一种利用三维荧光原位杂交检测单卵裂球中染色体的方法.pdf

本发明提供了一种利用三维荧光原位杂交检测单卵裂球中染色体的方法。本发明所提供的方法，是在体积为50微升以下的液滴环境中进行三维荧光原位杂交。应用本发明的方法进行检测，在保持卵裂球胞膜完整的前提下，不仅可以得到染色体的数目及结构，而且可以观察到染色体在核内的空间位置，还可以降低卵裂球丢失率、获得的信号清晰、探针使用量仅为0.05-0.08μl，方法简单、高效。

1.  利用三维荧光原位杂交检测单卵裂球中染色体的方法，是在体积为50微升以下的液滴环境中进行三维荧光原位杂交。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
1)用多聚甲醛对单卵裂球进行固定；
2)将固定后的单卵裂球进行透膜处理；
3)将透膜处理后的单卵裂球进行去蛋白处理；
4)将去蛋白处理后的单卵裂球与探针进行杂交。

3.  如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，将单卵裂球在10微升-50微升的液滴A中进行固定；所述液滴A中含有体积百分含量为2％-4％的多聚甲醛。

4.  如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中的透膜处理包括如下步骤：将单卵裂球依次置于10微升-50微升的液滴B、10微升-50微升的液滴C中进行处理；然后将单卵裂球在液氮中进行冻融；所述液滴B中含有体积百分含量为0.4％-1.0％的TritonX-100；所述液滴C中含有体积百分含量为15％-25％的甘油。

5.  如权利要求2至4中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中的去蛋白处理包括如下步骤：将单卵裂球置于10微升-50微升的液滴D中进行处理；所述液滴D含有浓度为0.08-0.12M的HCl。

6.  如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤3)还包括将单卵裂球置于液滴D中处理后，再在液滴D中加入甘油的步骤。

7.  如权利要求2至6中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中探针的用量为0.05-0.08微升。

8.  如权利要求2至7中任一所述的方法，其特征在于：所述方法在步骤4)后，还包括将杂交后的单卵裂球在10微升-50微升的液滴环境中进行洗脱的步骤。

9.  如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述洗脱为如下a)或b)的操作：
a)不移动单卵裂球，吸弃洗脱液进行洗脱；
b)在洗脱液中加入0.08％-0.12％NP-40/2*SSC，移动单卵裂球进行洗脱；
所述0.08％-0.12％NP-40/2*SSC是含有体积百分含量为0.08％-0.12％的NP-40的2*SSC。

10.  权利要求1至9中任一所述方法在单卵裂球遗传检测中的应用。

一种利用三维荧光原位杂交检测单卵裂球中染色体的方法
技术领域
本发明涉及一种利用三维荧光原位杂交检测单卵裂球中染色体的方法。
背景技术
胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis，PGD)是借助显微操作技术从体外受精得到的胚胎中取出1-2个分裂球或极体进行遗传学检查，选出遗传性状正常的胚胎送回母体子宫。
PGD主要采用荧光原位杂交技术(fluorescent in situ hybridization，简称FISH)，用荧光标记的DNA探针结合到卵裂球特异的DNA靶序列上，通过采用不同的荧光标记探针，可以同时分析单一细胞多个染色体情况。从首例将FISH方法应用到PGD上以来，该方法进行了很多改进。目前PGD采用的FISH技术需先将卵裂球进行低渗破膜处理，去除胞浆成分，然后再进行固定，原位杂交等一系列步骤。这种方法存在如下缺点：由于去除了胞浆成分，实验结果与染色体的实际位置有偏差；需要实验人员娴熟的操作技能；可能导致一定比例的卵裂球丢失和无信号。在PGD诊断中，因为每个病人只有少量的胚胎，而且每个胚胎只能取1-2个卵裂球进行分析，每一枚卵裂球提供的信息都非常重要。这就需要研究者们不断改进FISH操作的步骤，在获得清晰信号的前提下尽量减少样本丢失率。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用三维荧光原位杂交检测单卵裂球中染色体的方法。
本发明提供的利用三维荧光原位杂交检测单卵裂球中染色体的方法，是在体积为50微升以下的液滴环境中进行三维荧光原位杂交。
所述方法具体包括如下步骤：
1)用多聚甲醛对单卵裂球进行固定；
2)将固定后的单卵裂球进行透膜处理；
3)将透膜处理后的单卵裂球进行去蛋白处理；
4)将去蛋白处理后的单卵裂球与探针进行杂交。
所述步骤1)中，将单卵裂球在10微升-50微升的液滴A中进行固定；所述液滴A中可含有体积百分含量为2％-4％的多聚甲醛。
所述步骤2)中的透膜处理可包括如下步骤：将单卵裂球依次置于10微升-50微升的液滴B、10微升-50微升的液滴C中进行处理；然后将单卵裂球在液氮中进行冻融；所述液滴B中含有体积百分含量为0.4％-1.0％的TritonX-100；所述液滴C中含有体积百分含量为15％-25％的甘油。
所述述步骤3)中的去蛋白处理可包括如下步骤：将单卵裂球置于10微升-50微升的液滴D中进行处理；所述液滴D含有浓度为0.08-0.12M的HCl。
所述步骤3)还可包括将单卵裂球置于液滴D中处理后，再在液滴D中加入甘油的步骤。
所述步骤4)中探针的用量可为0.05-0.08微升。
所述方法在步骤4)后，还可包括将杂交后的单卵裂球在10微升-50微升的液滴环境中进行洗脱的步骤。
所述洗脱具体可为如下a)或b)的操作：
a)不移动单卵裂球，缓慢吸弃洗脱液再加入另外一种洗脱液进行洗脱；
b)在洗脱液中加入0.08％-0.12％NP-40/2*SSC，移动单卵裂球进行洗脱。
所述0.08％-0.12％NP-40/2*SSC是含有体积百分含量为0.08％-0.12％的NP-40的2*SSC。
所述方法在单卵裂球遗传检测中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明提供的方法既可以应用于临床医学领域也可以应用于科研领域。
本发明提供的方法具有如下优点：1)能够维持卵裂球中染色体的空间位置。本发明的方法采用多聚甲醛固定卵裂球，并不去除胞浆，保持了胞质膜以及核膜的完整性，通过透膜使探针进入到核内与靶DNA结合。2)减少卵裂球丢失。在整个操作过程，样本一直可以在体式镜下观察到，使卵裂球的固定变得更简单，效果更为可靠，同时减少了样本丢失的风险，从而降低了对同一胚胎取两个卵裂球时对胚胎发育潜能的影响。3)节约检测成本。常规的免疫荧光原位杂交是将含有样本的载玻片在盛有各种不同液体的染料瓶中移动。而本发明的方法是吸取卵裂球在各个不同微滴(小于等于50μl)之间移动，可节约大量的试剂、溶液。目前，价格昂贵的探针在一定程度上限制了P6D的应用，通过此种方法可以使传统方法的费用减少十分一左右(每一个卵裂球只需要0.05-0.08μl DNA探针，即0.5-0.8μl探针杂交缓冲液，就可以获得较好的杂交信号)，大大降低了使用的成本。实验中即使不小心丢掉样本，也可以随时终止后续试验，避免了探针的浪费，进而节约成本。4)不仅可以对胚胎的染色体异常进行空间定位，同时可以对胞浆内特定蛋白的表达与定位进行研究。对同一胚胎来源的卵裂球进行多角度研究，既节约样本又可同时说明染色体的状态与胞浆内特定蛋白表达的关系，拓宽了生殖生物学研究领域。这对于研究人类卵、胚胎的发育机制来说至关重要，因为人的材料难以得到，非常珍贵。5)操作简单，不需特殊培训，只需在普通体式镜下将卵裂球在不同的液滴中移动即可实现。
附图说明
图1为对发育异常的卵裂球进行3D-FISH的结果。
A：荧光信号(绿色)表示X染色体；B：荧光信号(红色)表示用PI染料标记的细胞核；C：A和B的叠加图；Bar＝10μm。
图2为对发育异常的卵裂球进行3D-FISH的结果。
A：荧光信号(绿色)表示X染色体；B：荧光信号(红色)表示用PI染料标记的细胞核；C：A和B的叠加图；Bar＝10μm。
图3为对发育异常的卵裂球进行3D-FISH的结果。
A：荧光信号(绿色)表示X染色体；B：荧光信号(红色)表示用PI染料标记的细胞核；C：A和B的叠加图；Bar＝10μm。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不限于此。以下实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。以下实施例中的试剂，如无特别说明，均为普通生化试剂公司出售的常规试剂。
以下实施例中所用的SSC是将20×SSC稀释得到的。20×SSC的配方如下：氯化钠88克，柠檬酸钠44克，加去离子水至500毫升。
本发明的方法具体可包括如下步骤：
1、活检
临床医学领域中，单卵裂球样本的制备可采用如下方法：利用机械法或激光法在透明带上做一切口，取出卵裂球。
科研领域中，单卵裂球样本的制备可采用如下方法：利用酸性生理盐水(10微升浓盐酸加到1毫升生理盐水中)将透明带溶解去除，用无透明带的胚胎或卵裂球进行操作。
2、固定
在10-50微升液滴A(含有体积百分含量为2％-4％的多聚甲醛)中20-30分钟，固定单卵裂球。
3、透膜
将固定后的单卵裂球在10-50微升的液滴B(含有体积百分含量为0.4％-1.0％的TritonX-100)放置50-120分钟；然后将单卵裂球细胞在10-50微升的液滴C中(含有体积百分含量为15％-25％的甘油)放置20-30分钟进行透膜；然后将单卵裂球在液氮中反复冻融3次。
4、去蛋白
将透膜后的单卵裂球移到10-50微升的液滴D(含有浓度为0.08-0.12M的HCl)中孵育3-7分钟，去除蛋白，以使探针更接近靶DNA。经过去蛋白处理后，大部分单卵裂球都粘附在皿底极容易裂解，导单致卵裂球丢失，这时可在液滴D中加入少量甘油，以避免单卵裂球粘底。
5、FISH
将去蛋白后的单卵裂球先在杂交缓冲液(可以自行配制也可采用与探针配套购买的杂交缓冲液)中洗涤至少一次，然后置于0.5-0.8微升探针混合液液滴(含有0.05-0.08微升的探针)中，与探针共同变性后(76℃，5分钟)，37℃过夜进行FISH。
6、洗脱
单卵裂球在10-50微升的45％-55％甲酰胺/2*SSC液滴(含有体积百分含量为45％-55％的甲酰胺的2*SSC)中，44-48℃，8-15分钟，3次以上；然后单卵裂球在10-50微升的2*SSC液滴中，8-20分钟，一次以上；最后单卵裂球在10-50微升的(0.08％-0.12％NP-40)/2*SSC液滴中孵育4-6分钟(含有体积百分含量为0.08％-0.12％的NP-40的2*SSC)。
因单卵裂球在45％-55％甲酰胺/2*SSC和2*SSC中也易粘皿底，采用小心吸弃液体不移动单卵裂球的方法进行洗脱或者将少量的(0.08％-0.12％NP-40)/2*SSC加到液滴内再移动卵裂球就可以避免卵裂球破裂。
2*SSC(pH 7.0)：用去离子水将20×SSC稀释十倍，NaOH调节PH值。
7、PI染核。
8、用荧光显微镜阅读信号或用激光共聚焦显微镜获得染色体在核内的分布。
实施例1、利用3D-FISH对发育异常的人胚胎单卵裂球进行遗传学检测
收集人类辅助生殖实验室废弃的人发育异常的胚胎。利用酸性生理盐水将透明带去除，用无透明带的胚胎或卵裂球进行操作。
1、单卵裂球细胞固定
将单卵裂球在20微升的液滴A(体积百分含量为4％的多聚甲醛)中固定20分钟(室温)，经1×PBS洗一次。
2、透膜
包括三个步骤，均在室温条件完成。
室温下将固定后的单卵裂球细胞在20微升的液滴B(体积百分含量为0.5％的TritonX-100)放置60分钟；然后将单卵裂球细胞在20微升的液滴C中(体积百分含量为20％的甘油)放置30分钟进行透膜；然后单卵裂球在液氮中反复冻融3次。
3、去蛋白
将透膜后的单卵裂球在20微升的液滴D(浓度为0.1M的HCl)中孵育5分钟，去除蛋白。然后在液滴D中加入少量甘油。
4、杂交
探针为X染色体着丝粒α-卫星DNA探针(Vysis公司)。用杂交缓冲液稀释探针，得到探针混合液，分装于-20℃冻存，探针混合液中含有体积百分含量为10％的探针。
将透膜后的单卵裂球先在杂交缓冲液中洗涤一次，然后置于0.5微升的探针混合液中，与探针共同变性(76℃，5分钟)后，37℃过夜。
5、洗脱
将杂交后的单卵裂球在20微升的50％甲酰胺/2×SSC(含50％甲酰胺(体积百分含量)的2×SSC)液滴中46℃洗涤，每次10分钟，洗涤三次；将洗涤后的单卵裂球在20微升的2×SSC液滴中洗涤10分钟。最后将单卵裂球在20微升的0.1％NP-40/2*SSC(含0.1％NP-40(体积百分含量)的2×SSC)液滴中孵育5分钟。
6、染核
将卵裂球移到PI中染核。
利用激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM 510META，Germany)观察杂交信号。
三、效果评价
所有卵裂球都能保存良好的形态，具有完整的胞质膜、核膜，最后均能获得清晰的原位荧光杂交信号。图1、图2和图3分别是对从三个发育异常胚胎中得到的单卵裂球进行3D-FISH的结果。如图所示，在维持卵裂球胞质膜完整的前提下，DNA探针能进入到核内并与相应的染色体结合。本发明的方法能获得满意的信号，降低了卵裂球丢失率，极大减少了探针的使用量。
将PGD中传统的荧光原位杂交方法与本发明的方法进行比较，见表1。
表1传统的荧光原位杂交方法与本发明的方法的比较