一种利用糖蜜高效培养光合细菌的方法.pdf

本发明提供了一种利用糖蜜作为碳源之一高效培养光合细菌的方法。在光合细菌厌氧发酵培养过程中，以有机酸盐作为主要碳源的基础上，在培养基中添加0.25g/L～2.00g/L的糖蜜，使培养物pH值稳定在适宜光合细菌生长的范围，提高培养的光合细菌细胞浓度，补充光合细菌生长所需碳源。使培养获得的光合细菌生物量提高了77％，在利用蔗糖生产的副产物糖蜜和培养超高细胞浓度光合细菌的产业化生产方面具有重要的应用价值。

1.  一种利用糖蜜高效培养光合细菌的方法，其特征在于：在光合细菌厌氧发酵培养过程中，以有机酸盐作为主要碳源的基础上，在培养基中添加0.25g/L～2.00g/L的糖蜜，使培养物pH值稳定在适宜光合细菌生长的范围，补充光合细菌生长所需碳源，提高培养的光合细菌细胞浓度。

2.  根据权利要求1所述的利用糖蜜高效培养光合细菌的方法，其特征在于：在以有机酸盐为主要碳源的光合细菌液体培养基中，添加0.25g/L～1.00g/L的糖蜜。

3.  根据权利要求1所述的利用糖蜜高效培养光合细菌的方法，其特征在于：在以有机酸盐为主要碳源的光合细菌液体培养基中，添加1.00g/L的糖蜜。

一种利用糖蜜高效培养光合细菌的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是提供了一种利用糖蜜作为混合碳源成分之一培养超高细胞浓度光合细菌的方法，在产业化高效培养光合细菌方面具有重要应用价值。
背景技术
光合细菌(Photosynthetic Bacteria)是一大类能在厌氧光照条件下进行不产氧光合作用的原核生物的总称，属于革兰阴性菌，分为红螺菌科(Rhodospirillaceae)、着色菌科(Chromatiaceae)、绿菌科(Chlorobiaceae)和绿色丝状菌科(Chloroflexaceae)4个科，菌细胞主要分为杆状和球形2种不同形态，是地球生命起源的先锋物种之一，其中红假单胞菌(Rhodopseudomonas)和紫色无硫菌(Rhodospirillaceae)是产业化生产较多的光合细菌种类。光合细菌的蛋白质含量高达60％以上，同时富含可以作为细胞代谢激活剂和天然抗氧化剂的辅酶Q10(泛醌)及具有抗癌作用的类胡萝卜素，具有重要的营养和药用价值。目前，光合细菌在作为畜禽饲料添加剂促进动物生长、处理高浓度有机废水、水产养殖水质的净化和农业高效活性菌肥等方面都发挥了越来越重要的作用。
国内外研究现状显示，目前光合细菌主要有动态和静置2种培养方式，培养装置有开放和密闭2种类型。国外有采用透光的密闭式光生物反应器动态连续培养光合细菌的报道，但在国内多采用玻璃缸和塑料桶在光照下静置密闭培养。动态密闭培养一般在透光的反应器内进行，为了保持培养物能够得到充分的光照，通过泵使光合细菌液体培养物流过螺旋透光的玻璃管。对于静置封闭培养光合细菌的规模生产工艺一般分为四级培养，分别是一级试管种的转接和纯化；二级锥形瓶培养，培养体积1～5升；三级扩大培养，培养体积25～50升；四级扩大培养，培养体积为100～1500升。
对于光合细菌的培养基，一般包含了含碳、氮和磷等化合物，因为碳占光合细菌干重的50％左右，因此培养基组成中含碳化合物的选择与确定在光合细菌培养中占有非常重要的地位。目前在国内外光合细菌培养中，一般采用乙酸钠等有机酸盐作为光合细菌培养的主要有机碳源。尽管有机酸盐可以作为光合细菌生长的较好碳源，可以支持光合细菌的快速生长，但随着光合细菌对有机酸盐的利用，必然使培养物的pH急剧上升，而过高的pH会明显抑制光合细菌的持续生长，从而导致我国企业生产的光合细菌细胞浓度一般仅维持在30亿/毫升左右，是限制光合细菌达到快速可持续生长的一个重要原因。因此研究确定既可以支持光合细菌快速生长，同时又能够保持培养物pH稳定的碳源，是获得超高细胞浓度光合细菌的重要课题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用糖蜜作为培养光合细菌的混合碳源之一，以大幅度提高光合细菌细胞浓度的方法。
一种利用糖蜜高效培养光合细菌的方法，是在光合细菌厌氧发酵培养过程中，以有机酸盐作为主要碳源培养光合细菌的基础上，在培养基中添加0.25g/L～2.00g/L的糖蜜，作为支持光合细菌生长混合碳源之一，使培养物pH值稳定在适宜光合细菌生长的范围，补充光合细菌生长所需碳源，大幅度提高了培养的光合细菌细胞浓度。
所述的利用糖蜜高效培养光合细菌的方法，是在以有机酸盐作为主要碳源的光合细菌液体培养基中添加0.25g/L～1.00g/L的糖蜜。添加糖蜜量从0.25g/L到1.00g/L范围内不仅能够维持适宜光合细菌生长的pH范围，而且可以补充光合细菌生长的碳源。
本发明的工作原理是：采用有机酸盐作为光合细菌生长的碳源时，有机酸盐中的碳被利用，而没有被利用的金属阳离子必然消耗阴离子使氢离子浓度升高，即导致培养物的pH升高，因此抑制了光合细菌的进一步生长。而主要含有蔗糖的糖蜜在厌氧条件下，通过光合细菌的代谢可以转化为有机酸，导致培养物pH降低。因此在利用有机酸盐作为碳源的同时，添加一定浓度的糖蜜不仅可以为光合细菌提供碳源促进其生长，而且可以减缓因光合细菌利用有机酸盐而引起的pH过快上升对光合细菌生长的抑制。
本发明的优点在于：利用生产蔗糖的副产物糖蜜作为培养光合细菌的碳源之一，不仅可以在一定程度上缓解了因利用有机酸盐导致培养物pH升高过快而对光合细菌生长产生的抑制作用，而且为光合细菌的生长提供了碳源，培养获得了超高细胞浓度的光合细菌。
附图说明
图1是本发明在乙酸钠作为碳源之一条件下，添加不同浓度糖蜜作为补充碳源对沼泽红假单胞菌生长效应的示意图。
图2是本发明在乙酸钠作为碳源之一条件下，添加不同浓度糖蜜作为补充碳源时培养物pH的变化示意图。
具体实施方式
图1是本发明在乙酸钠作为碳源之一条件下，添加不同浓度糖蜜作为补充碳源对沼泽红假单胞菌生长效应的示意图。其中，横坐标为时间，单位：天；纵坐标为代表沼泽红假单胞菌生长的光密度值(OD_500nm)。由图中显示出：在为期6天的实验中，不添加糖蜜、添加0.25g/L糖蜜和添加0.50g/L糖蜜组沼泽红假单胞菌在前3天内均呈现明显的生长趋势，沼泽红假单胞菌的生物量随糖蜜浓度的增加而增加，而3天以后沼泽红假单胞菌的生长基本呈现停止状态。当糖蜜添加量为1.00g/L时，沼泽红假单胞菌在前5天内一直维持很高的生长速度，在实验结束的第6天培养物OD_500nm达到了最高值9.78，比不添加糖蜜实验组的沼泽红假单胞菌生物量提高了77％。而进一步加大糖蜜添加量为2.00g/L时，沼泽红假单胞菌生长缓慢，在实验结束的第6天OD_500nm仅为2.82。
图2是本发明在乙酸钠作为碳源之一条件下，添加不同浓度糖蜜作为补充碳源时培养物pH的变化示意图。其中，横坐标为时间，单位：天；纵坐标为pH。由图中显示出：当沼泽红假单胞菌培养物的初始pH都在8.0时，实验第2天，不添加糖蜜组pH增加到可以抑制沼泽红假单胞菌生长的8.7，添加糖蜜量从0.25g/L到1.00g/L组的pH范围维持在适宜沼泽红假单胞菌生长的8.3到7.0之内，添加糖蜜量为2.00g/L组pH降低到不适宜沼泽红假单胞菌生长的6.6。实验2天以后所有添加和不添加糖蜜实验组的pH均呈现不同程度的增加趋势，不添加糖蜜组、添加糖蜜量0.25g/L和0.50g/L在实验第3天pH均增加到9.3左右，而添加1.00g/L糖蜜组pH的升高速率却非常缓慢，在实验结束的第6天pH才达到8.7，添加2.00g/L糖蜜组pH略微有所升高，但不超过6.8。
下面根据图1、图2，结合实施例对本发明详述如下：
首先配制光合细菌的基础培养基，其组成为(g/L)：乙酸钠3.0，NH₄Cl 1.0，KH₂PO₄ 0.5，MgSO₄ 7H₂O 0.2，NaCl 5.0，酵母粉0.8，微量元素液1.0ml/L。微量元素液包括(mg/L)：FeCl₃ 6H₂O 5.0，CuSO₄ 5H₂O0.05，H₃BO₃ 1.0，MnCl₂ 4H₂O 0.05，ZnSO₄ 7H₂O 1.0，CoCl₂ 6H₂O 0.5。用去离子水配制微量元素液和基础培养基后，分别添加糖蜜0、0.25、0.50、1.00和2.00g/L。将配制好的光合细菌培养基放入500mL玻璃瓶内在121℃下进行高温高压灭菌20分钟，待培养基冷却至室温，在洁净工作台无菌条件下接种沼泽红假单胞菌。接种后的培养物放入培养箱，在温度30℃，白炽灯光照强度3000lux下进行连续光照培养，研究确定在乙酸钠为碳源的基础上，添加糖蜜作为补充碳源对沼泽红假单胞菌生长的效应。经过6天的培养，沼泽红假单胞菌生长曲线结果见附图1，培养物pH的变化见附图2。
图1和图2的研究结果表明，在乙酸钠和糖蜜同时存在下，沼泽红假单胞菌首先利用糖蜜中的糖类进行发酵产生有机酸导致pH降低，因此减缓了沼泽红假单胞菌后期利用乙酸钠时导致的pH过快升高。在有机酸盐作为主要碳源的情况下，添加糖蜜量从0.25g/L到1.00g/L范围内不仅能够维持适宜沼泽红假单胞菌生长的pH范围，而且可以补充沼泽红假单胞菌生长的碳源，培养物最高OD_500nm达9.78，比对照不加糖蜜沼泽红假单胞菌生物量提高77％，在利用生产蔗糖的废弃物糖蜜和培养超高细胞浓度光合细菌的产业化生产上具有非常重要的意义和应用价值。