白介素15受体-白介素2复合物扩增淋巴细胞的方法 【技术领域】
本发明属于免疫学领域，具体是指使用白介素2，白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物扩增自然杀伤细胞(NK)和CD8淋巴细胞。
技术背景
以前的研究表明白介素2和白介素15参与了NK细胞，树突状细胞和CD8细胞的先天免疫力和后天获得应性免疫力的激活过程。然而，以往用白介素15或白介素2在体外和体内扩增这些细胞的效果十分有限。
白介素15和白介素2通过与CD8和NK淋巴细胞表面的特定受体结合，激活CD8和NK细胞。白介素2，白介素15和白介素15受体在激活的树突状细胞和单核细胞中有很强的表达。白介素2，白介素15可以分别和白介素15受体结合形成异二聚体复合物激活CD8和NK细胞。
白介素2和白介素15的生物学作用与和白介素15受体(IgG1 Fc)形成异二聚体有直接的关系。白介素2，白介素15和白介素15受体(IgG1 Fc)形成的异二聚体复合物的生物活性大大高于白介素2和白介素15。由于白介素15生物效应需要通过形成配体与受体复合物来实现，因此目前尚无法充分利用白介素15在体外或体内扩增NK和CD8细胞来增强先天免疫力和后天获得应性免疫力。实际上，直接用白介素15受体处理NK和CD8细胞，虽然可以形成白介素15和白介素15受体异二聚体，但是此异二聚体对白介素15有拮抗作用。本发明解决了这一问题，本发明提供了一种可以在体外扩增NK和CD8细胞，增强免疫力的方法。用该方法扩增的NK和CD8细胞可以用来帮助病人抵抗肿瘤，病毒和细菌。
【发明内容】
本发明提出一种有效扩增淋巴细胞的方法。
本发明是通过下述技术方案得以实现的：
白介素2和白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物对淋巴细胞存活和扩增有重要的作用。扩增的淋巴细胞包括NK细胞，CD8细胞和NKT细胞。这些细胞有重要的医疗作用，因为它们可以识别和摧毁肿瘤细胞和病原体感染的细胞，其中包括病毒感染，如乙肝病毒，甲肝病毒和艾滋病毒。
本发明利用白介素2，白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物，扩增淋巴细胞和/或淋巴细胞前体细胞，包括NK细胞，CD8细胞和NKT细胞。本发明利用的方法可以有效的扩增淋巴细胞和/或淋巴细胞前体细胞，是理想的增强病人免疫反应的方法。
本发明中的白介素2和白介素15受体是该蛋白质的全部多肽，其中也包括这些蛋白质中具备功能的多肽成分。本发明中的白介素15受体(IgG1 Fc)是白介素15受体和免疫球蛋白Fc区域(IgG1 Fc)的联合多肽，IgG1 Fc这一区域包括但不仅仅限于CD80，CD86，B7-H1，B7-H2，B7-H3，和B7-H4具有活性的区域。活性区域是形成联合蛋白后能够激活白介素15受体从而激活淋巴细胞扩增的IgG1的所有区域。
本发明中的淋巴细胞来自于外周血和骨髓。本发明中的淋巴细胞可以是NK细胞，CD8细胞和NKT细胞；也可以是NK细胞，CD8细胞和NKT细胞的不同组合；也可以是NK细胞，CD8细胞，NKT细胞和别的淋巴细胞的不同组合；也可以是白介素2和白介素15受体(IgG1Fc)-白介素2复合物注射进人体血管后所作用的血液中所有白细胞的总和。本发明中的白介素2和白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物来源于人，但不仅仅限于人，如注射或处理的对象是其它物种，如小鼠，大鼠，猴子等等，也可以是其它物种的白介素2，白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物。
本发明提供了一个可以用来制成药物的方案，按照这个方案制成的药物可以有下面所描述的多种用途。这个方案包括白介素2，白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物。利用本方案扩增的淋巴细胞(包括NK细胞，CD8细胞和NKT细胞)适用与需要增强病人免疫力的各种情景。例如，扩增NK细胞对治疗细菌，真菌或寄生虫内感染特别有效。例如，扩增NK细胞对治疗肿瘤特别有效，如急性髓细胞性白血病，慢性淋巴瘤白血病，前列腺肿瘤，恶性黑色素瘤和肾细胞恶性肿瘤，但不仅仅限于上述肿瘤。扩增的NK和NKT细胞对治疗病毒感染特别有效，如乙肝病毒，甲肝病毒和艾滋病毒但不仅仅限于上述病毒感染。扩增的NK和NKT细胞可以显著提高抗原的作用效果。
除非另有说明，本发明中所有的技术和科学词汇的含义是本行业内的具有普通技能的人士通常理解的含义。常用术语的定义在所有分子生物学书中可以找到，例如，Benjamin Lewin，Genes VIII，Oxford University Press，2004(ISBN 0-13-145140-5)；
本发明中的白介素15受体(IgG1 Fc)是一个具有生物活性的蛋白质，是由白介素15受体和IgG1 Fc组成的多肽。本发明使用的IgG1 Fc是从常用的丙种免疫球蛋白(Ig1)中挑选出来多肽，然而，本发明使用的IgG1 Fc并不局限于常用的丙种免疫球蛋白，其他类别地丙种球蛋白Fc区域的与白介素15受体形成联合多肽的有类似功能的多肽区域也在本发明保护的范围之内。
为了确保长期，高收益的生产重组白细胞介素(白介素2，白介素15受体)和其他多肽，本发明采用了蛋白稳定表达系统。例如，细胞系转录了稳定表达白介素2多肽的表达载体，这个载体中含有病毒启动子和选择标记基因，如抗生素抗性基因。外源表达载体进入宿主细胞后，用恰当的方法激活启动子，培养细胞一段时间后即可以得到高水平表达的多肽。
分泌到培养基或上清液中的多肽产品可以通过本行业内的具有普通技能的人士所熟悉的技术来纯化和分离。这些技术包括但不限于下面所列的方法：硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换色谱，疏水作用层析，亲和层析，羟基磷灰石色谱法，色谱法和凝集素。如有必要，蛋白质复性的方案可用来帮助纯化表达的蛋白多肽。如果有必要，高效液相色谱法(HPLC)可作最后的纯化步骤进一步纯化蛋白质。
白细胞介素(白介素2，白介素15受体)和其他多肽也可以通过标准的操纵核苷酸编码序列的方法来生产。例如，用特定的，非特定的定点突变或其他分子生物学技术来生产功能等同的，但一级结构不相同的多肽。简单的一个或多个氨基酸修改如果不影响蛋白质的生化特性，这些通过氨基酸保守替换产生的蛋白质也在本发明保护的范围之内。
白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物可以通过将白介素2与白介素15受体(IgG1Fc)共同培养来获得。将多肽溶在水溶液中，如缓冲盐溶液或细胞培养液。按照摩尔数1.5∶1或2∶1或3∶1，或更大的比例(例如，5∶1甚至10∶1)加入白介素和白介素受体(IgG1 Fc)。比例的选定以确保形成最多的复合物为目标，本行业内的具有普通技能的人士都可以根据经验来判断。
本发明中在宿主细胞内表达的白介素15受体(IgG1 Fc)多肽会有一部分以二聚体的形式分泌到细胞培养上清液中。因此，可以通过在上清液中加入白介素2的方式自发形成受体-配体复合物。
本发明中的白介素2和白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物可用来扩增淋巴细胞的种群。体外扩增的细胞可移植病人。例如，白介素2和白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物按照顺序依次激活特定细胞扩增和存活，包括NK细胞，CD8和NKT细胞。该方法大约比白细胞介素2，或白介素15受体(不含IgG1 Fc)-白介素15复合物更有效10倍以上。
白介素2和白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物按照顺序激活和扩增的细胞，包括NK细胞，CD8和NKT细胞，可以用来进行自体移植，也可以进行异体移植。在受捐助人(成年人或者未成年人)的组织相容性抗原以及血液抗原与捐助人(成年人或者未成年人)的组织相容性抗原以及血液抗原相匹配的前提下，捐助人被激活和扩增的细胞可以通过静脉滴注的方式注入到被捐助人的血管中。在某些应用中，细胞系(例如，NK细胞系，CD8细胞系，NKT细胞系)也可以通过白介素2，白介素15和白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物按照顺序依次激活和扩增。扩增的细胞系用于临床治疗目的也是本发明的保护范围。
淋巴细胞或淋巴细胞前体细胞可从来源于包含有大量淋巴细胞和前体细胞的任何组织。例如，外周血(包括脐带血)，骨髓，脾脏和淋巴结。淋巴细胞或淋巴细胞前体细胞通常取自于外周血或骨髓。在其他应用中(例如，实验研究)，脾脏和/或淋巴结也是合适的来源。
例如，淋巴细胞及其前体细胞可以通过抽外周血和/或骨髓来获得。淋巴细胞/前体细胞可以进一步经过纯化得到NK细胞，CD8细胞，NKT细胞。纯化NK细胞，CD8细胞，NKT细胞的步骤和工艺是本行业内的具有普通技能的人士所熟悉的。淋巴细胞可以通过密度梯度离心的方式来分离血液或骨髓中的血红细胞，淋巴细胞和其他细胞。NK细胞，CD8细胞，NKT细胞可以利用抗体介导的亲和制备方法进一步纯化，例如抗体结合磁珠法。纯化淋巴细胞并不要求纯化的淋巴细胞绝对纯，而是指纯化的细胞比其在来源组织中所占的比例更高。通常情况下，纯化的淋巴细胞至少代表总数的50％，或者60％，或者更高。纯化的NK细胞，CD8细胞，NKT细胞悬浮在一个合适的生理缓冲溶液中，然后悬浮生长于但不局限于下列培养液中，Eagle′s培养液加入10％人血清，RPMI 1640加入10％人血清，F-10(Ham′s)Nutrientmixtures加入10％人血清。人血清也可以用10％小牛血清取代，但人血清对NK细胞，CD8细胞，NKT细胞的扩增效果更好。
纯化的淋巴细胞和/或淋巴细胞前体细胞悬浮生长于细胞培养液中，加入白介素2培养1-2周后，白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物以激活和扩增NK细胞，CD8细胞，NKT细胞。通常情况下为了降低成本，本发明采用最小的剂量来扩增淋巴细胞。白介素2和白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物的剂量在50皮摩/升到1纳摩/升之间。在某些情况下，白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物的剂量至少在100皮摩/升以上。在某些情况下，有必要进行高剂量的处理，激活浓度约为0.2，0.3，0.5，0.75或1纳摩/升。另外，白介素2和白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物直接注射入人体，用来在体内扩增NK细胞，CD8细胞，NKT细胞时，所用剂量在0.5皮摩/升到0.5纳摩/升之间。在体外扩增的淋巴细胞可以移植给淋巴细胞的捐助人本身或者受捐助人，以加强天生或抗原特异性免疫反应。通常情况下，扩增的淋巴细胞通过溶于生理盐水溶液的方法静脉滴注。
有益效果：本发明通过白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物提高病人的免疫力来帮助病人抵抗肿瘤，抵抗病毒和细菌。
说明书附图
图1白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物示意图。
图2人NK细胞体外扩增线性图显示NK细胞在白介素2，白介素15，白介素15受体(IgG1Fc)-白介素2复合物和白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素15复合物作用下线性增长。
图3人CD8细胞体外扩增线性图显示CD8细胞在白介素2，白介素15，白介素15受体(IgG1Fc)-白介素2复合物，白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素15复合物作用下线性增长。
图4人NK，CD8细胞体外扩增线性图显示NK，CD8细胞在不同浓度的白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物作用下线性增长。
图5人外周血CD3-淋巴细胞体外扩增流示仪数据图，人外周血CD3-淋巴细胞在白介素2，白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物作用下培养7天和14天后NK细胞(CD56+和CD56+/CD16+)的比例显著增长。
图6人外周血淋巴细胞和骨髓淋巴细胞体外扩增细胞流示仪数据图，人外周血淋巴细胞和骨髓淋巴细胞在白介素2，白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物作用下培养14天，NK和CD8淋巴细胞的比例显著增长。
图7体外扩增的NK细胞对SK-N-AS固体肿瘤细胞系杀伤作用流示仪数据图，人NK细胞在白介素2，或白介素2与白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素15复合物作用下培养14天后，与肿瘤细胞按照1∶4的比例共同培养6小时。
图8体外扩增的NK细胞对固体肿瘤细胞系SK-N-AS细胞杀伤作用流示仪数据图，人NK细胞在白介素2，或白介素2与白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物作用下培养14天后，与肿瘤细胞按照1∶4的比例共同培养6小时。
图9体外扩增的NK和CD8细胞对K562血液肿瘤细胞杀伤作用图。人NK和CD8细胞在白介素2，白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物作用下培养14天后，与K562血液肿瘤细胞按照不同的比例共同培养6小时。
图10体外扩增的NK和CD8细胞对慢性淋巴细胞白血病肿瘤细胞(B细胞)杀伤作用图。人NK和CD8细胞在白介素2，白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物作用下培养14天后，与慢性淋巴细胞白血病B肿瘤细胞按照不同的比例共同培养6小时。
【具体实施方式】
下面对本发明的实施作具体说明：
实施例1
白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物和白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素15复合物体外扩增淋巴细胞。
健康捐献人的NK和CD8细胞培养在RPMI1640中，辅以10％的人血清。在培养液中加入白介素2三天后，加入白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物(图1)或白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物后培养若干天。白介素2和白介素5作为对照组，如图2和图3所示。NK和CD8细胞在白介素2，白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素15复合物和白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物的作用下，数量显著增加。而对照组细胞在白介素2，白介素15的单独作用下，增加的远远没有实验组明显。细胞数量的增加可以通过插入胸苷的方法来测定。胸苷插入之后细胞继续培养12小时，然后再开始测量细胞数量的变化。在1纳摩/升浓度的白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物和白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素15复合物作用下NK和CD8细胞数量在7天时进入对数生长期，14天的时候到达平台期，约增长了10倍。NK和CD8细胞最低在0.01纳摩/升的白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物和白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素15复合物作用下即可开始增长。NK和CD8细胞的增长与白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素15复合物的浓度呈正比，复合物的浓度越高，NK和CD8细胞增长的越高，如图4所示。
白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素15复合物不仅可以扩增纯化的NK和CD8细胞，还可以扩增未经过纯化的外周血淋巴细胞和骨髓中的NK和CD8细胞。在1纳摩/升浓度的白介素2，白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素15复合物作用下，外周血淋巴细胞第7天时超过70％的CD3-淋巴细胞变成NK细胞(CD56+)，第14天时超过90％的CD3-淋巴细胞变成NK细胞(CD56+)(图5)。在1纳摩/升浓度的白介素2，白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素15复合物作用下，外周血淋巴细胞和骨髓中的NK细胞第14天时超过60％，CD8细胞分别超过45％和50％)(图6)。
实施例2
白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物和白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素15复合物激活的NK细胞对肿瘤细胞的裂解作用
以前的研究表明给患肿瘤的小鼠注射IL-15能够增强小鼠的抗肿瘤能力，延缓小鼠的寿命。本发明采用将白介素2，白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物和白介素15受体(IgG1Fc)-白介素15复合物激活的NK细胞与肿瘤细胞共同培养的方法，来研究用白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素15复合物和白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物进行抗肿瘤的可行性。
将健康捐献者的NK细胞从淋巴细胞中分离出来后，依次加入白介素2，白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物或白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素15复合物激活14天。SK-N-AS，K562，和CD19+慢性淋巴细胞白血病B细胞被用来作为裂解的靶细胞。SK-N-AS是神经母细胞瘤的细胞系，神经母细胞瘤是固体肿瘤。K562是B细胞肿瘤细胞系，该细胞系是血液肿瘤细胞系。SK-N-AS细胞表面有CD56和GD2表面抗原表达。激活的NK细胞和SK-N-AS细胞按照1∶4的比例共同培养6小时后，固定，加入抗体染色。白介素2激活的NK细胞作为对照。白介素2，白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物和白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素15复合物激活的NK细胞显著的比仅用白介素2激活的NK细胞对SK-N-AS的裂解作用强。裂解反应后，SK-N-AS的比例从对照组的超过80％降至实验组的31％以下(图7，图8)。
白介素2，白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素15复合物激活的NK细胞对K562的裂解能力比相同条件下激活的CD8细胞高(图9)。当效应细胞∶靶细胞的比值是4∶1时，NK细胞的裂解能力是CD8细胞的4倍。这表明在体内对肿瘤细胞的杀伤过程中，激活的NK细胞比CD8细胞可能起更大的作用。白介素2，白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物和白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素15复合物激活的NK细胞对从慢性淋巴细胞白血病病人外周血提取的B细胞具有显著的杀伤作用(图10)。复合物激活的CD8细胞也对病人的B细胞也有一定的杀伤作用。与对K562的杀伤作用趋势相同，激活的NK细胞的裂解能力是CD8细胞的2倍。
上述的实验显示白介素2，白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物和白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素15复合物激活的NK细胞和CD8细胞对固体肿瘤细胞，血液肿瘤细胞和来自病人的肿瘤细胞均具有明显的杀伤作用。这提示白介素2和白介素15受体(IgG1 Fc)-白介素2复合物可以用于临床的肿瘤治疗。