一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的生产方法.pdf

本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)生产及收获方法，包括以下步骤：在转瓶中培养Marc-145细胞，待细胞长成单层后，去掉生长液，按照0.01个感染复数(MOI：multiplicity?of?infection)接种PRRSV，37℃吸附1h，加入DMEM作为维持液进行病毒扩繁，置37℃恒温室转瓶机上旋转培养72～84h，当出现75％～80％细胞病变(CPE)时，直接收集上清，即获得PRRSV。本发明减少了粗制抗原中的过敏源，提高了疫苗质量；同时，Marc-145细胞出现CPE的时间与工艺改进前一致，但缩短了病毒收获时间。

1.  一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的生产方法，包括以下步骤：用生长液在转瓶中培养宿主细胞，待长成单层细胞后去掉生长液，接种适量PRRSV，加入维持液进行病毒扩繁，其特征在于：所述的维持液为DMEM培养液。

2.  如权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所培养的宿主细胞为Marc-145。

3.  如权利要求2所述的生产方法，其特征在于：所述的病毒扩繁至宿主细胞出现75％~80％细胞病变时，直接收集上清，即获得猪繁殖与呼吸综合征病毒。

4.  如权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述的生长液为添加10％新生牛血清的DMEM培养液。

5.  如权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于：所述的接种量为0.01个感染复数。

6.  如权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于：所述的扩繁过程是在37℃下培养72~84h。

7.  如权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于：在整个培养过程中是在8rph的转速下进行的。

一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的生产方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种病毒培养方法。
背景技术
繁殖与呼吸综合征(PRRS)自1987年在美国被发现以来，几乎已扩散到全球所有养猪业发达的国家和地区，临床症状以母猪繁殖障碍及仔猪呼吸系统疾病为主要特征。高致病性猪蓝耳病，即是由猪繁殖与呼吸综合征(俗称蓝耳病)病毒变异株引起的一种急性高致病性疫病，该病已经给世界养猪业造成巨大经济损失。有效的疫苗免疫是控制该病的重要措施，为大量制备病毒抗原，必须获得足够的病毒。通常采用在细胞上增殖的方式扩繁病毒。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)对细胞有严格的选择性，其中Marc-145细胞是近年来应用较多的细胞，该细胞适应范围广，对PRRSV敏感性强，病毒可以达到较高滴度，因而得到广泛应用。但PRRSV的滴度受到多重因素的影响，其中细胞培养是病毒增殖的前提，细胞培养的质量决定着病毒毒价的高低。
目前，国内生产PRRSV主要采用转瓶技术培养Marc-145细胞，待其贴壁长满后，弃去生长液，接种PRRSV种子，添加含2％新生牛血清的DMEM培养液作为细胞维持液，在37℃下培养，当感染细胞出现75％~80％细胞病变(CPE)时，将转瓶置于(-20℃)冰箱或冷库中，待其完全结冰后取出解冻，解冻过程中不断转动转瓶，使冰块刮落贴壁的细胞，等冰块完全溶解后再冻存于冷库中，如此反复冻融三次后收集病毒液。当前猪蓝耳病病毒(PRRSV)培养使粗制抗原中残留有大量牛血清等过敏源，给疫苗的使用带来一定的安全隐患。另外，病毒液收获所需时间长、程序比较繁琐造成工人劳动强度大。因此，亟待对目前的PRRSV生产及收获方法进行改进。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种节约成本、安全可靠的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)生产及收获方法。
本发明通过以下方案实现上述目的。
一种猪繁殖与呼吸综合征病毒生产及收获方法，包括以下步骤：以添加10％新生牛血清的DMEM作为生长培养基培养宿主细胞，去掉生长液后，接种一定量的PRRSV，37℃吸附1h，加入维持液进行病毒扩繁，其特征在于：所述的维持液为不添加血清的DMEM培养液。当病毒扩繁至宿主细胞出现75％~80％病变时，收集上清，即获得猪繁殖与呼吸综合征病毒。
所述的宿主细胞为Marc-145，整个培养过程在转瓶机中进行。Marc-145细胞是上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞(MA-104细胞)克隆而得到，可连续培养。细胞的培养过程应注意：1)细胞没有支原体等外源因子的感染。2)培养液的pH值可在7.0~7.3，以7.2为佳。3)一般按1∶2传代，细胞接种密度为1～1.5×10⁵cells/ml，48h后长成单层。4)培养基和血清的质量可靠、稳定；建议采用特级新生牛血清。5)细胞及时传代，不可以在老化后传代，一般在刚长成细胞单层时进行传代、扩增。6)细胞传代时消化液用0.25％胰蛋白酶+0.03％EDTA，消化过程应尽量缩短在1～2分钟内完成。
所述的接种是按0.01个感染复数(MOI：multiplicity of infection)接种PRRSV。
PRRS病毒感染Marc-145细胞过程可大致分为两个感染阶段，第一阶段：病毒感染细胞后的20～22h左右，仅部分细胞被随机感染，而且Marc-145细胞对PRRS病毒的低感染性(low permissiveness)与MOI量无关，因为MOI剂量比常规量提高100倍，感染22h后，仍仅5.5％的细胞呈PRRSV阳性(PRRSV-positive)。第二阶段：感染后的48~72h(也称为病毒的对数感染期)，病毒感染蔓延是通过相邻细胞和细胞之间的接触感染，细胞对自由病毒不敏感(Cells is nonpermissive to free Virus)，并出现了感染细胞群。可以采用适当低量的MOI进行病毒感染，比如0.01virus/cell；同时，大部分细胞在维持期的第一天尚需继续生长，而且病毒在48~84h才是感染、增殖的高峰，较长的病毒维持期均需要供给丰富的营养物资。
传代细胞培养中所用的细胞生长液为商品化的Gibco 31600034DMEM培养基加入10％新生牛牛血清和1％双抗(青霉素和链霉素)。使用DMEM培养基前，按说明书要求配成10L溶液，用NaHCO₃溶液调整PH值至7.2，用0.22μm滤膜正压过滤除菌，除菌后培养基置2℃～8℃避光保存。
传代细胞培养中所用的细胞维持液为商品化的Gibco 31600034DMEM培养基。
所述的病毒扩繁过程是在37℃下，转瓶机中旋转培养72~84h。所用的维持液为DMEM培养液，pH为7.4～7.8；后期维持pH会慢慢降下来。细胞病变时间出现在接毒后48h，72～84h细胞病变达75％左右，当细胞出现75％~80％以上CPE时，即可开始收毒。细胞的病变现象为：细胞空泡化、圆缩、先灶状脱落，再大片脱落，最后整个细胞裂解、破碎。
本发明最重要的改进在于维持液和收毒工艺的改进。
DMEM是常用的细胞培养液，在现有的通用技术中，也一直认为添加2％小牛血清的DMEM培养液作为细胞维持液，对PRRSV的扩繁效果更好。但是，目前的培养工艺容易导致粗制抗原中残留一定浓度的牛血清蛋白，而牛血清蛋白是一种过敏源，可引起疫苗接种动物出现过敏反应。另外，病毒液收获所需时间较长、程序繁琐且工人劳动强度大。
本发明创造性地将细胞维持液进行了调整，通过改变维持培养液的营养配比，尽量减少过敏源的产生，同时并不会影响病毒的扩繁速率。另外，通过对病毒液收获方式的改进而达到节省生产成本、降低劳动强度和提高生产效率的目的。本发明的所提供的生产方法，其病毒的收毒工艺大大简化，大量试验表明，本发明所提供的方法只需要在细胞培养出现75％～80％CPE时，取出上清液，即可以获得与传统方法繁琐的反复冻融后获得的病毒含量相当。在工艺改进前，收获病毒液要经过-20℃/常温的反复冻融过程，此过程一般需2~3天，每天冻融细胞均须1名工人进行细胞的冻融工作。由于15000ml细胞转瓶体积较大，为玻璃制品，稍有不慎容易破裂，因此从-20℃取放的过程中须轻拿轻放，而且在解冻过程中须不断转动转瓶，员工劳动强度较大。工艺改进后，直接收获细胞上清病毒液，不需反复冻融过程，便可进入下一流程，节省2天冻融时间，大大提高了工作效率。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明方法所生产的PRRSV，减少了粗制抗原中的过敏源，大大降低了由其获得的抗原引起的过敏反应，提高了疫苗的质量；同时，Marc-145细胞出现CPE的时间与工艺改进前一致，对扩繁的效率不会产生负面影响，收获的病毒液活毒含量差异不大，且毒价保持稳定。
2、本发明所提供的方法避免了收毒工艺中费时费力的反复冻融过程，缩短工艺流程，降低劳动强度。
3、本发明所提供的方法不仅节省了牛血清采购费用，还节省了病毒液收获过程反复冻融等操作，时间缩短了2～3天，降低了工人的劳动强度，提升车间的生产能力，即节省成本，又增强效能。
4、本发明所提供的方法节省-20℃冰柜、冷库及其产生的相关费用，改善车间内的拥挤状况并提高车间内整洁度。工艺改进后，通过车间的合理调整，生产环境变得安静、宽敞、整洁。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
试验组：在1700mL转瓶和15000mL转瓶中，加入DMEM(高糖型，含4500mg/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110mg/L丙酮酸钠，不含碳酸氢钠)+10％新生牛血清+1％双抗(青霉素和链霉素)作为培养液培养Marc-145细胞；转瓶中细胞长成单层后，弃瓶内细胞生长液，按0.01个感染复数接种PRRSV，37℃吸附1h，加入DMEM培养液作为维持液，置37℃恒温室转瓶机上旋转培养75h。当Marc-145细胞出现75％~80％CPE时，收集细胞上清即收获病毒。用96孔板测定半数组织培养感染剂量(TCID₅₀)。
同时设置对照组，维持液为DMEM加2％小牛血清，其他操作及条件如试验组。
各生产4批PRRSV，试验组和对照组各取5个转瓶样品按要求取样进行毒价测定。以t检验方法比较不同处理对病毒毒价影响的差异性，结果见表1和表2。
表1：不同的细胞维持液在1700mL转瓶中培养的PRRSV滴度(单位：-lgTCID₅₀/mL)

注：(1)A、为细胞维持液中含2％新生牛血清+DMEM培养基培养的PRRSV滴度；
B、为细胞维持液中仅含DMEM培养基培养的PRRSV滴度；
(2)右上角字母a相同表示两者t检验差异不显著(P＞0.05)；
(3)新生牛血清为兰州荣晔生物科技有限责任公司产品；DMEM培养基为GIBCO公司产品。
表2：不同的细胞维持液在15000mL转瓶中培养的PRRSV滴度(单位：-lgTCID₅₀/mL)

注：(1)A为细胞维持液中含2％新生牛血清+DMEM培养基培养的PRRSV滴度；
B为细胞维持液中仅含DMEM培养基培养的PRRSV滴度；
(2)右上角字母a相同表示两者t检验差异不显著(P＞0.05)。
试验结果表明，细胞维持液中含2％血清培养的病毒滴度与不含血清培养的病毒滴度差异不大，不会影响疫苗的质量，而且节省了物料成本采购的费用，减少了新生牛血清(异源蛋白)带来的应激反应和过敏反应，从而提高了疫苗的质量。
实施例2
试验组：在1700mL转瓶和15000mL转瓶中，加入DMEM(高糖型，含4500mg/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110mg/L丙酮酸钠，不含碳酸氢钠)+10％新生牛血清+1％双抗(青霉素和链霉素)作为培养液培养Marc-145细胞；转瓶中细胞长成单层后，弃瓶内细胞生长液，按0.01个感染复数接种PRRSV，37℃吸附1h，加入DMEM培养液作为维持液，置37℃恒温室转瓶机上旋转培养78h。当Marc-145细胞出现75％~80％CPE时，收集细胞上清，即获得PRRSV。
对照组：同试验组，但收集上清液后，放至冰柜中反复冻融3次，获得PRRSV。
同一批次的2瓶细胞至收获时间时，取适量(测毒价用)病毒上清液作待测样品，然后将转瓶放至冰柜中反复冻融3次后取样检测病毒含量；另2瓶细胞至收获时间时，取完所有上清液并取样检测病毒含量。各生产6批PRRSV，每批次随机取4个样品进行毒价测定，具体操作如下：试验组中收集的细胞上清液直接取样检测；在剩下的转瓶内加入适量PBS，将转瓶放至冰柜中反复冻融后取样待测。对照组中收集的上清液反复冻融后取样待测。
试验结果如表3、表4所示，细胞上清液中的病毒含量与反复冻融后的病毒含量相当。
表3：1700mL转瓶中不同PRRSV收获方法对病毒毒价的影响(毒价单位：-lgTCID₅₀/mL)

注：(1)A表示上清液病毒毒价；B表示冻融后病毒毒价；C表示取完上清液后细胞病毒毒价
(2)右上角字母a相同者表示差异不显著(P＞0.05)，字母不同表示差异显著(P＜0.05)
表4：15000mL转瓶中不同PRRSV收获方法对病毒毒价的影响(毒价单位：-lgTCID₅₀/mL)

注：(1)A表示上清液病毒毒价；B表示冻融后病毒毒价；C表示取完上清液后细胞病毒毒价
(2)右上角字母a相同者表示差异不显著(P＞0.05)，字母不同表示差异显著(P＜0.05)
运用大转瓶培养Marc-145细胞以增殖PRRSV，通过冻融法裂解细胞，使病毒充分释放出来。从以上的试验结果可以看出，直接收集病毒上清液的病毒含量与反复冻融后的病毒含量差异不显著，且在制苗过程中省去了反复冻融的过程，提高了工作效率，提升了整个车间的生产能力。