多肽组合物及其在结核病抗体检测中的应用 【技术领域】
本发明涉及一种多肽组合物，尤其涉及一种包含Mtb16.3特异表位抗原肽段的多肽组合物，更具体的是涉及一种应用于结核抗体检测的Mtb16.3特异表位抗原肽段的的多肽组合物。
背景技术
近年来，结核病(Tuberculosis，TB)成为全球关注的公共卫生问题和社会问题。据统计，目前全球有肺结核病人2,000万，新发病人1,000万，每年死亡人数300万，超过了其它传染病的总和。
肺结核(Pulmonary tuberculosis)显示出全球性流行病的所有主要特征，并在全世界范围内蔓延。地球上大约有1/3的人感染结核杆菌，导致每年800万例活动性肺结核和300万人死亡。结核杆菌多重药耐药株的出现以及合并HIV感染使得形势变得更为严峻。根据世界卫生组织(WorldHealth Organization，WHO)的信息，如果不能有效控制，在未来十年中将有3,000万人死于结核病，还有9,000万活动性结核新发病例，结核病正在成为成人的头号杀手。结核如此强大的流行性和传染性对公众健康来说是一个巨大的挑战，人们迫切需要解决这些问题的方法，然而现存的一些对抗结核的策略是远远不够的，尤其在诊断方法中存在着较多问题。
目前结核病的诊断虽然有多种方法，但都存在这样或那样的问题。影像学诊断虽然仍是主体，但是它需要其它辅助诊断方法；痰涂片简单易行，但阳性率低；痰培养是金标准，但周期太长，不能满足临床上快速诊断的需要；PCR分子生物学法敏感性高、诊断速度快，但存在检测不稳定的缺陷；噬菌体裂解法可以检测活结核杆菌，不能检测非结核杆菌感染，更加适用于结核菌抗药性实验研究；而血清学诊断技术有其固有的优势，如操作简便、快速、易判断结果、稳定性好、便于推广、无需特殊精密仪器等。
对于结核病检测的血清学检测，寻找高敏感性(Sensitivity)和高特异性(Speciality)的抗原成分，建立高特异性高敏感性的检测方法是解决结核病早期快速准确诊断的关键。目前人们对建立一种特异性和灵敏性都比较可靠的血清学结核病诊断方法投入了越来越多的关注。在结核病的诊断领域，虽然通常使用结核菌素纯蛋白衍生物(purified proteinderivative，PPD)用以判断是否感染结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)，但是结核菌素试验的阴性结果并不能排除患有结核病的可能性(Postgrad.Med.1995，100，201-204)。此外，由于PPD所包含的抗原由于为致病性分支杆菌(Mycobacterium)、环境分支杆菌及卡介苗(Mycobacterium.bovis bacillus Calmette-Guérin，BCG)所共有，所以及时检测的阳性结果也不能明确区分BCG免疫、环境分支杆菌感染和致病性结核杆菌感染(Mol.Immuno.，2002，39，113-119)，从而不能实现准确诊断的目的。商业化提供的PPD来源各异，没有经过精细制备，抗原组成也没有标准化，所以会产生一些皮试反应(skin test response)(Karger，Basel，1996，201-211)。
比较基因组学已经揭示，有16种区域出现在致病性的临床菌株结核分枝杆菌和牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)中。这些区域被命名为RD1-RD16(region deleted，RD)的区域没有出现在M.bovis BCG疫苗菌株中(Bacteriology 1996，178，1274-1282；Mol.Microbiol.，1999，32，643-655)。这些区域编码的蛋白包括：早期分泌性抗原靶蛋白(early secretoryantigen target 6kDa，ESAT-6)、MPT64(protein of Mycobacteriumtuberculosis)、培养滤液蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP10)、MPB83和KatG等等。有研究表明，将这些蛋白各自或组合使用能对模型动物抵抗结核分枝杆菌的感染起到作用(Leukoc.Biol.，1995，57，221-225；Gen.Microbiol.，1987，133，1431-1435)。这些蛋白中，如：ESAT-6、CFP10和MPT64等，正是目前诊断结核病领域研究得最多、最重要的抗原。此外，包括38kD抗原在内都作为血清学检测活动性结核的标志物。
38kD抗原是一种脂蛋白和主要免疫原，是目前最为常用的结核病诊断抗原之一。38kD抗原是结核杆菌种特异性蛋白质抗原且含量高出BCG10倍。当用于结核血清学检测时，该蛋白的敏感性和特异性优于其它单一抗原。有研究证实，用38kD抗原检测肺结核病人血清，灵敏度与特异性分别为65.6％和95.8％(J.Clin.Microbiol.，1997，35，553-557)。
ESAT-6和CFP 10具有较强的细胞免疫活性，在抗结核感染的免疫应答中起重要作用，是两种在结核病免疫诊断中很有应用前景的抗原。根据基因开放阅读框(open reading frames，ORF)而设计的计算机程序预测了M.tuberculosis的RD1区能编码14种长度在99-666个氨基酸范围的特殊蛋白。其中就包括由100个氨基酸构成的CFP10(Rv3874)和由95个氨基酸构成的ESAT-6(Rv3875)这两个抗原(Mol.Immuno.，2002，39，113-119)。RD1区只存在于致病性结核杆菌基因组中，所有BCG菌株基因组中均没有该区域(J.Bacteriol.，1996，178，1274-1282)。通过对抗原PPD-M，PPD-A，ESAT-6，Ag85，38kD，MPB64，MPB70，MPB83，hsp16.1，hsp65，and hsp70的T细胞反应全面而综合的研究发现，ESAT-6是结核分子杆菌感染早期的主要抗原(Infect.Immun.，2000，68，2573-2578)。RD1是第一个未在BCG巴斯德菌株衍生的BCG亚菌株中发现的区域，由该区编码的ESAT-6蛋白在人体结核分枝杆菌免疫反应中具有惊人的免疫优势(Nature 1997，389，133-134)。ESAT-6和CFP10对γ干扰素(interferon gamma，IFN-γ)都表现出很强的诱导作用。相比较而言，CFP10的诱导作用显得较弱一些，但是当其与ESAT-6相组合后能使反应能力得到改善。ESAT-6和CFP10可形成异二聚体结构，联合应用ESAT-6和CFP10诊断结核病发现混合抗原敏感性较单抗原增加，而不降低其特异性(Clin.Diagn.Lab.Immunol.，2000，7，155-160)。所以，ESAT-6和CFP10有望成为诊断动物和人致病性结核杆菌感染的特异性抗原。38kD和MPT64不仅作为诊断抗原，也是组成疫苗的一部分。
MPT64是一种分泌型结核杆菌抗原，也是一种对肺外结核(Extra-pulmonary tuberculosis，EPTB)具有特异性和灵敏度的诊断抗原(Diagnostic Pathology 2007，2，36-34)。MPT64是结核杆菌生长最早分泌的主要蛋白，由未在BCG巴斯德菌株中发现的RD2区域编码。该抗原可以从结核分枝杆菌免疫过地豚鼠体内分离得到(Infect.Immun.2002，70，672-678；Infect Immun.2000，68，214-220)。ESAT-6和MPT64都由结核分枝杆菌基因编码，而在BCG疫苗中则未曾发现。天然的MPT64和重组的MPT64均可使结核病人或结核菌素阳性者产生T细胞反应和皮肤延迟型超敏反应(delayed-type hypersensitivity，DTH)。但由于MPT64只存在于结核杆菌复合群中，大多数BCG菌株缺乏MPT64基因，BCG接种者或环境分支杆菌感染者(如：鸟分支杆菌)对MPT64皮肤试验不反应。有研究结果表明，虽然以MPT64蛋白作为抗原检测抗结核抗体的阳性率在各种结核杆菌分泌性蛋白中是较低的，但如果与其它蛋白形成融合蛋白则有可能具有较好的稳定性(Clin.Diagn.Lab.Immunol.，2000，7，155-160)，因此MPT64蛋白有希望成为结核病血清学诊断的组合抗原的候选者之一。
研究已经发现，由于个体因结核病引起的免疫反应具有复杂性，以及主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)所导致的遗传局限，所以一种有效的亚基疫苗或诊断试剂有必要包含多种抗原表位，以保证其能适用于遗传上表现各异的人群(Infect.Immun.1999，67，1702-1707；Eur.Respir.J.2001，17，537-557)。Tavares等人对38kD/CFP10、38kD/MPT64、ESAT-6/MPT64、ESAT-6/CFP10四种融合蛋白抗原用于结核病感染的诊断的研究表明，38kD/CFP10和ESAT-6/CFP10的检测灵敏度基本一致，但结核菌素皮试(tuberculin skin test，TST)呈阳性的患者有更高的反应选择性(Microbiol.Immunol.，2007，51，289-296)。和经过本发明的工作，令人惊奇地发现了Mtb16.3特异表位抗原肽段在检测结核病方面的独特优势，其与选自38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64的至少一种特异表位抗原肽段相组合可以使结核病的检测敏感性和特异性均提高。在小鼠实验中，与单一的MPT64相比，ESAT-6/MPT64融合蛋白表现出更强的人体和细胞免疫反应，并对实验中的结核病模型小鼠具有一定的保护作用。研究者认为这一结果表明ESAT-6/MPT64融合蛋白是一种潜在的疫苗(Protein Expr.Purif.，2008，59，189-196)。
Mtb8.4(Rv1174c)、Mtb8(Rv0379)和Mtb16.3(Rv2185c)广泛虽然存在于结核杆菌(包括BCG)中，其在结核病诊断方面的意义仍然不清楚。Mtb8.4是最近从结核杆菌培养物滤液中纯化分离得到的一种的低分子量蛋白抗原，Coler等学者(J Immunol.，1998，161，2356-2364)的研究更进一步揭示Mtb8.4是患有潜伏结核杆菌感染的个体中重要的免疫活性T细胞抗原，在确定致病性结核杆菌感染中具有重要作用。Mtb8可能是转运蛋白质，仅在Houghton等(Clin.Diagno.Lab.Immun.，2002，9，883-891)的研究中将Mtb8与其它几种抗原(Mtb11、Mtb48、38kD等)组成融合抗原用于检测结核病，表明Mtb8与其它几种抗原一起有可能增强38kD抗原的反应活性。Mtb16.3是一种未知功能蛋白质，有研究表明Mtb16.3与Mtb9.7组合有助于提高对与HIV共感染的结核病患者的检出率。
虽然学者们在血清学检测结核病的领域中进行了大量的研究，目前尚没有找到灵敏度和特异性均令人满意的单一抗原、融合抗原或其组合抗原。
【发明内容】
本发明的一个目的在于提供一种多肽组合物，该多肽组合物由Mtb16.3与38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4等抗原相组合。Mtb16.3能与其它几种多肽在检测结合抗体方面相互补，从而提高血清学检测结核病的灵敏度和特异性。
本发明的另一个目的在于提供一种多肽组合物，该多肽组合物是Mtb16.3与38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4等抗原形成融合蛋白的混合。在检测结核抗体方面，Mtb16.3不仅能与其它几种单独抗原相互补，而且还能与多种抗原相互补，从而进一步提高血清学检测结核病的灵敏度和特异性。
本发明的又一个目的在于提供一种多肽组合物，由Mtb16.3与38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64等抗原相组合或构成融合抗原再混合组成。其用于检测应答结核菌抗原而产生的抗体，以及在结核病抗体检测中的应用。
抗原Mtb16.3、38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8或Mtb8.4，还包括使用蛋白质表位预测软件，如：BIOSUN(北京基础医学研究所计算生物学中心)，然后选取抗原中具有一个或多个表位、尤其是优势表位(能够激发较强的免疫反应的表位)的相应肽段；通过常规的分子生物学方法钓取其编码序列并表达出该抗原多肽。
通过蛋白质表位预测软件所得Mtb16.3特异表位抗原的氨基酸序列为SEQ ID No 1，其相应的DNA编码序列为SEQ ID No 10。
通过蛋白质表位预测软件所得38kD特异表位抗原的氨基酸序列为SEQ ID No 2，其相应的DNA编码序列为SEQ ID No 11。
通过蛋白质表位预测软件所得ESAT-6特异表位抗原的氨基酸序列为SEQ ID No 3，其相应的DNA编码序列为SEQ ID No 12。
通过蛋白质表位预测软件所得CFP10特异表位抗原的氨基酸序列为SEQ ID No 4，其相应的DNA编码序列为SEQ ID No 13。
通过蛋白质表位预测软件所得MPT64特异表位抗原的氨基酸序列为SEQ ID No 5，其相应的DNA编码序列为SEQ ID No 14。
通过蛋白质表位预测软件所得Mtb8特异表位抗原的氨基酸序列为SEQ ID No 6，其相应的DNA编码序列为SEQ ID No 15。
通过蛋白质表位预测软件所得Mtb8.4特异表位抗原的氨基酸序列为SEQ ID No 7，其相应的DNA编码序列为SEQ ID No 16。
根据计算机预测而选择的Mtb16.3、38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4特异表位抗原肽段进行适当的修饰仍然具有检测效果。例如对其中个别氨基酸进行保守替换、增加或缺失，个别氨基酸指少于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸。保守氨基酸替换的具体方式为：Ala、Val、Leu和Ile间的互相替换；Ser和Thr间的互相替换；酸性残基Asp和Glu间的互相替换；Asn和Gln间的互相替换；和碱性残基Lys和Arg间的互相替换；或者芳香族残基Phe和Tyr间的互相替换。这些互相替换的氨基酸具有相同/相近似的生物化学性质，如：亲水性、电荷性、等电点等(《生物化学》，北京：高等教育出版社，1990)，应当视为等同替换。个别氨基酸进行保守替换、增加或缺失的抗原，其空间折叠结构不会发生改变，抗原表位也不发生改变。
ESAT-6特异表位抗原肽段(SEQ ID No 3)5位和34位Asp可以单独或同时替换为Glu；6位、24位和39位Glu可以单独、任意两个或同时替换为Asp；26位Tyr可以替换为Phe；2位、10位和21位Ser可以单独、任意两个或同时替换为Thr；8位、13位和32位Lys可以单独、任意两个或同时替换为Arg；9位、27位、30位和31位Gln可以单独、任意两个、任意三个或同时替换为Asn；3位、4位、11位、14位和40位Leu可以单独、任意两个、任意三个、任意四个或同时替换为Ile或Ala或Val；15-17位、25位、35位和37位Ala可以单独、任意两个、任意三个、任意四个、任意五个或同时替换为Ile或Leu或Val。这些替换类型可以单独进行，也可以以任意替换类型的组合进行。
CFP10特异表位抗原肽段(SEQ ID No 4)11位和28位Asp可以单独或同时替换为Glu；1位、9位、12位、29位和30位Glu可以单独、、任意两个、任意三个、任意四个或同时替换为Asp；24位Tyr可以替换为Phe；14位、25位、36位和37位Ser可以单独、任意两个、任意三个或同时替换为Thr；5位和7位Lys可以单独或同时替换为Arg；18位和26位Arg可以单独或同时替换为Lys；9位、6位、8位、19位、23位和31-33位Gln可以单独、任意两个、任意三个、任意四个、任意五个、任意六个或同时替换为Asn；10位和35位Leu可以单独或同时替换为Ile或Ala或Val；20位、27位和34位Ala可以单独、任意两个或同时替换为Ile或Leu或Val。这些替换类型可以单独进行，也可以以任意替换类型的组合进行。
Mtb8特异表位抗原肽段(SEQ ID No 6)19位、22位和23位Asp可以单独、任意两个或同时替换为Glu；17位和22位Glu可以单独或同时替换为Asp；5位和20位Ser可以单独或同时替换为Thr；16位、18位、26位和28位Arg可以单独、任意两个、任意三个或同时替换为Lys；8位和15位Gln可以单独或同时替换为Asn；14位、21位、26位、和29位Val可以单独、任意两个、任意三个或同时替换为Ile或Ala或Leu；9-10位、11位、13位、17位和27位Ala可以单独、任意两个、任意三个、任意四个、任意五个或同时替换为Ile或Leu或Val。这些替换类型可以单独进行，也可以以任意替换类型的组合进行。
这些经计算机软件预测并确定的源自于生物自身抗原(母抗原)的特异表位抗原可以替代其相应的母抗原与其它抗原相组合，或以替代母抗原的形式各自互相组合。
抗原组合指Mtb16.3与38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4等抗原各自独立地相互混合或形成融合蛋白抗原。
Mtb16.3抗原与38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4抗原之一相组合，或与38kD、ESAT-6、CFP 10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4抗原任意几种相组合。
具体的，Mtb16.3抗原分别与38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4抗原任意摩尔比比例相混合；Mtb16.3抗原与38kD和ESAT-6任意摩尔比比例相混合；Mtb16.3抗原与38kD和MPT64任意摩尔比比例相混合；Mtb16.3抗原与38kD、ESAT-6和CFP10任意摩尔比比例相混合；Mtb16.3抗原与38kD、ESAT-6、MPT64和CFP10任意摩尔比比例相混合。
具体的，Mtb16.3抗原分别与38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4抗原以任意摩尔比比例构成融合蛋白；Mtb16.3抗原与38kD和ESAT-6以任意摩尔比比例相融合；Mtb16.3抗原与38kD和MPT64以任意摩尔比比例相融合；Mtb16.3抗原与38kD、ESAT-6和CFP10以任意摩尔比比例相融合；Mtb16.3抗原与38kD、ESAT-6、MPT64和CFP10以任意摩尔比比例相融合。进一步的，Mtb16.3抗原与Mtb8.4、Mtb8和MPT64抗原所构成融合蛋白从N末端至C末端的顺序依次为Mtb8.4-MPT64-Mtb16.3-Mtb8。这些融合蛋白包括含有相同组成的单元结构的多拷贝融合蛋白。连接各抗原之间的多肽氨基酸序列优先选择SerGlyGlyGlySerSerGlyGlyGlySer。
本发明所述的融合蛋白的混合为Mtb16.3与38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4等抗原中一种或几种形成融合抗原再与Mtb16.3、38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4任意两种以上抗原形成的融合抗原以任意摩尔比比例相混合。所述的融合抗原包括含有相同组成的单元结构的多拷贝融合抗原。这种组合可以选择性地为Mtb16.3与38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4抗原中一种或几种形成融合抗原再与38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4任意两种以上抗原形成的融合抗原以任意摩尔比比例相混合。
具体的，Mtb16.3抗原与Mtb8.4、Mtb8和MPT64抗原融合后，与38kD、ESAT-6和CFP10融合抗原以任意摩尔比比例相混合。进一步的，Mtb16.3抗原与Mtb8.4、Mtb8和MPT64抗原所构成融合蛋白从N末端至C末端的顺序依次为Mtb8.4-MPT64-Mtb16.3-Mtb8；38kD、ESAT-6和CFP10融合抗原从N末端至C末端的顺序依次为38kD-ESAT-6-CFP10。这些融合抗原包括含有相同组成的单元结构的多拷贝融合抗原。
融合蛋白抗原可以通过基因工程方式制得，即通过目标融合蛋白的DNA转导/转化至基因工程菌株，如：大肠杆菌(E.coli)、酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)中表达并纯化，或在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、小鼠骨髓瘤SP2/O细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞等哺乳动物细胞中表达并纯化后，得到将其中一种抗原C末端，经由酰胺键(amide bond)和另一种抗原N末端首尾相连的融合蛋白产物(Protein Expr.Purif.，2008，59，189-196)。
基因工程方法制备蛋白质抗原的克隆、表达以及纯化可通过多种方法进行。具体方法参见《分子克隆实验指南》(第三版)，科学出版社，2002，第1217-1270页。适宜的原核表达载体如pEGX系列原核表达载体(Amersham Pharmacia)、pET系列原核表达载体(Novagen)等。特别优选pGEX-4T-2载体。
抗原还可以通过化学合成的方式完成。化学合成采用Fmoc方法，通过固相合成技术合成。该方法的具体步骤参见Eur.J.Immunol.1994，24，3188-3193；J.Org.Chem.1972，37，3404-3409；黄惟德，陈常庆多肽合成，北京：科学出版社，1985。
对于不同肽段融合的抗原，本领域众所周知其构建原则和方法。具体而言，为了不影响待融合肽段的各自的功能需要在不同肽段之间添加一个接头。关于接头的选择具体可参见Protein Eng.，2001，14，529-532。
具体的，选择多肽或蛋白质将各抗原之间相连接形成融合蛋白，所述多肽或蛋白质序列长度为1-100个氨基酸，通常选择长度为4-30个氨基酸的多肽，优先选择长度为4-15个氨基酸的多肽。组成这些多肽和蛋白质的氨基酸指具有既共价连接氨基又共价连接羧基的不对称中心碳原子的有机分子。
一种具体的融合方式为，通过蛋白质表位预测软件所得38kD-ESAT-6-CFP10抗原的单元结构氨基酸序列为SEQ ID No 8，其相应的DNA编码序列为SEQ ID No 17。连接各抗原的多肽的氨基酸长度为10，序列为SerGlyGlyGlySerSerGlyGlyGlySer。
另一种具体的融合方式为，通过蛋白质表位预测软件所得Mtb8.4-MPT64-Mtb16.3-Mtb8抗原的单元结构氨基酸序列为SEQ ID No 9，其相应的DNA编码序列为SEQ ID No 18。连接各抗原的多肽的氨基酸长度为10，序列为SerGlyGlyGlySerSerGlyGlyGlySer。
多种抗原的连接还可以采用连接子(space linker)，以化学连接的方式进行。这种连接子选自于氨基酸长度1-500的多肽或蛋白质、有机高分子聚合物(Polymer)，分子量在100-2,000Da的有机小分子。如：使用两端活化的分子量为2,000-50,000Da聚乙二醇(NOF Corporation)、两端活化的C1-C30的脂肪酸(J.Gene.Med.，2005，7，604-612)。化学连接可以是抗原C末端与另一抗原N末端首尾顺序连接，也可以由连接子将组成抗原的某一个氨基酸侧链与另一抗原相连接。连接子与抗原之间形成酰胺键(amide bond)或尿键(urine bond)。
高分子聚合物是指具有分子量大于2,000Da的化合物，分子间由结构单位(structural unit)、或单体经由共价键相互连接在一起。所述聚合物具体选自于聚乙二醇、聚氨基酸、聚核苷酸、聚乳酸、聚赖氨酸、聚亚胺和10个以上单糖通过糖苷键形成的多聚糖(polysaccharide)，如：淀粉及其水解产物、纤维素、甲壳素或葡聚糖。
有机小分子具体选自于各类氨基酸、各类单糖、各类维生素(Vitamin)、由两个单糖单元通过糖苷键形成的二糖(disaccharide)(如：蔗糖、乳糖或麦芽糖)、由2-10单糖通过糖苷键形成的寡聚糖(oligosaccharide)(如：低聚异麦芽糖、低聚木糖或低聚半乳糖)和分子量在20-2000Da的聚合物。
抗原组合或融合抗原还包括在其氨基酸序列骨架上进行化学修饰或生物修饰后所得的产物。所述的修饰包括聚乙二醇化(PEGylation)(Adv.Drug deliv.Rev.，28，275-299；Adv.Drug deliv.Rev.，54，453-609；Adv.Drug deliv.Rev.，60，1-88)、酰基化(Acylation)(J.Pharma.Sci.，86，768-773；J.Pharma.Sci.，86，1365-1368)、糖基化(Glycosylation)(J.Pharma.Sci.87，326-332；Adv.Drug deliv.Rev.，6，103-131；Adv.Drug deliv.Rev.，13，251-267)和有机小分子修饰等。
聚乙二醇化修饰所用的聚乙二醇为一端封闭的聚乙二醇，封闭基团可以为C1-C30的烷基，C1-C30的脂肪酸或糖基。聚乙二醇为分子量2,000-100,000Da，可以选择2,000-50,000Da，一般选择5,000-50,000Da。
烷基与聚乙二醇一端通常形成醚键，也可以以酯键相连接。链长可以选择C1-C10的烷基，优先选择甲基、乙基或丙基。
脂肪酸与聚乙二醇一端通常形成酯键，脂肪酸链长一般选择C1-C18的脂肪酸，优先选择链长为C10、C12、C16和C18的脂肪酸。
酰基化使用C1-C30的脂肪酸，进一步选择C1-C18的脂肪酸。
有机小分子指具有C、H、O或C、H、O、N、P、S等几种元素组成的分子量小于2,000Da的有机小分子。具体地指各类氨基酸、各类单糖或多糖、各类维生素(Vitamin)、生物素和分子量在20-2000Da的聚合物，如：聚乙二醇、多肽、寡聚糖和多聚糖(葡聚糖、淀粉和甲壳素等)和核苷等。
抗原Mtb16.3与抗原38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4任意一种的混合比例范围为100∶1～1∶100，摩尔比。所述混合比例范围具体选自于50∶1～1∶50、30∶1～1∶30、20∶1～1∶20、10∶1～1∶10、5∶1～1∶5、3∶1～1∶3、2∶1～1∶2或1∶1。
抗原Mtb16.3与抗原38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4任意几种(二种、三种、四种、五种、六种)混合，其占总抗原的摩尔比比值范围为0.01-0.99。可以选择摩尔比比值范围为0.05-0.95、0.10-0.90、0.20-0.80、0.30-0.70、0.35-0.65、0.40-0.60、0.45-0.55、0.60-0.40、0.70-0.30、0.80-0.20或0.90-0.10。摩尔比比值具体选自于0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85或0.90。
抗原Mtb16.3与抗原38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4任意一种的融合的比例为100∶1～1∶100，摩尔比。可以选择混合比例为50∶1～1∶50、30∶1～1∶30、20∶1～1∶20、10∶1～1∶10、5∶1～1∶5、3∶1～1∶3、2∶1～1∶2或1∶1。融合抗原包括含有相同组成的单元结构的多拷贝融合抗原。
抗原Mtb16.3与抗原38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4任意几种(二种、三种、四种、五种、六种)融合，其占总抗原的摩尔比比值范围为0.01-0.99。可以选择摩尔比比值范围为0.05-0.95、0.10-0.90、0.20-0.80、0.30-0.70、0.35-0.65、0.40-0.60、0.45-0.55、0.60-0.40、0.70-0.30、0.80-0.20或0.90-0.10。具体选择摩尔比比值为0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85或0.90。融合抗原包括含有相同组成的单元结构的多拷贝融合抗原。
一种具体的融合方式为，Mtb16.3与抗原MPT64或Mtb8或Mtb8.4单独融合，各种抗原可以为其氨基酸序列的单拷贝，也可以为其氨基酸序列的多拷贝。Mtb16.3占总抗原的摩尔比比值为0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.60、0.65、0.70、0.75或0.80。
另一种具体的融合方式为，Mtb16.3与抗原MPT64和Mtb8融合，各种抗原可以为其氨基酸序列的单拷贝，也可以为其氨基酸序列的多拷贝，通式分别表示为[Mtb16.3]m、[MPT64]n和[Mtb8]p，n、m或p为≥1且≤100的正整数，取值各自独立。Mtb16.3占总抗原的摩尔比比值为0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.60、0.65、0.70、0.75或0.80。当m、n或p同时取值为1时，其单元结构融合顺序选自于Mtb16.3-MPT64-Mtb8、Mtb16.3-Mtb8-MPT64、Mtb8-Mtb16.3-MPT64、Mtb8-MPT64-Mtb16.3、MPT64-Mtb8-Mtb16.3或MPT64-Mtb16.3-Mtb8。
又一种具体的融合方式为，Mtb16.3与抗原MPT64、Mtb8和Mtb8.4融合，各种抗原可以为其氨基酸序列的单拷贝，也可以为其氨基酸序列的多拷贝，通式分别表示为[Mtb16.3]m、[MPT64]n、[Mtb8]p和[Mtb8.4]q，m、n、p或q为≥1且≤100的正整数，取值各自独立。Mtb16.3占总抗原的摩尔比比值为0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.60、0.65、0.70、0.75或0.80。当m、n、p或q同时取值为1时，其单元结构融合顺序选自于Mtb16.3-MPT64-Mtb8-Mtb8.4、Mtb16.3-Mtb8-MPT64-Mtb8.4、Mtb8-Mtb16.3-MPT64-Mtb8.4、Mtb8-Mtb8.4-Mtb16.3-MPT64、MPT64-Mtb8.4-Mtb16.3-Mtb8、MPT64-Mtb16.3-Mtb8-Mtb8.4或Mtb8.4-MPT64-Mtb16.3-Mtb8。
Mtb16.3与38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4等抗原中一种或几种形成的融合抗原再与Mtb16.3、38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4任意两种以上抗原形成的融合抗原相混合。融合抗原之间的混合比例为100∶1～1∶100，摩尔比。可以选择混合比例为50∶1～1∶50、30∶1～1∶30、20∶1～1∶20、10∶1～1∶10、5∶1～1∶5、3∶1～1∶3、2∶1～1∶2或1∶1，摩尔比。
Mtb 16.3抗原与Mtb8.4、Mtb8和MPT64抗原相融合，其占总抗原的摩尔比比值为0.01-0.99。可以选择摩尔比比值为0.05-0.95、0.10-0.90、0.20-0.80、0.30-0.70、0.35-0.65、0.40-0.60、0.45-0.55、0.60-0.40、0.70-0.30、0.80-0.20或0.90-0.10。具体选择摩尔比比值为0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85或0.90。融合抗原包括含有相同组成的单元结构的多拷贝融合抗原。
38kD、ESAT-6和CFP10融合抗原相组合，摩尔比为1∶1∶1。
一种具体的实施方式为，Mtb16.3抗原与Mtb8.4、Mtb8和MPT64抗原所构成融合蛋白从N末端至C末端的顺序依次为Mtb8.4-MPT64-Mtb16.3-Mtb8；38kD、ESAT-6和CFP10融合抗原从N末端至C末端的顺序依次为38kD-ESAT-6-CFP10。这些融合抗原包括含有相同组成的单元结构的多拷贝融合抗原，通式分别为[Mtb8.4-MPT64-Mtb16.3-Mtb8]x和[38kD-ESAT-6-CFP10]y，x或y为≥1且≤1000的正整数，取值各自独立。两种抗原单元结构Mtb8.4-MPT64-Mtb16.3-Mtb8与38kD-ESAT-6-CFP10的混合比例为1∶3、1∶2、1∶1、2∶1或3∶1。
另一种具体的实施方式为，各种抗原以其各自氨基酸序列的多拷贝方式融合，通式分别表示为[Mtb16.3]m、[MPT64]n、[Mtb8]p和[Mtb8.4]q，m、n、p或q为≥1且≤100的正整数，取值各自独立。Mtb16.3抗原与Mtb8.4、Mtb8和MPT64抗原所构成融合蛋白从N末端至C末端的顺序依次为[Mtb8.4]q-[MPT64]n-[Mtb16.3]m-[Mtb8]p；38kD、ESAT-6和CFP10融合抗原从N末端至C末端的顺序依次为38kD-ESAT-6-CFP10，通式分别表示为[38kD]u、[ESAT-6]v和[CFP10]w，u、v或w为≥1且≤100的正整数，取值各自独立。这些融合抗原包括含有相同组成的单元结构的多拷贝融合抗原，通式分别为[Mtb8.4-MPT64-Mtb16.3-Mtb8]x和[38kD-ESAT-6-CFP10]y，x或y为≥1且≤1000的正整数，取值各自独立。两种抗原单元结构Mtb8.4-MPT64-Mtb16.3-Mtb8与38kD-ESAT-6-CFP10的混合比例为1∶3、1∶2、1∶1、2∶1或3∶1。
由Mtb16.3与38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64等抗原相组合或构成融合抗原再混合方式得到的多肽组合物用于检测应答结核菌抗原而产生的抗体。具体而言，该组合在结核病抗体检测中的应用。
检测方法可以有多种，例如间接酶联免疫测定技术、双抗原夹心酶免疫测定技术、金标快速检测技术、免疫渗滤检测技术、蛋白芯片检测技术等。具体选择间接酶联免疫测定，即间接ELISA方法。
间接ELISA方法基本原理是：多肽(抗原)包被在酶标板表面，将稀释后的待检血清/血浆和对照物加入反应板孔中，如果被检血清/血浆中存在抗体，经温育后，则血清/血浆中特异性抗体与反应板孔中的抗原多肽结合，形成固相抗原-抗体复合物，洗去未结合的血清/血浆中其它成分，加入酶标记的抗人IgG抗体，温育，固相抗原(多肽)结合的抗体再与酶标记的抗人IgG抗体结合，洗去未结合的酶标记抗体成分，加入酶底物，并被催化成为有色产物，最后加入终止液终止反应。根据对照物，可对抗体进行定量或定性测定。其具体方法可以参见Infect.Immun.1998，66，3936-3940和Protein Expr.Purif.，2008，59，189-196。
本发明实现的有益效果：
Mtb16.3抗原在检测结核杆菌中具有独特的优势。Mtb16.3抗原与38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64等四种抗原在血清学检测方面具有良好的互补性。Mtb16.3抗原与选择38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64的至少一种抗原的组合能显著提高结核病诊断的灵敏度。
Mtb16.3特异表位抗原肽段(SEQ ID No 1)在检测结核杆菌中具有更独特的优势。当四种特异表位抗原，即38kD(SEQ ID No 2)、ESAT-6(SEQ ID No 3)、CFP10(SEQ ID No 4)和MPT64(SEQ ID No 5)，全部反应性为阴性时，Mtb16.3抗原肽段则对该血清的反应性呈现强阳性(BP19)。由此可见，Mtb16.3特异表位抗原肽段与38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64等四种特异表位抗原肽段在血清学检测方面具有良好的互补性。Mtb16.3特异表位抗原肽段与选择38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64的至少一种特异表位抗原肽段的组合能显著提高结核病诊断的灵敏度。
间接ELISA方法进行检测，组合应用38kD-ESAT6-CFP10和Mtb8.4-MPT64-Mtb16.3-Mtb8融合抗原或其各自相应的特异表位多肽融合抗原对结核病的检测灵敏度和特异性分别为95％和100％，表现出更佳的检测效果。
【附图说明】
图1表示结核杆菌蛋白质38kD的表位分析；
图2表示结核杆菌蛋白质ESAT-6的表位分析；
图3表示结核杆菌蛋白质CFP10的表位分析；
图4表示结核杆菌蛋白质MPT64的表位分析；
图5表示结核杆菌蛋白质Mtb8的表位分析；
图6表示结核杆菌蛋白质Mtb8.4的表位分析；
图7表示结核杆菌蛋白质Mtb16.3的表位分析。
【具体实施方式】
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。应当说明的是，本发明所述的实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。
实施例17种结核杆菌特异表位抗原肽段的确定
利用BIOSUN生物学分析软件分别分析了7种结核杆菌抗原38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtb16.3的表位分布情况，首先输入其氨基酸序列，然后寻找B细胞表位，所得表位分布图示于图1-7。根据表位分布图，最终确定特异表位抗原肽段。其中结核杆菌抗原38kD的特异表位抗原肽段的氨基酸序列和编码DNA序列分别为SEQ IDNO 2和SEQ ID NO 11；结核杆菌抗原ESAT-6的特异表位抗原肽段的氨基酸序列和编码DNA序列分别为SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 12；结核杆菌抗原CFP10的特异表位抗原肽段的氨基酸序列和编码DNA序列分别为SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 13；结核杆菌抗原MPT64的特异表位抗原肽段的氨基酸序列和编码DNA序列分别为SEQ ID NO 5和SEQ ID NO14；结核杆菌抗原Mtb8的特异表位抗原肽段的氨基酸序列和编码DNA序列分别为SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 15；结核杆菌抗原Mtb8.4的特异表位抗原肽段的氨基酸序列和编码DNA序列分别为SEQ ID NO 7和SEQID NO 16；结核杆菌抗原Mtb16.3的特异表位抗原肽段的氨基酸序列和编码DNA序列分别为SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 10。
实施例2单独的7种结核杆菌特异表位抗原肽段的制备
1、特异表位抗原肽段基因的克隆
根据特异表位抗原肽段的核苷酸序列设计并合成了上下游引物，所使用的限制性内切酶分别为BamHI和Xho I。
用于扩增特异表位抗原肽段38kD的引物序列如下：
38kD-F：5’-GGGATCCGCGGCGGGCTGTGGCTCGA-3’
38kD-R：5’-GCTCGAGGCTGGAAATCGTCGCGA-3’
用于扩增特异表位抗原肽段ESAT6的引物序列如下：
ESAT6-F：5’-GGGATCCCATTCCCTCCTTGACGA-3’
ESAT6-R：5’-GCTCGAGGTTCAGCTCGGTAGCCGT-3’
用于扩增特异表位抗原肽段CFP10的引物序列如下：
CFP10-F：5’-CGGATCCGAAGCAGCCAATAAGCAG-3’
CFP10-R：5’-GCTCGAGCGAGGACAGCGCCTGCTG-3’
用于扩增特异表位抗原肽段MPT64的引物序列如下：
MPT64-F：5’-GGGATCCCCCAAGACCTACTGCGA-3’
MPT64-R：5’-GCTCGAGCGGCGCTATCGATACCT-3’
用于扩增特异表位抗原肽段Mtb8的引物序列如下：
Mtb8-F：5’-GGGATCCACCAGCCCCACATCCT-3’
Mtb8-R：5’-GCTCGAGAATGACCCGAGCGACGCGGA-3’
用于扩增特异表位抗原肽段Mtb8.4的引物序列如下：
Mtb8.4-F：5’-GGGATCCCCGGGGTCGCCTCCGCA-3’
Mtb8.4-R：5’GCTCGAGTTGCGCGGCCATGGCA-3’
用于扩增特异表位抗原肽段Mtb16.3的引物序列如下：
Mtb16.3-F：5’-GGGATCCCGGACAAGACGACACAGA-3’
Mtb16.3-R：5’-GCTCGAGGCCCTCGACTCGTTTCTT-3’
以结核杆菌菌株H37Rv(中国结核病防治临床中心国家参比实验室提供)基因组DNA为模板，分别扩增了38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtb16.3特异表位抗原肽段的基因片段。PCR扩增条件如下：预变性95℃ 2分钟，变性94℃ 30秒；复性58℃ 30秒；延伸72℃30-90秒(随基因长度不同而不同)，扩增32个循环，再72℃延伸7分钟。
PCR扩增所得的片段通过电泳鉴定，表明均得到相应大小的基因片段。
2、表达载体的构建
将PCR产物用限制性内切酶酶切并连接入经相同限制性内切酶酶切的pGEX-4T-2载体，测序由利嘉富诚生物技术有限公司完成。
3、特异表位抗原肽段在大肠杆菌DH5α中的表达与纯化
用所得到的重组质粒转化大肠杆菌菌株DH5α，对PCR鉴定阳性克隆进行IPTG诱导。诱导后的菌体进行超声破碎，将上清液与适量50％谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，室温轻摇30分钟。混合物于4℃以500g离心5分钟，小心去掉上清，在沉淀中加入10倍柱体积的PBS，颠倒离心管数次，洗去未与树脂结合的蛋白。于4℃以500g离心5分钟。重复洗涤过程2次。在每毫升树脂加入50单位溶于1ml PB S的凝血酶，颠倒离心管数次混匀，室温下振荡10～16小时。于4℃以500g离心5分钟，将上清小心转移至新管中。进行SDS-PAGE分析，结果表明获得了纯度较高的特异表位抗原肽段。
实施例338kD-ESAT6-CFP10融合抗原的制备
1、引物设计
根据三个抗原基因及接头的序列设计了上下游引物，使用的限制性内切酶分别为BamH I和Xho I，所有引物均由上海英俊生物技术公司合成，其序列如下：
38kD-F：5’-GGGATCCGCGGCGGGCTGTGGCTCGA-3’
38kD-RL：5’-ACTACCGCCACCAGAGCTGGAAATCGTCGC-3’
ESAT6-FL：5’-AGCGGCGGCGGTAGCCATTCCCTCCTTGAC-3’
ESAT6-RL：5’-AGAGCCACCGCCACTGTTCAGCTCGGTAGC-3’
CFP10-FL：5’-CTTCCGGTGGTGGCTCTGAAGCAGCCAATAA-3’
CFP10-R：5’-GCTCGAGCGAGGACAGCGCCTGCTG-3’
2、载体构建
以结核杆菌菌株H37Rv基因组DNA为模板，分别扩增了38kD、ESAT-6和CFP10特异表位抗原肽段的基因片段。PCR扩增条件如下：预变性95℃ 2分钟，变性94℃ 30秒；复性58℃ 30秒；延伸72℃ 30-90秒(随基因长度不同而不同)，扩增32个循环，再72℃延伸7分钟。通过电泳鉴定，表明均得到相应大小的基因片段。然后以具有互补接头的基因片段互为模板进行扩增，将38kD、ESAT-6和CF P10抗原基因片段连接到一起，构建融合抗原基因。将融合抗原基因片段用限制性内切酶酶切后连接入经相同限制性内切酶酶切的pGEX-4T-2载体，测序由利嘉富诚生物技术有限公司完成。
3、抗原制备
参见实施例2。
实施例4MPT64-Mtb8-Mtb8.4-Mtb16.3融合抗原的制备
根据4个抗原基因的序列设计了上下游引物，使用的限制性内切酶分别为BamH I和Xho I，所有引物均由上海英俊生物技术公司合成，其序列如下：
Mtb8.4-F：5’-GGGATCCCCGGGGTCGCCTCCGCA-3’
Mtb8.4-RL：5’-GCTACCACCGCCGGATTGCGCGGCCATGGCA-3’
MPT64-FL：5’-GGTGGCGGCTCCCCCAAGACCTACT-3’
MPT64-RL：5’-CTACCGCCACCAGACGGCGCTATCGATA-3’
Mtb16.3-FL：5’-GCGGCGGCGGTAGCGCGGACAAGACGACAC-3’
Mtb16.3-RL：5’-GAGCCACCGCCACTGCCCTCGACTCGTTTCT-3’
Mtb8-FL：5’-CCGGTGGTGGCTCTGCCGGGGTCGCCTCCG-3’
Mtb8-R：5’-GCTCGAGAATGACCCGAGCGACGCGGA-3’
载体构建以及抗原制备参见实施例3。
实施例5间接ELISA方法评价7种单独特异表位抗原肽段的抗原性
分别以所选择的38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtb16.3特异表位抗原肽段为抗原，应用间接ELISA方法初步检测了30例结核阴性血清样本，以其OD值的平均值+2SD为cutoff值，计算出38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtb16.3的cutoff值分别为0.55、0.2、0.15、0.29、0.17、0.18和0.30。然后，再用这七种抗原分别检测了20例结核病人血清和10例正常人血清的抗结核抗体，表1中显示了所检测样品的OD值与cutoff值的比值(S/co＝样品OD值/cutoff值)，比值大于1判定为阳性，比值大于2判定为强阳性，比值小于1判定为阴性。在初步检测中38kD、ESAT-6、CFP 10、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtb 16.3七种抗原的敏感性和特异性分别如下：38kD为75％和90％、ESAT-6为45％和90％、CFP10为80％和100％、MPT64为50％和90％、Mtb8分别为55％和90％，Mtb8.4分别为40％和90％，Mtb16.3分别为55％和80％。
表1间接ELISA方法检测七种特异表位抗原肽段对结核病人和正常人血液样本的反应性(S/co)
由表1数据发现，在这七种抗原中没有任何一种能够检出全部结核病患者，但令人惊奇地发现，Mtb16.3特异表位抗原肽段在检测结核杆菌中具有独特的优势。当常用的四种抗原，即38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64，全部反应性为阴性时，Mtb16.3特异表位抗原肽段则对该血清的反应性呈现强阳性(BP19)。由此可见，Mtb16.3特异表位抗原肽段与38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64四种特异表位抗原肽段在血清学检测方面具有良好的互补性。Mtb16.3特异表位抗原肽段与选择38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64的至少一种特异表位抗原肽段的组合有可能提高结核病诊断的灵敏度。
此外，虽然这七种抗原中没有任何一种能够检出全部结核病患者，但是七种抗原的联合检出率可以达到100％，抗原之间的这种互补性对于结核病患者的临床诊断是非常重要的。用不同抗原检测同一病人血清，其反应性有所不同，并且各抗原之间存在一定的互补性。这可能是由于结核杆菌抗原多而复杂，在宿主体内表现出不同的抗体谱。因此，联合应用多种抗原进行检测能在保证特异性的基础上有效提高检测灵敏度，并开发出高特异性和高灵敏度的检测结核病抗体试剂。
实施例6间接ELISA方法评价Mtb16.3特异表位抗原肽段与其余特异表位抗原肽段相组合在检出结核病患者中的效果
如实施例5所述，由于Mtb16.3特异表位抗原肽段具有其它抗原肽段所不具有的优点，因此设计实验验证其与四种常用抗原，即38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64，特异表位抗原肽段的一种或多种抗原肽段相组合在检出结核病患者中的效果。各种组合中的抗原摩尔比比值为1。实验结果如表2所示。
表2间接ELISA方法检测Mtb16.3特异表位抗原肽段与其它特异表位抗原肽段混合血液样本的反应性(S/co)
由表2可见，Mtb16.3特异表位抗原肽段与其余一种或多种抗原肽段相组合在检出结核病患者中效果更好，检出率明显提高，特异性却没有降低。这表明Mtb16.3特异表位抗原肽段确实与其它特异表位抗原肽段在检出结核病患者方面存在互补性。联合应用多种抗原可以提高检出率，避免漏检。
实施例7间接ELISA方法评价融合抗原在检出结核病患者中的效果
单独或组合应用38kD-ESAT6-CFP10和Mtb8.4-MPT64-Mtb16.3-Mtb8融合抗原包被酶联板，应用间接ELISA方法初步评价了融合抗原在检出结核病患者中的效果。融合抗原中的各组分的摩尔比比值为1，抗原组合的摩尔比比值为1。
在初步检测中，组合应用38kD-ESAT6-CFP10和Mtb8.4-MPT64-Mtb16.3-Mtb8融合抗原时，20例结核病患者的血清仅1例检测结果为阴性，其它19例均为阳性，其中9例为强阳性(S/co＞2.0)，与临床结果的符合性达到95％。初步检测中10例健康献血员血清均为阴性。确定应用间接ELISA方法进行检测融合抗原的灵敏度和特异性分别为95％和100％(见表3)。以上结果显示7个抗原全部融合(3个融合在一起，另4个融合在一起)的效果更佳。
表3间接ELISA方法检测融合抗原对结核病人和正常人血液样本的反应性(S/co)
【序列表】
<110>上海荣盛生物药业有限公司
<120>多肽组合物及其在结核病抗体检测中的应用
<130>0811571
<160>18
<170>PatentIn version 3.3
<210>SEQ ID No 1
<211>143
<212>PRT
<213>Mtb16.3特异表位抗原肽段的氨基酸序列
<400>1
Ala Asp Lys Thr Thr Gln Thr Ile Tyr Ile Asp Ala Asp Pro Gly Glu Val Met Lys Ala Ile Ala
1 5 10 15 20
Asp Ile Glu Ala Tyr Pro Gln Trp Ile Ser Glu Tyr Lys Glu Val Glu Ile Leu Glu Ala Asp Asp Glu
25 30 35 40 45
Gly Tyr Pro Lys Arg Ala Arg Met Leu Met Asp Ala Ala Ile Phe Lys Asp Thr Leu Ile Met Ser
50 55 60 65
Tyr Glu Trp Pro Glu Asp Arg Gln Ser Leu Ser Trp Thr Leu Glu Ser Ser Ser Leu Leu Lys Ser Leu
70 75 80 85 90
Glu Gly Thr Tyr Arg Leu Ala Pro Lys Gly Ser Gly Thr Glu Val Thr Tyr Glu Leu Ala Val Asp
95 100 105 110
Leu Ala Val Pro Met Ile Gly Met Leu Lys Arg Lys Ala Glu Arg Arg Leu Ile Asp Gly Ala Leu Lys
115 120 125 130 135
Asp Leu Lys Lys Arg Val Glu Gly
140
<210>SEQ ID No 2
<211>354
<212>PRT
<213>38kD特异表位抗原肽段的氨基酸序列
<400>2
Ala Ala Gly Cys Gly Ser Lys Pro Pro Ser Gly Ser Pro Glu Thr Gly Ala Gly Ala Gly Thr Val
1 5 10 15 20
Ala Thr Thr Pro Ala Ser Ser Pro Val Thr Leu Ala Glu Thr Gly Ser Thr Leu Leu Tyr Pro Leu Phe
25 30 35 40 45
Asn Leu Trp Gly Pro Ala Phe His Glu Arg Tyr Pro Asn Val Thr Ile Thr Ala Gln Gly Thr Gly
50 55 60 65
Ser Gly Ala Gly Ile Ala Gln Ala Ala Ala Gly Thr Val Asn Ile Gly Ala Ser Asp Ala Tyr Leu Ser
70 75 80 85 90
Glu Gly Asp Met Ala Ala His Lys Gly Leu Met Asn Ile Ala Leu Ala Ile Ser Ala Gln Gln Val
95 100 105 110
Asn Tyr Asn Leu Pro Gly Val Ser Glu His Leu Lys Leu Asn Gly Lys Val Leu Ala Ala Met Tyr Gln
115 120 125 130 135
Gly Thr Ile Lys Thr Trp Asp Asp Pro Gln Ile Ala Ala Leu Asn Pro Gly Val Asn Leu Pro Gly
140 145 150 155
Thr Ala Val Val Pro Leu His Arg Ser Asp Gly Ser Gly Asp Thr Phe Leu Phe Thr Gln Tyr Leu Ser
160 165 170 175 180
Lys Gln Asp Pro Glu Gly Trp Gly Lys Ser Pro Gly Phe Gly Thr Thr Val Asp Phe Pro Ala Val
185 190 195 200
Pro Gly Ala Leu Gly Glu Asn Gly Asn Gly Gly Met Val Thr Gly Cys Ala Glu Thr Pro Gly Cys Val
205 210 215 220 225
Ala Tyr Ile Gly Ile Ser Phe Leu Asp Gln Ala Ser Gln Arg Gly Leu Gly Glu Ala Gln Leu Gly
230 235 240 245
Asn Ser Ser Gly Asn Phe Leu Leu Pro Asp Ala Gln Ser Ile Gln Ala Ala Ala Ala Gly Phe Ala Ser
250 255 260 265 270
Lys Thr Pro Ala Asn Gln Ala Ile Ser Met Ile Asp Gly Pro Ala Pro Asp Gly Tyr Pro Ile Ile
275 280 285 290
Asn Tyr Glu Tyr Ala Ile Val Asn Asn Arg Gln Lys Asp Ala Ala Thr Ala Gln Thr Leu Gln Ala Phe
295 300 305 310 315
Leu His Trp Ala Ile Thr Asp Gly Asn Lys Ala Ser Phe Leu Asp Gln Val His Phe Gln Pro Leu
320 325 330 335
Pro Pro Ala Val Val Lys Leu Ser Asp Ala Leu Ile Ala Thr Ile Ser Ser
340 345 350
<210>SEQ ID No 3
<211>41
<212>PRT
<213>ESAT-6特异表位抗原肽段的氨基酸序列
<400>3
His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly
1 5 10 15 20
Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn
25 30 35 40
<210>SEQ ID No 4
<211>37
<212>PRT
<213>CFP10特异表位抗原肽段的氨基酸序列
<400>4
Glu Ala Ala Asn Lys Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala
1 5 10 15 20
Gly Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser Ser
25 30 35
<210>SEQ ID No 5
<211>154
<212>PRT
<213>MPT64特异表位抗原肽段的氨基酸序列
<400>5
Pro Lys Thr Tyr Cys Glu Glu Leu Lys Gly Thr Asp Thr Gly Gln Ala Cys Leu Ile Gln Met Ser
1 5 10 15 20
Asp Pro Ala Tyr Asn Thr Asn Ile Ser Leu Pro Ser Tyr Tyr Pro Asp Gln Lys Ser Leu Glu Asn Tyr
25 30 35 40 45
Ile Ala Gln Thr Arg Asp Lys Phe Leu Ser Ala Ala Thr Ser Ser Thr Pro Arg Glu Ala Pro Tyr
50 55 60 65
Glu Leu Asn Ile Thr Ser Ala Thr Tyr Gln Ser Ala Ile Pro Pro Arg Gly Thr Gln Ala Val Val Leu
70 75 80 85 90
Lys Val Tyr Gln Asn Ala Gly Gly Thr His Pro Thr Thr Thr Tyr Lys Ala Phe Asp Trp Asp Gln
95 100 105 110
Ala Tyr Arg Lys Pro Ile Thr Tyr Asp Thr Leu Trp Gln Ala Asp Thr Asp Pro Leu Pro Val Val Phe
115 120 125 130 135
Pro Ile Val Gln Gly Glu Leu Ser Lys Gln Thr Gly Gln Gln Val Ser Ile Ala Pro
140 145 150
<210>SEQ ID No 6
<211>30
<212>PRT
<213>Mtb8特异表位抗原肽段的氨基酸序列
<400>6
Thr Ser Pro Thr Ser Trp Glu Gln Ala Ala Ala Glu Ala Val Gln Arg Ala Arg Asp Ser
1 5 10 15 20
Val Asp Asp Ile Arg Val Ala Arg Val Ile
25 30
<210>SEQ ID No 7
<211>64
<212>PRT
<213>Mtb8.4特异表位抗原肽段的氨基酸序列
<400>7
Ala Gly Val Ala Ser Ala Asp Pro Val Asp Ala Val Ile Asn Thr Thr Cys Asn Tyr Gly Gln Val
1 5 10 15 20
Val Ala Ala Leu Asn Ala Thr Asp Pro Gly Ala Ala Ala Gln Phe Asn Ala Ser Pro Val Ala Gln Ser
25 30 35 40 45
Tyr Leu Arg Asn Phe Leu Ala Ala Pro Pro Pro Gln Arg Ala Ala Met Ala Ala Gln
50 55 60
<210>SEQ ID No 8
<211>452
<212>PRT
<213>38kD-ESAT6-CFP10融合抗原的氨基酸序列
<400>8
Ala Ala Gly Cys Gly Ser Lys Pro Pro Ser Gly Ser Pro Glu Thr Gly Ala Gly Ala Gly Thr Val
1 5 10 15 20
Ala Thr Thr Pro Ala Ser Ser Pro Val Thr Leu Ala Glu Thr Gly Ser Thr Leu Leu Tyr Pro Leu Phe
25 30 35 40 45
Asn Leu Trp Gly Pro Ala Phe His Glu Arg Tyr Pro Asn Val Thr Ile Thr Ala Gln Gly Thr Gly
50 55 60 65
Ser Gly Ala Gly Ile Ala Gln Ala Ala Ala Gly Thr Val Asn Ile Gly Ala Ser Asp Ala Tyr Leu Ser
70 75 80 85 90
Glu Gly Asp Met Ala Ala His Lys Gly Leu Met Asn Ile Ala Leu Ala Ile Ser Ala Gln Gln Val
95 100 105 110
Asn Tyr Asn Leu Pro Gly Val Ser Glu His Leu Lys Leu Asn Gly Lys Val Leu Ala Ala Met Tyr Gln
115 120 125 130 135
Gly Thr Ile Lys Thr Trp Asp Asp Pro Gln Ile Ala Ala Leu Asn Pro Gly Val Asn Leu Pro Gly
140 145 150 155
Thr Ala Val Val Pro Leu His Arg Ser Asp Gly Ser Gly Asp Thr Phe Leu Phe Thr Gln Tyr Leu Ser
160 165 170 175 180
Lys Gln Asp Pro Glu Gly Trp Gly Lys Ser Pro Gly Phe Gly Thr Thr Val Asp Phe Pro Ala Val
185 190 195 200
Pro Gly Ala Leu Gly Glu Asn Gly Asn Gly Gly Met Val Thr Gly Cys Ala Glu Thr Pro Gly Cys Val
205 210 215 220 225
Ala Tyr Ile Gly Ile Ser Phe Leu Asp Gln Ala Ser Gln Arg Gly Leu Gly Glu Ala Gln Leu Gly
230 235 240 245
Asn Ser Ser Gly Asn Phe Leu Leu Pro Asp Ala Gln Ser Ile Gln Ala Ala Ala Ala Gly Phe Ala Ser
250 255 260 265 270
Lys Thr Pro Ala Asn Gln Ala Ile Ser Met Ile Asp Gly Pro Ala Pro Asp Gly Tyr Pro Ile Ile
275 280 285 290
Asn Tyr Glu Tyr Ala Ile Val Asn Asn Arg Gln Lys Asp Ala Ala Thr Ala Gln Thr Leu Gln Ala Phe
295 300 305 310 315
Leu His Trp Ala Ile Thr Asp Gly Asn Lys Ala Ser Phe Leu Asp Gln Val His Phe Gln Pro Leu
320 325 330 335
Pro Pro Ala Val Val Lys Leu Ser Asp Ala Leu Ile Ala Thr Ile Ser Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser
340 345 350 355 360
Gly Gly Gly Ser His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp
365 370 375 380
Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn
385 390 395 400 405
Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Glu Ala Ala Asn Lys Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu
410 415 420 425
Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu
430 435 440 445 450
Ser Ser
<210>SEQ ID No 9
<211>421
<212>PRT
<213>Mtb8.4-MPT64-Mtb16.3-Mtb8融合抗原的氨基酸序列
<400>9
Ala Gly Val Ala Ser Ala Asp Pro Val Asp Ala Val Ile Asn Thr Thr Cys Asn Tyr Gly Gln Val
1 5 10 15 20
Val Ala Ala Leu Asn Ala Thr Asp Pro Gly Ala Ala Ala Gln Phe Asn Ala Ser Pro Val Ala Gln Ser
25 30 35 40 45
Tyr Leu Arg Asn Phe Leu Ala Ala Pro Pro Pro Gln Arg Ala Ala Met Ala Ala Gln Ser Gly Gly
50 55 60 65
Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Pro Lys Thr Tyr Cys Glu Glu Leu Lys Gly Thr Asp Thr Gly Gln Ala
70 75 80 85 90
Cys Leu Ile Gln Met Ser Asp Pro Ala Tyr Asn Thr Asn Ile Ser Leu Pro Ser Tyr Tyr Pro Asp
95 100 105 110
Gln Lys Ser Leu Glu Asn Tyr Ile Ala Gln Thr Arg Asp Lys Phe Leu Ser Ala Ala Thr Ser Ser Thr
115 120 125 130 135
Pro Arg Glu Ala Pro Tyr Glu Leu Asn Ile Thr Ser Ala Thr Tyr Gln Ser Ala Ile Pro Pro Arg
140 145 150 155
Gly Thr Gln Ala Val Val Leu Lys Val Tyr Gln Asn Ala Gly Gly Thr His Pro Thr Thr Thr Tyr Lys
160 165 170 175 180
Ala Phe Asp Trp Asp Gln Ala Tyr Arg Lys Pro Ile Thr Tyr Asp Thr Leu Trp Gln Ala Asp Thr
185 190 195 200
Asp Pro Leu Pro Val Val Phe Pro Ile Val Gln Gly Glu Leu Ser Lys Gln Thr Gly Gln Gln Val Ser
205 210 215 220 225
Ile Ala Pro Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ala Asp Lys Thr Thr Gln Thr Ile Tyr
225 230 235 240
Ile Asp Ala Asp Pro Gly Glu Val Met Lys Ala Ile Ala Asp Ile Glu Ala Tyr Pro Gln Trp Ile Ser
250 255 260 265 270
Glu Tyr Lys Glu Val Glu Ile Leu Glu Ala Asp Asp Glu Gly Tyr Pro Lys Arg Ala Arg Met Leu
275 280 285 290
Met Asp Ala Ala Ile Phe Lys Asp Thr Leu Ile Met Ser Tyr Glu Trp Pro Glu Asp Arg Gln Ser Leu
295 300 305 310 315
Ser Trp Thr Leu Glu Ser Ser Ser Leu Leu Lys Ser Leu Glu Gly Thr Tyr Arg Leu Ala Pro Lys
320 325 330 335
Gly Ser Gly Thr Glu Val Thr Tyr Glu Leu Ala Val Asp Leu Ala Val Pro Met Ile Gly Met Leu Lys
340 345 350 355 360
Arg Lys Ala Glu Arg Arg Leu Ile Asp Gly Ala Leu Lys Asp Leu Lys Lys Arg Val Glu Gly Ser
365 370 375 380
Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Ser Pro Thr Ser Trp Glu Gln Ala Ala Ala Glu Ala Val
385 390 395 400 405
Gln Arg Ala Arg Asp Ser Val Asp Asp Ile Arg Val Ala Arg Val Ile
410 415 420
<210>SEQ ID No 10
<211>429
<212>DNA
<213>Mtb16.3特异表位抗原肽段的编码DNA序列
<400>10
gcggacaaga cgacacagac gatttacatc gacgcggatc caggcgaggt gatgaaggcg 60
atcgccgaca tcgaagccta cccgcaatgg atttcggagt ataaggaagt cgagatccta 120
gaggccgacg acgagggcta cccgaaacga gcgcgaatgt tgatggacgc agccatcttc 180
aaagacacct tgatcatgtc ctacgagtgg ccggaagacc gccaatcgct tagctggact 240
ctcgaatcca gctcgctgct aaagtccctc gaaggcacgt atcgcttggc gcccaagggt 300
tctggcactg aggtcaccta cgagcttgcc gtcgaccttg ctgtccccat gatcgggatg 360
ctcaagcgta aggcggaacg caggttgata gacggcgcgt tgaaggatct gaagaaacga 420
gtcgagggc
<210>SEQ ID No 11
<211>1062
<212>DNA
<213>38kD特异表位抗原肽段的编码DNA序列
<400>11
gcggcgggct gtggctcgaa accaccgagc ggttcgcctg aaacgggcgc cggcgccggt 60
actgtcgcga ctacccccgc gtcgtcgccg gtgacgttgg cggagaccgg tagcacgctg 120
ctctacccgc tgttcaacct gtggggtccg gcctttcacg agaggtatcc gaacgtcacg 180
atcaccgctc agggcaccgg ttctggtgcc gggatcgcgc aggccgccgc cgggacggtc 240
aacattgggg cctccgacgc ctatctgtcg gaaggtgata tggccgcgca caaggggctg 300
atgaacatcg cgctagccat ctccgctcag caggtcaact acaacctgcc cggagtgagc 360
gagcacctca agctgaacgg aaaagtcctg gcggccatgt accagggcac catcaaaacc 420
tgggacgacc cgcagatcgc tgcgctcaac cccggcgtga acctgcccgg caccgcggta 480
gttccgctgc accgctccga cgggtccggt gacaccttct tgttcaccca gtacctgtcc 540
aagcaagatc ccgagggctg gggcaagtcg cccggcttcg gcaccaccgt cgacttcccg 600
gcggtgccgg gtgcgctggg tgagaacggc aacggcggca tggtgaccgg ttgcgccgag 660
acaccgggct gcgtggccta tatcggcatc agcttcctcg accaggccag tcaacgggga 720
ctcggcgagg cccaactagg caatagctct ggcaatttct tgttgcccga cgcgcaaagc 780
attcaggccg cggcggctgg cttcgcatcg aaaaccccgg cgaaccaggc gatttcgatg 840
atcgacgggc ccgccccgga cggctacccg atcatcaact acgagtacgc catcgtcaac 900
aaccggcaaa aggacgccgc caccgcgcag accttgcagg catttctgca ctgggcgatc 960
accgacggca acaaggcctc gttcctcgac caggttcatt tccagccgct gccgcccgcg 1020
gtggtgaagt tgtctgacgc gttgatcgcg acgatttcca gc 1062
<210>SEQ ID No 12
<211>123
<212>DNA
<213>ESAT-6特异表位抗原肽段的编码DNA序列
<400>12
cattccctcc ttgacgaggg gaagcagtcc ctgaccaagc tcgcagcggc ctggggcggt 60
agcggttcgg aggcgtacca gggtgtccag caaaaatggg acgccacggc taccgagctg 120
aac
<210>SEQ ID No 13
<211>111
<212>DNA
<213>CFP10特异表位抗原肽段的编码DNA序列
<400>13
gaagcagcca ataagcagaa gcaggaactc gacgagatct cgacgaatat tcgtcaggcc 60
ggcgtccaat actcgagggc cgacgaggag cagcagcagg cgctgtcctc g 111
<210>SEQ ID No 14
<211>462
<212>DNA
<213>MPT64特异表位抗原肽段的编码DNA序列
<400>14
cccaagacct actgcgagga gttgaaaggc accgataccg gccaggcgtg cctgattcaa 60
atgtccgacc cggcctacaa caccaacatc agcctgccca gttactaccc cgaccagaag 120
tcgctggaaa attacatcgc ccagacgcgc gacaagttcc tcagcgcggc aacatcgtcc 180
actccacgcg aagcccccta cgaattgaat atcacctcgg ccacatacca gtccgcgata 240
ccaccgcgtg gtacgcaggc cgtggtgctc aaggtctacc agaatgccgg cggcacgcac 300
ccaacgacca cgtacaaggc cttcgattgg gaccaggctt atcgcaagcc aatcacctat 360
gacacgctgt ggcaggctga caccgatccg ctgccagtcg tcttccccat tgtgcaaggt 420
gaactgagca agcagaccgg acaacaggta tcgatagcgc cg 462
<210>SEQ ID No 15
<211>90
<212>DNA
<213>Mtb8特异表位抗原肽段的编码DNA序列
<400>15
accagcccca catcctggga acaggcggcg gcggaggcgg tccagcgggc gcgggatagc 60
gtcgatgaca tccgcgtcgc tcgggtcatt 90
<210>SEQ ID No 16
<211>192
<212>DNA
<213>Mtb8.4特异表位抗原肽段的编码DNA序列
<400>16
gccggggtcg cctccgcaga tcccgtggac gcggtcatta acaccacctg caattacggg 60
caggtagtag ctgcgctcaa cgcgacggat ccgggggctg ccgcacagtt caacgcctca 120
ccggtggcgc agtcctattt gcgcaatttc ctcgccgcac cgccacctca gcgcgctgcc 180
atggccgcgc aa 192
<210>SEQ ID No 17
<211>1356
<212>DNA
<213>38kD-ESAT6-CFP10融合抗原的编码DNA序列
<400>17
gcggcgggct gtggctcgaa accaccgagc ggttcgcctg aaacgggcgc cggcgccggt 60
actgtcgcga ctacccccgc gtcgtcgccg gtgacgttgg cggagaccgg tagcacgctg 120
ctctacccgc tgttcaacct gtggggtccg gcctttcacg agaggtatcc gaacgtcacg 180
atcaccgctc agggcaccgg ttctggtgcc gggatcgcgc aggccgccgc cgggacggtc 240
aacattgggg cctccgacgc ctatctgtcg gaaggtgata tggccgcgca caaggggctg 300
atgaacatcg cgctagccat ctccgctcag caggtcaact acaacctgcc cggagtgagc 360
gagcacctca agctgaacgg aaaagtcctg gcggccatgt accagggcac catcaaaacc 420
tgggacgacc cgcagatcgc tgcgctcaac cccggcgtga acctgcccgg caccgcggta 480
gttccgctgc accgctccga cgggtccggt gacaccttct tgttcaccca gtacctgtcc 540
aagcaagatc ccgagggctg gggcaagtcg cccggcttcg gcaccaccgt agacttcccg 600
gcggtgccgg gtgcgctggg tgagaacggc aacggcggca tggtgaccgg ttgcgccgag 660
acaccgggct gcgtggccta tatcggcatc agcttcctcg accaggccag tcaacgggga 720
ctcggcgagg cccaactagg caatagctct ggcaatttct tgttgcccga cgcgcaaagc 780
attcaggccg cggcggctgg cttcgcatcg aaaaccccgg cgaaccaggc gatttcgatg 840
atcgacgggc ccgccccgga cggctacccg atcatcaact acgagtacgc catcgtcaac 900
aaccggcaaa aggacgccgc caccgcgcag accttgcagg catttctgca ctgggcgatc 960
accgacggca acaaggcctc gttcctcgac caggttcatt tccagccgct gccgcccgcg 1020
gtggtgaagt tgtctgacgc gttgatcgcg acgatttcca gctctggtgg cggtagtagc 1080
ggcggcggta gccattccct ccttgacgag gggaagcagt ccctgaccaa gctcgcagcg 1140
gcctggggcg gtagcggttc ggaggcgtac cagggtgtcc agcaaaaatg ggacgccacg 1200
gctaccgagc tgaacagtgg cggtggctct tccggtggtg gctctgaagc agccaataag 1260
cagaagcagg aactcgacga gatctcgacg aatattcgtc aggccggcgt ccaatactcg 1320
agggccgacg aggagcagca gcaggcgctg tcctcg 1356
<210>SEQ ID No 18
<211>1263
<212>DNA
<213>Mtb8.4-MPT64-Mtb16.3-Mtb8融合抗原的编码DNA序列
<400>18
ccggggtcgc ctccgcagat cccgtggacg cggtcattaa caccacctgc aattacgggc 60
aggtagtagc tgcgctcaac gcgacggatc cgggggctgc cgcacagttc aacgcctcac 120
cggtggcgca gtcctatttg cgcaatttcc tcgccgcacc gccacctcag cgcgctgcca 180
tggccgcgca atccggcggt ggtagctctg gtggcggctc ccccaagacc tactgcgagg 240
agttgaaagg caccgatacc ggccaggcgt gcctgattca aatgtccgac ccggcctaca 300
acaccaacat cagcctgccc agttactacc ccgaccagaa gtcgctggaa aattacatcg 360
cccagacgcg cgacaagttc ctcagcgcgg caacatcgtc cactccacgc gaagccccct 420
acgaattgaa tatcacctcg gccacatacc agtccgcgat accaccgcgt ggtacgcagg 480
ccgtggtgct caaggtctac cagaatgccg gcggcacgca cccaacgacc acgtacaagg 540
ccttcgattg ggaccaggct tatcgcaagc caatcaccta tgacacgctg tggcaggctg 600
acaccgatcc gctgccagtc gtcttcccca ttgtgcaagg tgaactgagc aagcagaccg 660
gacaacaggt atcgatagcg ccgtctggtg gcggtagtag cggcggcggt agcgcggaca 720
agacgacaca gacgatttac atcgacgcgg atccaggcga ggtgatgaag gcgatcgccg 780
acatcgaagc ctacccgcaa tggatttcgg agtataagga agtcgagatc ctagaggccg 840
acgacgaggg ctacccgaaa cgagcgcgaa tgttgatgga cgcagccatc ttcaaagaca 900
ccttgatcat gtcctacgag tggccggaag accgccaatc gcttagctgg actctcgaat 960
ccagctcgct gctaaagtcc ctcgaaggca cgtatcgctt ggcgcccaag ggttctggca 1020
ctgaggtcac ctacgagctt gccgtcgacc ttgctgtccc catgatcggg atgctcaagc 1080
gtaaggcgga acgcaggttg atagacggcg cgttgaagga tctgaagaaa cgagtcgagg 1140
gcagtggcgg tggctcttcc ggtggtggct ctgaccagcc ccacatcctg ggaacaggcg 1200
gcggcggagg cggtccagcg ggcgcgggat agcgtcgatg acatccgcgt cgctcgggtc 1260
att