一种HBV病毒RTN236T突变的荧光扩增检测试剂盒.pdf

本发明涉及一种HBV病毒rtN236T突变的荧光扩增检测试剂盒。本发明针对rtN236T变异(即236AAC/T→ACC/T突变)设计了一对引物和分别用两种荧光染料标记的一对特异性探针，在单管内使用双色荧光定量PCR技术实现了分别对野生株(rt236N)和突变株(rt236T)HBV?DNA进行荧光扩增检测。本发明技术能快速的对HBV?DNA?rt236N和rt236T同时进行定性检测。

1.  一种HBV病毒rtN236T突变的荧光扩增检测试剂盒，其特征在于包含一对特异性引物和一对特异性探针，扩增目标片段长度为132bp，引物序列为：
引物1：5`-GTACAACATCTTGAGTCCCTTTT-3`(Seq No.1)
引物2：5`-CCAACTTCCAATTACATATCCC-3`(Seq No.2)
或者上述引物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。
设计的两条探针方向相反，除突变检测位点和3’端外(突变检测位点序列可互补，也可不互补，根据检测要求决定)其余区域基本互补；探针1和探针2的Tm值相近，同时也与两条引物的Tm值相近(相互间的差异均小于3℃)，两条探针的3’端除互补序列外均延伸2-4个碱基；探针1与rt236T基因序列互补，探针2与rt236N基因序列互补，分别用于检测变异株(rt236T)和野生株(rt236N)，探针序列为：
探针1：5`-CATACATTTGACTCCTAACAAAACC-3`(Seq No.3)
探针2：5`-TTGTTAGGGTTTAAATGTATGCC-3`(Seq No.4)
或者上述引物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。

2.  根据权利要求1所述的HBV病毒rtN236T突变的荧光扩增检测试剂盒，其特征在于标记探针的荧光发光基团可为FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、 Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange、或ROX中的任意两种组合；荧光淬灭基团为DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的任意一种或一种以上的组合。

3.  根据权利要求1所述的HBV病毒rtN236T突变的荧光扩增检测试剂盒，其特征在于采用多色荧光PCR检测技术，在一个反应管内同时对rt236N和rt236T突变的HBV DNA进行定性检测。

4.  根据权利要求1所述的HBV病毒rtN236T突变的荧光扩增检测试剂盒，其特征在于，PCR反应体系包括10mM Tris-HCl(PH 8.3)、50mM KCl、300μM d(AGC)TP、300μM dUTP、5mM MgCl₂、200nM引物1、200nM引物2、200nM探针1、1U Taq酶、0.05U UNG酶。
根据权利要求1所述的HBV病毒rtN236T突变的荧光扩增检测试剂盒，其特征在于，可以按如下程序进行实时荧光PCR检测：反应管先在50℃反应2分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→60℃35秒循环40次(60℃退火条件下同时采集相应探针标记通道的荧光)。

一种HBV病毒rtN236T突变的荧光扩增检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种快速而且方便的HBV病毒rtN236T突变的双色荧光PCR扩增检测试剂盒。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)流行世界各地，估计全球有20亿人感染，其中慢性感染者3.5亿，我国约占半数，全球每年约有120万人死于HBV感染。此种感染最终可发展为肝硬化、肝癌，是当前WHO公布的人类疾病死亡原因中居第9位的疾病。因此针对HBV的抗病毒治疗受到广泛重视。随着对HBV聚合酶的结构和功能的深入认识，一些有效抑制HBV DNA复制的核苷类药物(如：拉米夫定LAM、阿德福韦ADV)逐步成为抗HBV治疗的新选择。由于HBV聚合酶如同其他逆转录病毒的逆转录酶一样具有较高的错配倾向且缺乏校对能力，因此随着感染的持续病毒准种逐年增多，在核苷类药物的选择压力下，耐药变异株将逐渐增多，最终替代野生株成为优势株，从而导致临床耐药现象的出现。
拉米夫定是L-核苷类似物，曾经是治疗乙型肝炎的最有效的药物，已在全球广泛使用，在中国已成为销量最大的处方药。但拉米夫定的药发生率非常高，在治疗1年时，耐药发生率约为14％～32％，治疗时间延长耐药发生率升高，治疗5年时耐药发生率达到60％～70％。而阿德福韦耐药变异位点集中于P基因D区rtN236T和(或)B区rtN236T，与拉米夫定无交叉耐药现象。阿德福韦耐药发生率相对拉米夫定耐药要低得多，阿德福韦治疗HBeAg阴性慢性乙肝的III期临床试验结果显示，治疗1、2、3、4、5年时累积的基因型耐药发生率约为0、3％、11％、18％和29％。因此，阿德福韦已越来越多的被应用于HBV的抗病毒治疗中，通常与其他药物进行联合用药。
目前，国内外尚无快速、灵敏的检测阿德福韦耐药突变的技术和产品，通常使用基因测序的方法进行突变检测，但一方面，测序反应灵敏度低导致假阴性率较高。另一方面，由于HBV耐药株与敏感株常共存于患者血清中，对于HBV耐药突变基因的检测，该方法有致命的缺陷。椐了解，当耐药株低于50％时，随耐药毒株比例的下降，基因测序的假阴性率迅猛增高，通常不能对低于20％的突变基因进行检测。
国内外，均有人使用ntPCR-RFLP的技术对rtN236T位点突变进行检测，但该技术操作复杂、耗时长且价格昂贵又容易造成PCR产物污染，无法进行推广和临床应用。
TaqMan PCR技术作为一种快速诊断技术，具有特异性高、灵敏度高、操作简便且价格较便宜等优点，已在科研和临床上得到广泛的应用。使用特异性探针杂交的方法结合常规TaqMan技术进行rt236基因突变检测设计，由于rt236位点附近为非保守区，多个位点存在非耐药性变异，因此，TaqMan PCR技术容易导致假阳性率或假阴性率的发生，同时也不利于设计引物或探针，并且与测序技术一样无法对病毒的共生关系进行准确判断。
本发明对传统TaqMan PCR技术进行了巧妙改进，不仅可对rt236T变异的病毒DNA进行定性分析，同时，在同一个PCR管内完成了rt236N野生株的定性检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、简便的HBV病毒rtN236T突变的荧光PCR扩增检测试剂盒。
1、为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：使用一对特异性引物和一对特异性探针，扩增目标片段长度为132bp，引物序列为：
引物1：5`-GTACAACATCTTGAGTCCCTTTT-3`   (Seq No.1)
引物2：5`-CCAACTTCCAATTACATATCCC-3`    (Seq No.2)
或者上述引物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。
设计的两条探针方向相反，除突变检测位点和3’端外(突变检测位点序列可互补，也可不互补，根据检测要求决定)其余区域互补；探针1和探针2的Tm值相近，同时也与两条引物的Tm值相近(相互间的差异均小于3℃)，两条探针的3’端除互补序列外均延伸2-4个碱基；根据T与G可形成2价离子键而配对的原理，在用于突变型基因检测的正向探针(探针1)此处设计成“ACT”，而用于突变病毒检测的反向探针(探针2)设计成“GTT”。探针1与rt236T基因序列互补，探针2与rt236N基因序列互补，分别用于检测变异株(rt236T)和野生株(rt236N)，探针序列为：
探针1：5`-CATACATTTGACTCCTAACAAAACC-3`  (Seq No.3)
探针2：5`-TTGTTAGGGTTTAAATGTATGCC-3`    (Seq No.4)
或者上述引物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。
上述的HBV病毒rtN236T突变的荧光定量PCR扩增检测试剂盒，探针的荧光发光基团为可标记为FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange、或ROX中的任意两种组合；荧光淬灭基团为DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的任意一种或一种以上的组合。
上述的HBV病毒rtN236T突变的荧光定量PCR扩增检测试剂盒，采用多色荧光PCR检测技术，在一个反应管内同时对rt236N和rt236T突变的HBVDNA进行定性检测。
2、上述的HBV病毒rtN236T突变的荧光定量PCR扩增检测试剂盒，PCR反应组成成份包括10mM Tris-HCl(PH 8.3)、50mM KCl、300μM d(AGC)TP、300μM dUTP、5mM MgCl₂、200nM引物1、200nM引物2、200nM探针1和200nM探针2、1U Taq酶、0.05U UNG酶。按如下程序进行实时荧光PCR检测；反应管先在50℃反应2分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→60℃35秒循环40次(60℃退火条件下同时采集相应探针标记通道的荧光)。
本发明与现有HBV病毒DNA rtN236T突变检测方法及传统的TaqMan技术相比，具有以下有益的技术效果：
(1)与传统的TaqMan技术相比：缩短探针的长度，使Tm值下降至与引物相近，以增强探针对突变位点的特异性，同时保证了灵敏性。传统的TaqMan技术要求探针的Tm值相对引物高6-10℃，是为了保证探针比引物优先与模板退火杂交，以防止引物快速延伸至探针结合部位而阻止探针的结合，从而降低灵敏度，但这种设计使得探针对模板的选择特异性较低，根本不能鉴别单个碱基的突变。本发明通过探针浓度的调节保证了较高的灵敏度，可实现对1000copies/ml的突变DNA进行检测，另外，本发明设计的两条探针为反向序列，分别与模板的正反链结合，不存在竞争关系，不会降低灵敏度。由于探针的Tm值与引物相近，通过优化退火温度和提高反应条件的特异性，探针能与完全配对的模板进行杂交，通过引物的延伸的酶切产生荧光扩增信号，而不能与发生变异的模板杂交，从而不产生荧光扩增信号。
(2)与其他技术相比：本发明在一个反应管内实行了全部的检测，从HBV病毒核酸提取到检测完毕，仅需要2个小时，操作非常简单，且产物不开盖，不会发生PCR产物的污染。并且本发明通过设计人工模板制作标准曲线，可以对突变病毒的核酸进行定量分析，ntPCR-RFLP和测序技术均不能得到定量的结果。另外，本发明同时完成rt236位点两种基因类型的检测。本发明提供一种准确快速对HBV病毒rtN236T突变进行荧光定量检测的技术。同时本发明还可用于其他基因突变的检测。
具体实施方式
设计和制备引物、探针序列(针对HBV DNA P基因相关序列设计，GeneBank序列号为AF182802，下同)：
引物1：5`-GTACAACATCTTGAGTCCCTTTT-3`          (Seq No.1)
引物2：5`-CCAACTTCCAATTACATATCCC-3`           (Seq No.2)
探针1：5`FAM-CATACATTTGACTCCTAACAAAACC-BHQ1-3`(Seq No.3)
探针2：5`TET-TTGTTAGGGTTTAAATGTATGCC-BHQ1-3`  (Seq No.4)
上述引物和探针均在宝生物工程(大连)有限公司合成。
HBV病毒rtN236T突变的荧光扩增检测试剂盒的组成为(20人份)：
组成成份名称       体积
提取液A            1ml
提取液B            1ml
PCR反应缓冲液      460μl
PCR反应酶          40μl
阳性对照品1        50μl
阳性对照品2        50μl
阴性对照品         50μl
其中，PCR反应缓冲液(使用终浓度)包括：10mM Tris-HCl(PH 8.3)、50mM KCl、300μM d(AGC)TP、300μM dUTP、5mM MgCl₂、200nM引物1、200nM引物2、200nM探针1和200nM探针2；PCR反应酶(终浓度)包括：1U Taq酶、0.05U UNG酶；阳性对照品1为rt236T突变型HBV DNA 临床血清，阳性对照品2为rt236N野生型HBV DNA 临床血清，阴性对照品为HBV DNA阴性的血清。
试剂盒的操作步骤如下：
(1)病毒核酸提取
取待测血清样本及阳性和阴性对照品各50μl，加入50μl核酸提取液A。振荡混匀15s。13,000rpm离心10min，弃上清。加入充分混匀的核酸提取液B 50μl，振荡混匀，100℃水浴10min，13,000rpm离心3min。取上清供PCR扩增用。
(2)荧光PCR反应液的配制：
按每人份PCR反应缓冲液23ul、PCR反应酶2ul的配方配制PCR反应液，并按25ul/管分装到0.2ml PCR管中，然后加入5ul待检的核酸提取产物，按如下程序进行实时荧光PCR检测：反应管先在50℃反应2分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→60℃35秒循环40次(60℃退火条件下同时采集FAM和TET通道荧光)。
(3)质量监控与结果分析：