较高的突变率；另外由于注入离子的不同电荷数、质量数、能量、剂量的组合，提供了众多的诱变条件，通过这种电、能、质的联合作用，将强烈影响生物细胞的生理生化特性，以引起基因突变，所以变异幅度大，有较高的突变率，较广的突变谱；再者突变体的遗传性能比较稳定，回复突变率低。
离子束生物工程，就是将人们希望的离子注入到遗传物质上，使原子分子移位、重排，最终按化学反应规律重组DNA分子结构；或者，利用离子束加工细胞，在细胞壁形成可修复的小孔，改变细胞内孔底电位，促进外源基因(组)转入细胞，实现在新的背景条件下的遗传转化。从细胞和分子层次上建立模型研究离子与生物体相互作用不仅为离子束在遗传改良上的应用奠定基础，而且在评价环境剂量辐射的危害性和模拟原始地球环境运动离子在生命起源中的作用具有重要的意义。
现代科学技术控制带电粒子——离子进行辐照，其能量、剂量、束流强度、真空度均可以重复，菌种诱变辐照条件完全人为可控制，这是离子注入菌种诱变优于航天育种的方面。北京师范大学核科学与技术学院的科研人员，从上世纪80年代起，始终在这个领域里进行科学研究。我们先后对青霉素菌种孢子、链霉素菌种孢子菌种，进行氮离子注入或者碳离子注入实验。华北制药、鲁抗制药几个药厂先后投入离子注入变异菌种取得明显增产效果。二十世纪四十年代，生产青霉每毫升发酵液，只产生约20单位的青霉素，通过透变育种和其它措施配合，目前的发酵单位已比原来提高了三四十倍，达到每毫升5万～10万单位。菌种的离子注入实验很复杂，因为离子注入机真空室不能有水分进入，否则难以抽真空。鲜活生长状态的菌群含有大量水分，不能直接进入真空室，只有将菌种培养出孢子干燥后才能进入真空室进行离子注入，由于孢子的生命活度低，青霉菌或放线菌地孢子一般都处于休眠状态，处于休眠状态的孢子离子注入后变异，不如处在萌发状态的菌种孢子被离子注入诱变效率高。这是活菌种诱变非真空离子注入方法设计思想产生的原因。
【发明内容】
一种活菌诱变非真空离子注入方法，其特征在于采用高能量离子注入机，应用高能量离子束流，穿过钛、不锈钢制成的隔真空透离子窗，在离子注入机真空系统外得到离子束流，用此离子束流穿透一个有机薄膜隔菌窗窗口进入菌种培养箱，在菌种培养箱内控制温度、湿度、可调气氛促使离子注入前菌种孢子萌发；然后，将承载着正在萌发生长的菌种孢子的培养皿放置在靶位上进行离子注入，正在萌发生长菌种孢子受到离子的轰击在其内部发生基因断裂、DNA重组现象，以诱发活菌种变异，改变微生物菌种生长特性；微生物科学家可以在这些变异中，筛选出具有优良变异特性的菌种；其中，离子注入离子能量为：1兆电子伏特-1000兆电子伏特；其中，菌种接受离子注入计量为：102-1017离子/平方厘米；其中，离子注入非金属离子选自：H、N、C、O、P、S、B、I、Si、Se元素；其中，离子注入金属离子选自：K、Ca、Na、Mg、Sr、Mn、Zn、Fe、Cr、Cu、Ge元素。
【具体实施方式】
活菌诱变非真空离子注入方法，首先要具备一台可以引出粒子束流的离子注入机，能量在1兆电子伏特以上。离子束流被引出真空室以后，离子遇到空气能量损失非常快，菌种培养箱的离子入射口，应紧贴加速器的离子出口，将需要离子注入放在培养皿中正在萌发的菌种，放置在培养箱内离子束入射口的靶位上开始离子注入，当注入计量达到实验设定的注入计量时停止离子注入，更换被注入菌种样品培养皿。菌种培养箱的温度、湿度应依据菌种孢子萌发的条件设定。离子注入菌种孢子萌发时机的十分重要，菌种孢子在刚刚萌动时受外界刺激：离子冲击、电离辐射、特殊设定元素的质量沉积，会产生敏感快速的基因突变、DNA断裂重组、促使菌种生长发育产生明显变异。
菌落诱发的突变率和离子注入剂量直接有关，它能产生电离作用，直接和间接改变DNA结构。直接的效应是导致碱基的化学键、脱氧核糖的化学键、糖-磷酸相连接的化学键的断裂；间接的效应是电离辐射使水和有机分子产生自由基，自由基作用于DNA分子，特别是对嘧啶的作用更强，可引起缺失和损伤，造成基因突变，还能引起染色体断裂，引起倒位、缺失和易位等畸变。离子辐照射剂量102-1017离子/平方厘米，或者采用能使微生物产生(30％～70％)的剂量死亡率的剂量。离子注入的电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，离子注入的质量沉积是造成基因突变又一重要因素。要确定一个合适的剂量，通常要进行多次试验。诱变效应的研究结果，发现正变较多地出现在偏低的剂量中，而负变则较多地出现于偏高的剂量中，还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，更容易出现负变。因此，在诱变育种工作中，目前比较倾向于采用较低的剂量。
出发菌种是指用于诱变的原始菌种。出发菌种可以是从自然界的土样或水样中分离出来的野生型菌种；也可以是生产中正在使用的菌种；还可以从菌种保藏机构中获得。选择的原则是菌种要对诱变剂的敏感性强、变异幅度大、产量高。
分离和筛选经过中间培养，分离出大量的较纯的单个菌落，接着，要从几千万个菌落中筛选出几个好的，即筛选出所谓性能良好的正突变菌株，这将要花费大量的人力和物力。怎样设计才能花费较少的工作量达到最好的效果，这是筛选工作中的一条原则。一般采用一些方法加以简化，如利用形态突变直接淘汰低产变异菌株，或利用平皿反应直接挑取高产变异菌株等。平皿反应是指每个变异菌落产生的代谢产物与培养基内的指示物在培养基平板上作用后表现出一定的生理效应，如变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈等，这些效应的大小表示变异菌株生产活力的高低，以此作为筛选的标志。常用的方法有纸片培养显色法、透明圈法、琼脂块培养法等。
菌种经诱变处理后，会产生各种各样的突变类型。如何从中挑选出所需要的突变类型呢？一般要经过初筛和复筛两个阶段。下面以青霉素产生菌高产突变菌种的筛选为例说明。将经诱变处理的菌液按一定浓度稀释后，涂布在平板培养基上。培养后，将单个菌落挑到斜面培养基上，经培养后，再将斜面上的菌落逐个接种到摇瓶中，振荡培养后测它们的抗生素效价。这就是初筛。初筛中所得到的超过对照效价10％以上的菌种，再进行复筛。复筛的过程与初筛基本相同，不同的是一般将斜面上的单个菌落接种到三个摇瓶中，得出平均效价。复筛可进行1～3次。由此筛选出的高产稳定菌种还要经过小型甚至中型试验，才能用到发酵生产中。