用作生物标记物的环金属铱配位化合物.pdf

本发明涉及一种用作生物标记物的环金属铱配位化合物，其结构通式为本发明的化合物可以应用于标记带有氨基的生物分子，不仅能够很有效地交联带有氨基的生物分子，并且最重要的是，本发明的化合物即使与生物分子交联后仍有很高的发光效率，满足了现有技术中对标记后高灵敏度、重现性好的需求。

1.  下述通式(1)化合物：

通式(1)可以简写为[(L_C^N)₂Ir(L_N^N～～～～COOH)]X；
其中，(L_C^N)表示以一个sp²杂化的C原子和一个sp²杂化的N原子与Ir(III)离子配位的杂芳环碳氮配体；
(L_N^N～～～～COOH)表示其包括以两个sp²杂化的N原子与Ir(III)离子配位的杂芳环氮氮螯合配体部分(L_N^N)以及与该配体部分共价连接的羧酸部分(～～～～COOH)；
[(L_C^N)₂Ir(L_N^N～～～～COOH)]为阳离子部分，X表示一种与该阳离子部分抗衡的阴离子。

2.  根据权利要求1所述的化合物，其中，所述L_C^N配体可以为下述通式(2)：

其中，通式(2)所示的取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹可以为氢原子、卤素原子、C_1-12的烷基或取代烷基、C_1-12的烷氧基或取代烷氧基、C_6-30的芳基或取代芳基；其中的取代基R²与R³、R³与R⁴、R⁶与R⁷、R⁵与R⁶可以连接，和骨架共同形成C_12-30的稠芳环或取代稠芳环C_11-30的稠杂芳环或取代稠杂芳环；且取代基R¹和R⁵中至少有一个为氢原子。

3.  根据权利要求2所述的化合物，其中，所述的取代烷基、取代烷氧基、取代芳基、取代稠芳环、取代稠杂环的取代基可以为氢原子、卤素原子、烷基、烷氧基。

4.  根据权利要求1中所述的化合物，其中，L_C^N配体可以为下述通式(3)或(4)：

其中，所述通式(3)或(4)中的取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹可以为氢原子、卤素原子、C_1-12的烷基或取代烷基、C_1-12的烷氧基或取代烷氧基、C_6-30的芳基或取代芳基；且取代基R⁵和R⁹中至少有一个为氢原子。

5.  根据权利要求4所述的化合物，其中，所述的取代烷基、取代烷氧基、取代芳基、取代稠芳环、取代稠杂环的取代基可以为氢原子、卤素原子、烷基、烷氧基。

6.  根据权利要求1、2、3、4、5中任意一项所述的化合物，其中，所述L_N^N～～～～COOH配体可以为引入了羧基基团的二亚胺螯合配体。

7.  根据权利要求6所述的化合物，其中，所述L_N^N～～～～COOH配体可以为下述通式(5)或(6)：

其中通式(5)或通式(6)中的取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸可以为氢原子、卤素原子、C_1-12的烷基或取代烷基、C_1-12的烷氧基或取代烷氧基、C_6-30的芳基或取代芳基，且取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸中有一个而且仅有一个带有羧基基团。

8.  根据权利要求7所述的化合物，其中，取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸中有一个且仅有一个为(CH₂)_nCOOH，n＝0～12。

9.  根据权利要求6所述的化合物，其中，X可以为氯离子(Cl^-)、溴离子(Br^-)、碘离子(I^-)、三氟甲磺酸根离子(CF₃SO₃^-)、六氟磷酸根离子(PF₆^-)、四氟硼酸根离子(BF₄^-)、高氯酸根离子(ClO₄^-)。

10.  根据权利要求1、2、3、4、5中任意一项所述的化合物，其中，X可以为氯离子(Cl^-)、溴离子(Br^-)、碘离子(I^-)、三氟甲磺酸根离子(CF₃SO₃^-)、六氟磷酸根离子(PF₆^-)、四氟硼酸根离子(BF₄^-)、高氯酸根离子(ClO₄^-)。

11.  下述通式(7)的化合物：

其中，表示以一个sp²杂化的C原子和一个sp²杂化的N原子与Ir(III)离子配位的杂芳环碳氮配体；
表示其包括以两个sp²杂化的N原子与Ir(III)离子配位的杂芳环氮氮螯合配体部分以及与该配体部分共价连接的琥珀酰亚胺酯部分；
为阳离子部分，X表示一种与该阳离子部分抗衡的阴离子。

12.  如权利要求1所述的化合物的合成方法，其中，该合成方法采用卤化铱(III)、L_C^N配体、L_N^N～～～～COOH配体为合成原料，合成第一步：将所述的卤化铱与L_C^N配体在适当的溶剂体系中进行回流反应；合成第二步：再使得第一步反应产物与L_N^N～～～～COOH配体在适当的有机溶剂中进行回流反应获得通式(1)化合物。

13.  根据权利要求12所述的合成方法，其中，所述的卤化铱为三氯化铱；
所述的合成第一步中三氯化铱与L_C^N配体的摩尔比为1∶2.5-1∶10，所述适当的溶剂体系为乙二醇单乙醚与水按10∶1-1∶10的体积比混合而成；三氯化铱与L_C^N配体在该溶剂体系中进行回流反应生成两个氯原子桥联的双核环金属铱配位化合物；
所述的合成第二步中，所述的适当的有机溶剂为甲醇与二氯甲烷按体积比为10∶1-1∶10混合形成的溶剂体系。

14.  根据权利要求1或11所述的化合物作为标记物应用于标记带有游离氨基的生物分子。

15.  根据权利要求14所述的应用，其中，所述的生物分子可以为多肽、蛋白质、经氨基修饰的改性核酸。

16.  采用如权利要求1所述的化合物的生物标记方法，其中，该方法采用通式(1)化合物来标记带有游离氨基的目标生物分子，该方法包括：步骤1)在适当的溶液体系中，通式(1)化合物与N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的作用下进行反应生成该通式(1)化合物的琥珀酰亚胺酯；
或者通式(1)化合物与N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)在二环已基碳二亚胺(DCC)的作用下反应生成该通式(1)化合物的琥珀酰亚胺酯；
步骤(2)在适当的溶液体系中，用步骤(1)生成的琥珀酰亚胺活泼酯与所述的目标生物分子混合进行反应。

用作生物标记物的环金属铱配位化合物
技术领域
本发明涉及一种生物标记物，特别涉及一种用作生物标记物的环金属铱配位化合物。
背景技术
在现代生命科学、临床医学以及食品与环境分析应用等领域中，基于选择性的生物分子间亲和性的生物分析技术(例如免疫分析、DNA检测技术等)扮演着至关重要的角色。而在这类生物分析技术中，最为关键的就是用来定性或定量检测各种生物分子的生物标记物(同时，生物标记物也是用来研究生物活性分子的信息传递、生物分子间相互作用、生物分子与药物相互作用的重要物质。)。
常用的生物标记物一般包含有能够与目标生物分子反应交联的基团以及能够受激发产生辐射光的部分，并通过该发光部分来起到标记作用，生物标记物起到标记作用的方式主要有以下几种：1)自身能够产生一定的可检测信号(如放射性物质作为生物标记物)；2)借助于物理学发光(如光致发光)的方式；3)化学发光、电化学发光、生物化学发光的方式(通过一般的化学反应或电化学反应或生物化学反应产生可检测的辐射光)。
近年来，发现一些铱金属的环金属配位化合物具有较好的光物理、光化学和电化学性质，但是这些化合物却无法应用到生物标记物领域，例如，这类铱金属的环金属配位化合物无法与目标生物分子有效地交联，即使对其进行改性，交联效果仍然很差，尤其是对于标记空间结构较为复杂的生物大分子，因此很难应用于生物标记。
发明内容
本发明一方面提供了一种用作生物标记物的环金属铱配位化合物，该化合物用下述通式(1)表示：

通式(1)可以简写为[(L_C^N)₂Ir(L_N^N～～～～COOH)]X；
其中，(L_C^N)表示以一个sp²杂化的C原子和一个sp²杂化的N原子与Ir(III)离子配位的杂芳环碳氮配体；
(L_N^N～～～～COOH)表示其包括以两个sp²杂化的N原子与Ir(III)离子配位的杂芳环氮氮螯合配体部分(L_N^N)以及与该配体部分共价连接的羧酸部分(～～～～COOH)；
[(L_C^N)₂Ir(L_N^N～～～～COOH)]为阳离子部分，X表示一种与该阳离子部分抗衡的阴离子。
发明人经过大量的实验研究以及筛选，惊奇地发现了选择上述特定化学结构的铱金属的环金属配位化合物作为发光部分，并在特定位置(杂芳环氮氮螯合配体部分L_N^N)引入了能够与生物分子交联的羧酸部分，获得的本发明的化合物可以应用于标记带有氨基的生物分子，不仅能够很有效地交联带有氨基的生物分子，并且最重要的是，发现本发明的化合物即使与生物分子交联后仍保持很高的发光效率，并且此类标记化合物抗光漂白性能好，克服了现有技术中交联后灵敏度无法保持造成重现性不好的缺陷。
所述的L_C^N配体优选下述通式(2)所示：

其中，通式(2)所示的取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹可以为氢原子、卤素原子、C_1-12的烷基或取代烷基、C_1-12的烷氧基或取代烷氧基、C_6-30的芳基或取代芳基；其中的取代基R²与R³、R³与R⁴、R⁶与R⁷、R⁵与R⁶可以连接，和骨架共同形成C_12-30的稠芳环或取代稠芳环C_11-30的稠杂芳环或取代稠杂芳环；且取代基R¹和R⁵中至少有一个为氢原子。所述的取代烷基、取代烷氧基、取代芳基、取代稠芳环、取代稠杂环的取代基优选氢原子、卤素原子、烷基、烷氧基。
所述的L_C^N配体还可以为下述通式(3)或(4)所示：

其中，所述通式(3)或(4)中的取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹可以为氢原子、卤素原子、C_1-12的烷基或取代烷基、C_1-12的烷氧基或取代烷氧基、C_6-30的芳基或取代芳基；且取代基R⁵和R⁹中至少有一个为氢原子。所述的取代烷基、取代烷氧基、取代芳基、取代稠芳环、取代稠杂环的取代基优选氢原子、卤素原子、烷基、烷氧基。
所述L_N^N～～～～COOH配体优选引入了羧基基团的二亚胺螯合配体。
优选的，L_N^N～～～～COOH配体可以为下述通式(5)或(6)：

其中通式(5)或通式(6)中的取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸可以为氢原子、卤素原子、C_1-12的烷基或取代烷基、C_1-12的烷氧基或取代烷氧基、C_6-30的芳基或取代芳基，且取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸中有一个而且仅有一个带有羧基基团。
优选的，上述通式(5)或通式(6)中的取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸中有一个且仅有一个为(CH₂)_nCOOH，其中n＝0～12。发明人经大量的实验研究发现，采用与L_N^N配体部分共价连接的羧酸部分最好为烷基羧酸，标记时与生物分子的交联效果比较好，该化合物基本上不受目标生物分子的空间结构的影响，能够与各种类型的生物分子特别是生物大分子进行交联，交联效果好，并且交联后的发光效率也基本不受目标生物分子的空间结构的影响。
上述的化合物中，X优选为氯离子(Cl^-)、溴离子(Br^-)、碘离子(I^-)、三氟甲磺酸根离子(CF₃SO₃^-)、六氟磷酸根离子(PF₆^-)、四氟硼酸根离子(BF₄^-)、高氯酸根离子(ClO₄^-)。
本发明另一方面提供了通式(1)化合物的合成方法，该合成方法采用卤化铱(III)、L_C^N配体、L_N^N～～～～COOH配体为合成原料，合成第一步：将所述的卤化铱与L_C^N配体在适当的溶剂体系中进行回流反应；合成第二步：再使得第一步反应产物与L_N^N～～～～COOH配体在适当的有机溶剂中进行回流反应获得通式(1)化合物。
其中合成第一步中使用的适当的溶剂体系能够使生成产物尽可能析出，所述的回流反应的温度为能够使反应物进行完全；其中合成第二步中使用的适当的有机溶剂为能够是反应物完全溶解达到均相反应，所述的回流反应的温度为能够是反应进行完全。
优选的，所述的卤化铱为三氯化铱；所述的合成第一步中三氯化铱与L_C^N配体的摩尔比为1∶2.5-1∶10，所述适当的有机溶剂为乙二醇单乙醚与水按10∶1-1∶10的体积比混合形成的溶剂体系；三氯化铱与L_C^N配体在该溶剂体系中进行回流反应生成两个氯原子桥联的双核环金属铱配位化合物；所述的合成第二步中，所述的适当的有机溶剂为甲醇与二氯甲烷按体积比为10∶1-1∶10混合形成的溶剂体系。
本发明还提供了通式(1)化合物的琥珀酰亚胺酯，其结构如下述通式(7)：

其中，表示以一个sp²杂化的C原子和一个sp²杂化的N原子与Ir(III)离子配位的杂芳环碳氮配体；
表示其包括以两个sp²杂化的N原子与Ir(III)离子配位的杂芳环氮氮螯合配体部分以及与该配体部分共价连接的琥珀酰亚胺酯部分；
为阳离子部分，X表示一种与该阳离子部分抗衡的阴离子。
本发明另一方面还提供了通式(1)或通式(7)的化合物作为标记物应用于标记带有游离氨基的生物分子。
优选的，所述的生物分子可以为多肽、蛋白质、经氨基修饰的改性核酸。
本发明还进一步提供了通式(1)化合物的生物标记方法，其中，该方法采用通式(1)化合物来标记带有游离氨基的目标生物分子，该方法包括：步骤1)在适当的溶液体系中，通式(1)化合物与N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的作用下进行反应生成该通式(1)化合物的琥珀酰亚胺酯；
或者通式(1)化合物与N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)在二环己基碳二亚胺(DCC)的作用下反应生成该通式(1)化合物的琥珀酰亚胺酯；
步骤(2)在适当的溶液体系中，用步骤(1)生成的琥珀酰亚胺活泼酯与所述的目标生物分子混合进行反应。
其中，根据目标生物分子的量来具体选择标记化合物的量，一般来说，通式(1)化合物应当过量。
其中步骤1)和步骤2)中用到的适当的溶液体系为常规缓冲液体系，例如磷酸缓冲液(PBS)、Tris缓冲液、Bis-Tris缓冲液、MES缓冲液和HEPES缓冲液等。
在本发明的一个具体实施方式中，采用PBS缓冲溶液作为步骤1)的反应体系，PBS的pH值为6～8，将通式(1)化合物、HOSu、EDC按摩尔比1∶1∶2～1∶1∶10完全溶解在缓冲溶液中，室温下反应一段时间待有通式(1)琥珀酰亚胺酯生成(一般约为10分钟～1小时)后，向其中加入带有氨基的目标生物分子，室温下再进行反应(步骤2)反应较慢，一般来说采用搅拌过夜的方式)。
其中，琥珀酰亚胺酯为活泼中间体，可以直接向步骤1)的反应体系中加入目标生物分子，将生成的琥珀酰亚胺酯直接来标记生物分子。
当然，也可以将步骤1)中生成的琥珀酰亚胺酯提纯后，再标记目标生物分子。在本发明的另一个具体实施方式中，采用二甲基甲酰胺(DMF)有机溶剂作为步骤1)的反应体系，将通式(1)化合物、HOSu、DCC按摩尔比1∶1∶2～1∶1∶10完全溶解在DMF溶剂中，室温下反应较长一段时间(一般过夜)，待反应充分后，除去产生的杂质获得通式(1)化合物的琥珀酰亚胺酯产品；将获得的通式(1)化合物的琥珀酰亚胺酯产品溶解于DMF溶剂中，再与目标生物分子的PBS缓冲溶液混合，室温下进行反应。另外，步骤1)中，反应生成通式(1)化合物的琥珀酰亚胺酯的过程中，产生了二环己基脲，本领域技术人员可以根据溶剂以及其中的各种溶质的具体情况，来选择获得该琥珀酰亚胺酯的方法，如可以采用乙醚来提取。
附图说明
图1为本发明的化合物3的¹H NMR光谱；
图2为本发明的化合物4的¹H NMR光谱；
图3为本发明的化合物3的紫外可见吸收和光致发射光谱(440nm激发下PL峰值发射波长为595nm，298K，甲醇，4μM)；
图4是化合物4的紫外可见吸收和光致发射光谱(410nm激发下PL峰值发射波长为530nm，298K，乙腈，4μM)；
图5为化合物3标记牛血清白蛋白(BSA)的结构图。
具体实施方式
实施例1：化合物1及其合成
化合物1

其L_C^N配体为(2-(2，4-二氟苯基)吡啶，Fppy)；L_N^N～～～～COOH配体为(4-甲基-4′-(3-羧酸丙基)-2，2′-联吡啶)，
化合物1的合成
第一步：将2mmol三氯化铱(IrCl₃.2H₂O)与3mmolFppy，溶解于80mL乙二醇单乙醚与水按3∶1的体积比混合形成的混合溶剂；三氯化铱与Fppy在该溶剂体系中进行回流反应(回流温度约为140℃)生成两个氯原子桥联的双核环金属铱配位化合物(Fppy)₂Ir(Cl)₂Ir(Fppy)₂，该化合物的合成与提纯参照文献(J.AM.CHEM.SOC.2005，127，12438-12439)。
第二步：将步骤(1)获得的1mmol(Fppy)₂Ir(Cl)₂Ir(Fppy)₂与1mmol4-甲基-4′-(3-羧酸丙基)-2，2′-联吡啶在30mL溶剂体系中进行回流反应，方程式如下：

溶剂体系为CH₃OH/CH₂Cl₂(体积比1∶1)，回流温度为65℃，TCL跟踪反应完全，旋干溶剂后，再将所得物通过硅胶柱层析(流动相：CH₃OH/CH₂Cl₂＝1∶5)，可得到纯度为95％的化合物1(产率为60％)。
得到的化合物1产物的¹H NMR光谱数据：¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ9.86(s，2H)，8.31(m，2H)，7.81(m，2H)，7.68(m，2H)，7.48(m，2H)，7.21(m，2H)，7.07(m，2H)，6.54(t，2H)，5.68(m，2H)，3.07(m，2H)，2.73(s，3H)，2.46(m，2H)，2.11(m，2H)；
元素分析：C₃₇H₂₈ClF₄IrN₄O₂
％   实测值    理论值
C    51.40％   51.42％
H    3.25％    3.27％
N    6.50％    6.48％。
实施例2：化合物2及其合成
化合物2

其L_C^N配体为(1-苯基吡啶，ppy)；
L_N^N～～～～COOH配体为4-甲基-4′-(3-羧酸丙基)-2，2′-联吡啶；
参照实施例1中的方法先合成两个氯原子桥联的双核环金属铱配位化合物(ppy)₂Ir(Cl)₂Ir(ppy)₂；
再将上述获得的1mmol(ppy)₂Ir(Cl)₂Ir(ppy)₂与1mmol4-甲基-4′-(3-羧酸丙基)-2，2′-联吡啶在30mL溶剂体系中进行回流反应，方程式如下：

溶剂体系为CH₃OH/CH₂Cl₂(体积比1∶1)，回流温度为65℃，，TCL跟踪反应完全，旋干溶剂后，再将所得物通过硅胶柱层析(流动相：CH₃OH/CH₂Cl₂＝1∶5)，可得到纯度为95％的化合物2(产率为80％)。
得到的化合物2产物的¹H NMR光谱数据：¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ9.51(s，2H)，7.89(m，2H)，7.74(m，4H)，7.67(t，2H)，7.49(d，2H)，7.24(d，1H)，7.16(m，2H)，7.00(m，3H)，6.88(t，2H)，6.29(d，2H)，3.00(m，2H)，2.67(s，3H)，2.48(m，2H)，2.10(m，2H)；
元素分析：C₃₇H₃₂ClIrN₄O₂
％   实测值     理论值
C    56.11％    56.09％
H    4.03％    4.07％
N    7.10％    7.07％。
实施例3：化合物3及其合成
化合物3

其L_C^N配体为(1-苯基异喹啉，piq)；
L_N^N～～～～COOH配体为4-甲基-4′-(3-羧酸丙基)-2，2′-联吡啶；
参照实施例1中的方法先合成两个氯原子桥联的双核环金属铱配位化合物(piq)₂Ir(Cl)₂Ir(piq)₂；
再将上述获得的1mmol(piq)₂Ir(Cl)₂Ir(piq)₂与1mmol4-甲基-4′-(3-羧酸丙基)-2，2′-联吡啶在30mL溶剂体系中进行回流反应，方程式如下：

溶剂体系为CH₃OH/CH₂Cl₂(体积比1∶1)，回流温度为65℃，，TCL跟踪反应完全，旋干溶剂后，再将所得物通过硅胶柱层析(流动相：CH₃OH/CH₂Cl₂＝1∶5)，可得到纯度为97％的化合物3(产率为87％)。
得到的化合物3产物的¹H NMR光谱数据(可参见图1)：¹H NMR(CD3OD，400MHz)δ8.99(t，2H)，8.64(d，2H)，8.33(d，2H)，7.97(m，2H)，7.82(m，4H)，7.71(m，2H)，7.45(m，4H)，7.33(t，2H)，7.09(t，2H)，6.83(t，2H)，6.29(t，2H)，2.84(t，2H)，2.56(s，3H)，2.30(t，2H)，1.97(m，2H)；
元素分析：C₄₅H₃₆ClIrN₄O₂
％   实测值    理论值
C    60.61％   60.56％
H    4.15％    4.07％
N    6.24％    6.28％。
获得的化合物3的紫外可见吸收和光致发射光谱参见图3，激发波长为440nm，最大发射波长为595nm。
实施例4：
化合物4及其合成
化合物4

其L_C^N配体为(2-苯基苯并噻唑，bt)；
L_N^N～～～～COOH配体为(4-甲基-4′-甲酸-2，2′-联吡啶)；
参照实施例1中的方法先合成两个氯原子桥联的双核环金属铱配位化合物(bt)₂Ir(Cl)₂Ir(bt)₂；
再将上述获得的1mmol(bt)₂Ir(Cl)₂Ir(bt)₂与1mmol4-甲基-4′-甲酸-2，2′-联吡啶在30mL溶剂体系中进行回流反应，方程式如下：

溶剂体系为CH₃OH/CH₂Cl₂(体积比1∶1)，回流温度为65℃，TCL跟踪反应完全，旋干溶剂后，再将所得物通过硅胶柱层析(流动相：CH₃OH/CH₂Cl₂＝1∶5)，可得到纯度为98％的化合物4(产率为90％)。
得到的化合物4产物的¹H NMR光谱数据(可参见图2)：¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δ9.05(s，1H)，8.33(s，1H)，8.08(dd，2H)，7.81(m，5H)，7.34(m，2H)，7.27(s，1H)，7.05(m，4H)，6.86(t，2H)，6.36(m，2H)，6.13(m，2H)，2.62(s，3H)。
元素分析：C₃₈H₂₆ClIrN₄O₂S₂
％   实测值     理论值
C    52.90％    52.92％
H    3.06％     3.04％
N    6.55％     6.50％。
获得的化合物4的紫外可见吸收和光致发射光谱参见图4，激发波长为410nm，最大发射波长为530nm。
实施例5：采用化合物3来标记牛血清白蛋白(BSA)
标记反应的方程式如下：

将化合物3(0.5μmol)溶解在3mLPBS缓冲溶液(pH＝7.4)，再向其中加入HOSu(1.05μmol)和EDC(1μmol)，在室温下反应约30分钟，然后向其中加入4mL BSA(7mg)的PBS缓冲溶液(pH＝7.4)，室温下搅拌过夜。
得到的混合溶液采用透析的方法进行纯化，具体的采用能够截留分子量大于为10000Da的分子透析袋，将透析袋至于PBS溶液(pH＝7.4)中透析纯化三天(未交联化合物基本除去)，获得交联有标记的BSA。在激发波长为300nm-450nm激发下，该已标记的BSA发射红光(具体结构图参见图5)。
通过透析后标记的BSA发射光谱与化合物3(0.5μmol)溶解在7mLPBS缓冲溶液(pH＝7.4)的发射光谱相比较，发现两者的光谱几乎重叠，进一步证实了我们的设想，此类化合物与BSA有较好的交联作用，并且标记之后化合物本身的发光效率仍然保持高效率。
实施例6：化合物3的琥珀酰亚胺酯的合成
其合成反应的方程式如下：

取化合物3(0.5mmol)、HOSu(1.05mmol)和DCC(1mmol)，一起溶于10mL的无水DMF溶剂，在室温下反应过夜。之后过滤掉沉淀物(主要为二环己基脲DCU)，再将过滤所得上清液滴加到50mL乙醚中，过滤沉降物并用乙醚洗涤，干燥即得到了化合物3的琥珀酰亚胺酯固体300mg。
实施例7：用化合物3的琥珀酰亚胺酯标记BSA
标记反应式如下：

取实施例6获得的化合物3的琥珀酰亚胺酯固体(0.37mg)溶于3mLPBS缓冲溶液，将得到的溶液与2mL BSA的PBS缓冲溶液(pH＝7.4，其中BSA 5mg)混合，室温下搅拌反应约4h。
得到的混合溶液采用透析的方法进行纯化，具体的采用能够截留分子量大于为10000Da的分子透析袋，将透析袋至于PBS溶液(pH＝7.4)中透析纯化三天(未交联化合物基本除去)，获得交联有标记的BSA。在激发波长为300nm-450nm激发下，该已标记的BSA发射红光。