乳杆菌和双歧杆菌DGGE Marker在菌群监测中的应用 【技术领域】
本发明涉及一种菌群监测中的应用，尤其涉及一种乳杆菌和双歧杆菌DGGEMarker在菌群监测中的应用。
背景技术
肠道微生物区系在哺乳动物健康和疾病中具有多重作用，具有促进营养的消化吸收，诱导粘膜免疫保护，甚至调节宿主脂肪的储存等功能。获得发挥上述功能的微生物学信息，有助于揭示特定生理条件下的肠道微生物区系的遗传多样性和研究其生理功能、监测其动态性变化。目前，只有少部分微生物能够被分离培养，若以这部分的微生物来代表肠道中复杂的微生物菌群将导致极大的偏差。因此，用传统的微生物培养和生化鉴定方法不足获得微环境中的真实情况。16S rDNA指纹图谱技术——变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient GelElectrophoresis，DGGE)可以直接利用细菌rDNA或者rRNA对细菌进行表征，不但避免了传统方法中耗时的菌种分离，而且可以鉴定出无法利用传统方法分离出的菌种。
DGGE技术可以直观、快速地呈现肠道微生物区系的结构和多样性，因此在复杂的肠道微生物区系研究中迅速得到了应用。Zoetendal et al应用基于16SrDNA的DGGE技术结合相似性指数分析阐明了人肠道粘膜上的优势菌群存在着宿主特异性，并且在整个结肠呈均匀分布，与粪便微生物区系无显著性差异，这一结果暗示了宿主相关性因子决定了肠道微生物区系菌群结构。结合16SrDNA属特异性引物对成人肠道微生物区系进行DGGE分析表明，拟杆菌属和双歧杆菌属的优势菌群在短期内(3个月)是相对稳定的，而乳杆菌属的菌群在2周内发生了明显的变化甚至完全消失。此外，基于16S rDNA的DGGE技术也被用于分析益生菌活菌制剂在胃肠道中的驻留，以阐明相应益生菌的粘附特性。
DGGE技术虽然可以很好地监测总细菌菌群的变化，但是它是一种半定量技术，如果想获得具体细菌的动态变化情况，则需对特征性的片断进行割胶回收、测序，耗费大量的时间和经费。目前，已有商品化的DGGE Marker出售，根据用途不同可分为细菌DGGE Marker、真菌DGGE Marker和线虫DGGEMarker，其作用主要是用来判断DGGE图谱中对应条带分子量的大致范围和判断条带在DGGE图谱上是否可以均匀分布，但它并不能判断其对应条带具体属于哪个菌属。我们制备的乳杆菌、双歧杆菌DGGE Marker不但具备上述DGGEMarker的功能，而且还可以直接指示我们需要研究的乳杆菌、双歧杆菌的存在，这在国内尚属首创。乳杆菌、双歧杆菌DGGE Marker制备的成功，为DGGE技术在微生物生态学领域的应用提供了新思路。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种乳杆菌和双歧杆菌DGGE Marker在菌群监测中的应用，该DGGE Marker可以准确指示所需研究的标准菌株在总菌中的存在与否，使用方便快捷、准确且重复性好。
本发明是这样来实现的，其特征是乳杆菌DGGE Marker对乳杆菌属标准菌株的指示作用：采用DGGE技术对制得的乳杆菌DGGE Marker和V3区通用DGGEMarker进行验证，乳杆菌特异性引物扩增的DGGE Marker呈现4条优势条带，可分别与4株乳杆菌标准菌株优势条带对应，即可以指示标准乳杆菌的存在，V3通用引物扩增的DGGE Marker呈现5条优势条带，除可以指示4株标准乳杆菌外，尚可以指示嗜热链球菌的存在。这说明，可以根据实际需要采用乳杆菌特异性引物或者V3区通用引物来监测目标菌株的存在与否。
本发明的双歧杆菌DGGE Marker对双歧杆菌属标准菌株的指示作用：采用DGGE技术对制得的双歧杆菌DGGE Marker和V3区通用DGGE Marker进行验证，双歧杆菌特异性引物扩增的DGGE Marker呈现3条优势条带，可与5株双歧杆菌标准菌株优势条带对应(长双歧设置3个重复，优势条带在同一位置)，即可以指示标准双歧杆菌的存在，且设置的3个长双歧重复性好；V3通用引物扩增的DGGE Marker呈现3条优势条带，可与5株双歧杆菌标准菌株优势条带对应(长双歧设置3个重复，优势条带在同一位置)，即可以指示标准双歧杆菌的存在，且设置的3个长双歧重复性好。这说明无论是双歧杆菌特异性引物扩增得到的DGGE Marker，还是V3区通用引物扩增得到的DGGE Marker，均可用来指示双歧杆菌标准菌株的存在。
本发明所述的乳杆菌和双歧杆菌的DGGE Marker的制备方法为：将所需要监测的乳杆菌、双歧杆菌标准菌株分别在MRS液体培养基中37℃、厌氧培养20小时，每个标准菌株分别取400微升混合到一起，提取细菌混合样的DNA，用乳杆菌和双歧杆菌特异性引物进行PCR扩增，得到的PCR产物即为制得地乳杆菌和双歧杆菌的DGGE Marker。
本发明的优点是：制备的DGGE Marker可以根据实际需要制成菌属特异性指示Marker或者针对所有细菌的V3区通用Marker，方便、快捷、经济地追踪所需监测菌的动态变化；此外，上述Marker还可用于判断胶制备的好坏或者PCR产物质量的好坏。
【具体实施方式】
实施例1：
1.将10株乳杆菌、双歧杆菌标准菌株接种于MRS液体肉汤中于37℃、厌氧条件下培养24小时。
2.以上每种菌液各取1mL提取基因组DNA；为制备具有指示功能的DGGEMarker，每种菌各1mL混合，提取基因组DNA，分别制备乳杆菌和双歧杆菌特异性或通用性DGGE Marker。
3.向2mL离心管中加入700μL的裂解缓冲液[500mM NaCl，50mMTris-HCl，pH 8.0，50mM EDTA，4％SDS]，300μL酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1，Promega)和0.4g玻璃珠(0.35g/0.1mm，0.05g/0.5mm)，混匀，并将离心管置于涡旋振荡器上振荡10min，20000×g离心5min后，向上清液中加入150μL 10M乙酸铵，DNA随即使用两次酚/氯仿/异戊醇提取和一次氯仿提取，异丙醇沉淀，70％乙醇洗涤，风干后，加入100μL TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)溶解DNA沉淀，加入2μlRNase(10mg/ml)在37℃孵育15min。
4.扩增16S rDNA V3区引物为357 f(5′-GC clamp-TACGGGAGGCAGCAG-3′)，519 r(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)；16S rDNA乳杆菌引物lac1(5′-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3′)，lac2(5′-GC clamp-ATTYCACCGCTACACATG-3′)；16S rDNA双歧菌引物为Bifid F(5′-CTCCTGGAAACGGGTGG-3′)，Bifid R-GC(5′-GC clamp-GGTGTTCTTCCCGATATCTACA-3′)。扩增体系(50μL：包括100ng DNA模板，1×EXTaq buffer，200μM dNTP，200nM各引物，1.5mMMgCl2，670ng/μL BSA，1.25U EX Taq DNA聚合酶)参照Muyzer等方法(GC clamp sequence：CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG)。反应条件：94℃，5min；9，℃ 30s；56℃，30s；72℃，1min，30个循环；72℃，7min。
5.使用8％聚丙烯酰胺凝胶，35％～65％[100％变性梯度包含40％(v/v)甲酰胺和7M尿素]变形梯度。电泳采用DCodeTM Universal MutationDetection System(变性梯度凝胶电泳仪，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)，首先在220V电压下预电泳10min，随后在85V的固定电压下电泳16h。电泳结束后，进行硝酸银染色。
实施例2：利用DGGE Marker监测酸奶中嗜热链球菌、双歧杆菌、乳杆菌：
1.将嗜热链球菌、双歧杆菌、乳杆菌标准菌株接种于MRS培养液中，于37℃培养16-20h，使活菌数达到最大。
2.按实施例1中的方法制备嗜热链球菌、双歧杆菌、乳杆菌特异性和通用性DGGE Marker。
3.按实施例1中的方法提取酸奶中所有菌的DNA，利用通用引物和菌属特性引物扩增DNA，将得到的PCR产物进行DGGE电泳。
4.如DGGE Marker优势条带在DGGE胶上与酸奶中细菌有对应条带，说明酸奶中包含该菌；如无对应条带，说明酸奶中无该菌存在。
实施例3：利用DGGE Marker监测发酵乳制品中酵母菌、乳杆菌：
1.按实施例1中的方法培养发酵乳制品中存在的酵母菌、乳杆菌标准菌株
2.按实施例1中的方法制备酵母菌、乳杆菌特异性和通用性DGGE Marker。
3.按实施例1中的方法提取发酵乳中所有菌的DNA，利用通用引物和菌属特异性引物扩增DNA，将得到的PCR产物进行DGGE电泳。
4.如DGGE Marker优势条带在DGGE胶上与发酵乳中微生物有对应条带，说发酵乳制品中包含该菌；如无对应条带，说明发酵乳制品中无该菌存在。
实施例4：利用DGGE Marker监测肉制品中乳杆菌、微球菌、葡萄球菌：
1按实施例1中的方法培养肉制品中存在的乳杆菌、微球菌、葡萄球菌标准菌株
2按实施例1中的方法制备乳杆菌、微球菌、葡萄球菌特异性和通用性DGGEMarker。
3按实施例1中的方法提取肉制品中所有菌的DNA，利用通用引物和菌属特异性引物扩增DNA，将得到的PCR产物进行DGGE电泳。
4如DGGE Marker优势条带在DGGE胶上与肉制品中细菌有对应条带，说明肉制品中包含该菌；如无对应条带，说明肉制品中无该菌存在。
实施例5：利用DGGE Marker监测泡菜中乳杆菌、酵母菌、霉菌：
1按实施例1中的方法培养泡菜中存在的乳杆菌、酵母菌、霉菌标准菌株
2按实施例1中的方法制备乳杆菌、酵母菌、霉菌特异性和通用性DGGEMarker。
3按实施例1中的方法提取泡菜中所有菌的DNA，利用通用引物和菌属特异性引物扩增DNA，将得到的PCR产物进行DGGE电泳。
4如DGGE Marker优势条带在DGGE胶上与泡菜中微生物有对应条带，说明泡菜中包含该菌；如无对应条带，说明泡菜中无该菌存在。