CYP1A2基因的SNP rs11632814及其在相关药物代谢活性检测中的应用 【技术领域】
本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地涉及细胞色素氧化酶P4501A2基因(Cytochrome P4501A2，CYP1A2)的单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)及其与药物代谢活性检测之间相关性。本发明还涉及检测所述SNP的方法和试剂盒。
背景技术
药物作用效应的个体差异已经是一种普遍存在的现象，而由于这种差异造成的药物无效或严重药物毒副反应已越来越引起临床医生和药物遗传学家的关注。药物代谢能力和药物效应的差异是药效个体差异的主要原因之一，一些药物代谢和效应相关基因已被发现在人群中不但存在DNA序列的变异，而且其RNA表达水平也存在很大的个体差异。
负责药物代谢的酶主要有两大类：一类称为I相药物代谢酶，它们的作用主要氧化激活药物分子，为下一步反应提供底物；另一类是II相药物代谢酶，它们的作用是在I相代谢酶反应产物上加上大极性基团，例如糖基，磺酸基，乙酰基或氨基，从而增加药物分子的溶解性，以利于排出体外。
I相药物代谢酶主要包括细胞色素氧化酶P450(CYP450)和核黄素单氧化酶(FMO)，也包含部分羟化酶，过氧化物酶以及单胺氧化酶等。细胞色素氧化酶是最主要的药物代谢酶，并被广泛研究。已发现人类基因组中约有55个这类基因，其中4个基因(CYP3A4，CYP2C9，CYP2C19和CYP2D6)最为主要。
II相药物代谢酶主要包括UDP糖基转移酶(UGTs)，谷胱甘肽转移酶(GSTs)，磺基转移酶(SULTs)和N-乙酰转移酶(NATs)等。
细胞色素氧化酶P4501A2(cytochromes P4501A2，CYP1A2)是人肝脏中一种重要的氧化还原酶。近年来，大量研究已发现，CYP1A2在人体内的表达存在很大的个体差异。不同个体间转录水平的表达差异可以高达40倍。因此，了解人类药物代谢和效应相关基因的多样性的遗传基础是生物医学研究中药物基因组学研究的主要目的之一。
CYP1A2是重要的I相药物代谢酶，是P450主要代谢酶之一，在人类肝脏中，约占P450酶总量的13％。CYP1A2的mRNA表达量在个体之间的差异可以高达40倍，由此导致不同个体之间对药物代谢能力的显著差异。
目前已知，临床上像theophylline、tacrine、clozapine、olanzapine等药物是主要由CYP1A2来进行I相药物代谢的。例如，对咖啡因(Caffeine)而言，90％是由CYP1A2来进行代谢的；对clozapine(氯氮平)而言，约30％是由CYP1A2来进行代谢的。
目前FDA批准临床应用的药物代谢酶检测芯片是罗氏公司与Affymetrix公司共同开发的，它上面整合了CYP2D6和CYP2C19的已报道的一些功能位点信息，用于判断个体对以这两个酶作为主要药物代谢酶的药物的代谢能力。CYP1A2在临床上面参与代谢的药物种类甚多。其在个体之间的表达差异可高达40倍，是其药代能力个体差异的一个主要来源。因此要想对个体CYP1A2的活性做出预测，就有必要对影响其表达量的或者可以预测其表达量的SNP位点进行分型。以其可以指导临床合理用药，提高药物的安全性和有效性，实现个体化治疗的目标。
目前的研究表明，CYP1A2基因的一些多态性与药物的代谢能力相关，其中多数多态性并不导致CYP1A2蛋白的氨基酸变化。这提示，在CYP1A2酶活性不改变的情况下(因为酶的氨基酸序列未改变)，CYP1A2的这些多态性(包括SNP)是通过影响CYP1A2的表达量实现的。因为蛋白的表达量与其mRNA的数量基本上呈正比，因此鉴别出与CYP1A2的表达量相关的SNP就成为研究重点。
WO 2008032921中公开了测定包括CYP1A2在内的多种基因的基因型的SNP以及相应的基因芯片，并且用这些SNP和基因芯片进行基因分型的应用。
JP 2007006713中公开了用于测定药物代谢酶CYP1A2基因的多态性的引物集、引物和探针，以及用于检测CYP1A2酶活性的检测试剂。在该文献中，在施用通过CYP1A2代谢的药物之前，先检测受试者地与CYP1A2相关的代谢能力相关的基因多态性，从而避免或减少与该药物相关的不良反应或副作用。
WO 03014387中公开了一种检测基因CYP1A2的基因型的方法，在该文献中提示，CYP1A2基因与药物代谢能力相关。
中国专利申请200510088646.0中公开了一种与药物代谢能力相关联的基因CYP1A2基因型方法，其中对CYP1A2基因的G-3860A位点、G-3113A和T5347C位点进行检测。
此外，已有报道CYP1A2与部分癌症的发生有相关关系，例如在WO 03014387和中国专利申请200510088646.0中都提及CYP1A2基因与肝癌易感性也存在一定的相关性。
综上所述，本领域虽然已知CYP1A2酶或CYP1A2基因的多态性与某些药物的代谢能力相关，但是人们尚未影响在CYP1A2中存在那些具体的多态性(包括SNP)，也不清楚哪些多态性(包括SNP)与药物代谢活性或能力的大小相关。
因此，为了减少药物对不同个体的副作用，本领域迫切需要寻找与药物代谢活性或能力的大小相关的CYP1A2的SNP，以及相关的可用于药物代谢活性检测的方法和试剂盒。
【发明内容】
本发明的目的就是提供CYP1A2基因中与药物代谢活性或能力的大小相关的单核苷酸多态性(SNP)。
本发明的另一目的是提供可用于预先评估个体的药物代谢活性的方法及试剂盒。
在本发明的第一方面，提供了一种体外检测(尤其是非诊断性检测)样品是否存在细胞色素氧化酶P4501A2基因CYP1A2的单核苷酸多态性的方法，包括步骤：
(a)用CYP1A2基因特异性引物扩增样品的CYP1A2基因，得到扩增产物；和
(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：
761位A→G；
其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。
在另一优选例中，所述的基因特异性引物具有SEQ ID NO：2或3的序列。
在另一优选例中，所述的扩增产物的长度为50-3000bp，且含有SEQ ID NO：1中第761位。
在本发明的第二方面，提供了一种用于预测个体的药物代谢活性的试剂盒，它包括特异性扩增CYP1A2基因或转录本的引物，所述的引物扩增出长度为50-3000bp且含有SEQID NO：1中第761位的扩增产物。
在另一优选例中，所述的突变是以下的单核苷酸多态性：
761位A→G；
其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有选自下组的试剂：
(i)与SEQ ID NO：1中第761位的突变结合的探针；或
(ii)识别SEQ ID NO：1中第761位的突变限制性内切酶。
在另一优选例中，所述的引物具有SEQ ID NO：2或3的序列。
在本发明的第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸的序列为细胞色素氧化酶P4501A2基因CYP1A2野生型的基因组核苷酸序列，并且存在SEQ ID NO：1中第761位A→G突变。
在另一优选例中，所述的多核苷酸是第761位为C的SEQ ID NO：1所示的序列。
在本发明的第四方面，提供了本发明第三方面中所述的多核苷酸的用途，它用于制备检测个体的药物代谢活性的试剂或试剂盒。
在另一优选例中，所述的试剂为引物、引物集、探针或核酸芯片。
在另一优选例中，所述的引物或引物集可特异性地扩增出含SEQ ID NO：1中第761位的扩增产物；所述的探针能够与含SEQ ID NO：1中第761位的核酸发生特异性结合；所述的核酸芯片上含有的探针，所述的探针能够与含SEQ IDNO：1中第761位的核酸发生特异性结合。
在本发明的第五方面，提供了一种可用于检测药物代谢活性的核酸芯片，所述的芯片包括基板以及固定在基板上的寡核苷酸探针，所述的探针能够与含SEQ ID NO：1中第761位的核酸发生特异性结合，并且鉴别出SEQ ID NO：1中第761位的核苷酸是A还是G。
在另一优选例中，所述的药物选自下组：
茶碱、他克林、氯氮平、奥氮平、氟他米特、夫罗曲普坦、利多卡因、褪黑激素、美西律、罗哌卡因、替扎尼定、氨苯蝶啶、佐米曲坦；或
对乙酰氨基酚、阿莫曲坦、阿米替林、氯丙咪嗪、环苯扎林、三氟戊肟胺、丙米嗪、马普替林、萘普生、雌二醇、昂丹司琼、奋乃静、普罗帕酮、普萘洛尔、利鲁唑、硫利达嗪、维拉帕米、右旋华法林、积璐琛、或佐替平。
在本发明的第六方面，提供了一种对药物代谢活性进行预测的方法，它包括步骤：
检测待检个体的CYP1A2基因和/或转录本，并与正常的CYP1A2基因和/或转录本相比较是否存在以下的单核苷酸多态性：
761位A→G；
其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1，
如果存在所述的单核苷酸多态性就表明对该个体而言其药物代谢活性高于普通人群。
应理解，上述的以及本文下文中所详述的任二个或多个技术特征都可相互组合，以构成新的技术方案。在此申请中，为了节省篇幅，不再一一列出。
【具体实施方式】
本发明人经过深入而广泛的研究，对CYP1A2基因的SNP进行了测定和分析。首次发现和证明了CYP1A2基因的部分SNP可显著影响CYP1A2的mRNA拷贝数，进而影响药物代谢活性。关联研究结果显示，在CYP1A2的SEQ ID NO：1所示序列的第761位的SNP(761位A→G)可显著导致CYP1A2的mRNA拷贝数(P＜0.01)，因此可作为预测药物代谢活性的特异性SNP。在此基础上完成了本发明。
CYP1A2基因
如本文所用，“CYP1A2基因”指编码细胞色素氧化酶P4501A2的多核苷酸分子，包括DNA和RNA。该术语还包括CYP1A2的基因组序列，尤其是含有启动子区域的多核苷酸。
如本文所用，“CYP1A2蛋白”或“CYP1A2酶”可互换使用，指细胞色素氧化酶P4501A2。
人的细胞色素氧化酶P4501A2基因(CYP1A2)的详细序列可参见网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。在SEQ ID NO：1中给出了人CYP1A2基因启动区的部分序列。
本发明的研究表明，当细胞色素氧化酶P4501A2在SEQ ID NO：1中的第761位发生761位A→G时，导致CYP1A2的转录本的数量明显上升，进而导致翻译产生的CYP1A2蛋白数量增加。由于该SNP不会导致CYP1A2蛋白的氨基酸发生变化，故该SNP不会导致CYP1A2蛋白的酶活性发生变化，因此具有第761位A→G所示SNP的细胞或个体，其药物代谢能力大于该位点为野生型的细胞或个体。
主要或者部分由CYP1A2代谢的药物
目前已知在药物代谢中涉及CYP1A2的药物很多，主要分为以下二类：
一、主要或者部分由CYP1A2代谢，并且已经提示CYP1A2各种表型产生不同临床意义的药物，其中包括(但并不限于)：theophylline(茶碱)(Sarkar et al.1992)，tacrine(他克林)(Spaldin et al.1994)，clozapine(氯氮平)(Bertilsson et al.1994)，olanzapine(奥氮平)(Callaghan et al.1999)，Flutamide(氟他米特)，Frovatriptan(夫罗曲普坦)，Lidocaine(利多卡因)，Melatonin(褪黑激素)，Mexiletine(美西律)，Ropivacaine(罗哌卡因)，Tizanidine(替扎尼定)，Triamterene(氨苯蝶啶)，Zolmitriptan(佐米曲坦)。
二、部分由CYP1A2进行代谢，而CYP1A2各表型临床意义尚不明朗或者影响较弱的药物，其中包括(但并不限于)：Acetaminophen(对乙酰氨基酚)，Almotriptan(阿莫曲坦)，Amitriptyline(阿米替林)，Clomipramine(氯丙咪嗪)，Cyclobenzaprine(环苯扎林)，Fluvoxamine(三氟戊肟胺)，Imipramine(丙米嗪)，Maprotiline(马普替林)，Naproxen(萘普生)，Oestrogen(雌二醇)，Ondansetron(昂丹司琼)，Perphenazine(奋乃静)，Propafenone(普罗帕酮)，Propranolol(普萘洛尔)，Riluzole(利鲁唑)，Thioridazine(硫利达嗪)，Verapamil(维拉帕米)，(R)-Warfarin(右旋华法林)，Zileuton(积璐琛)，Zotepine(佐替平)。
本发明人对CYP1A2基因的SNP进行了测定和分析，其中对CYP1A2基因中的几乎整个区域进行了测序，发现了许多SNP，其中大部分SNP与药物代谢活性并不相关。然而，关联研究表明，SEQ ID NO：1中第761位A→G却是与药物代谢活性关联性非常高的SNP。
CYP1A2蛋白的多聚核苷酸可用于预先判断药物代谢活性。如CYP1A2DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断CYP1A2蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因检测。用CYP1A2蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测CYP1A2蛋白的转录产物。
检测CYP1A2基因的突变也可用于预先判断药物代谢活性检测。检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。CYP1A2蛋白突变的形式包括与正常野生型CYP1A2DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
最方便的检测本发明SNP的方法，是通过用CYP1A2基因特异性引物扩增样品的CYP1A2基因，得到扩增产物；然后检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：第761位A→G，其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：1。
应理解，在本发明首次揭示了CYP1A2基因的SNP与药物代谢活性检测的相关性之后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出含该SNP位置的扩增产物，然后通过测序等方法确定是否存在761位A→G。通常，引物的长度为15-50bp，较佳地为20-30bp。虽然引物与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5′端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明SNP的对应位置。一种优选的引物对具有SEQ ID NO：2或3的序列。
虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为50-3000bp，较佳地为150-2000bp，更佳地为200-1000bp。这些扩增产物都应含有SEQ ID NO：1中第761位。
由于本发明的SNP与药物代谢活性检测具有非常高的关联性，因此可以用于在给药前就预先判断个体的药物代谢活性，而且可以未雨绸缪地减少与由细胞色素氧化酶P4501A2所全部或部分代谢的药物的副作用，从而药物使用的安全性，因此具有极其重大的应用价值和社会效益。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
实验材料和方法
在临床上收集96例正常中国人肝脏样本。样本采集于正常供肝的病理活检部分，约50～200mg每例，在采集后立刻浸入1mL RNALater中，4℃过夜，待样本被RNALater充分浸透后，转移至-70℃保存。本研究工作样本采集及使用均得到伦理学批准。
将-70℃保存的样本于室温复溶后，从RNALater中取出，在DEPC-处理的ddH2O中漂洗掉RNALater，转移至1mL Trizol(Invitrogen Inc.)中，以Pro200homogenizer(Pro scientific Inc.)进行匀浆。然后依Trizol的方案(protocol)得到DNA和RNA。以Biophotometer(Eppendorf Inc.)进行初步定量。对得到的RNA以DNase I(Takara Inc.)进行处理，并用酚/氯仿抽提纯化，乙醇沉淀。以DEPC-treated ddH2O复溶并稀释至终浓度约1ug/ul。-70℃保存。
以20μl体系：1RT缓冲液，0.5mM dNTP，0.5μM poly24dT，5μM N9，20URnase抑制剂(BIO BASIC INC.)，100U M-MLV(H-)逆转录酶(Promega Inc.)进行反转录。反应条件为25℃10min，42℃60min，然后70℃15min。
以人基因组DNA(购自Promega，Catalog No.G152A)作为标准品，GAPDH、ACTB和18srRNA作为参照基因。在ABI 7900HT实时定量PCR仪(AppliedBiosystems，Foster City，CA)上面进行绝对定量PCR，确定cyp1a2在各个样本中的表达量。以市售的Primer3软件设计PCR引物，选择单个外显子之内的80-180bp大小的片段进行扩增。反应体系为20uL：1X QuantiTect SYBRGreen PCR Master Mix(QiagenInc.)，0.3μM各引物，2μl RT稀释后产物(以18s rRNA作为参照基因的40000倍稀释，其他的20倍稀释)或者倍比稀释的标准品基因组DNA G152A。反应条件为95℃15min；94℃15s，57℃30s，72℃30s 40个循环。
根据文献及HapMap数据，利用LD，在cyp1a2基因区域及其与cyp1a1的共享的调控区域内，共选择了16个tagSNP。任两个tagSNP之间r2小于0.9。tagSNP12和16作为marker SNP，用于检测两个等位基因之间的表达比值。其余12个tagSNP以测序手段进行分型。
10微升PCR体系：1x HotStarTaq缓冲液，2.0mM Mg2+，0.2mM dNTP，0.2M引物，0.3U HotStarTaq聚合酶(Qiagen Inc.)和1微升模板DNA(约10ng/l)，反应条件：95℃15min；94℃20s，(62℃-0.5℃/循环)40s，72℃80s，11个循环；94℃20s，56℃30s，72℃80s，25个循环；72℃5min。PCR产物以SAP和Exo I进行纯化后，用BigDye3.0进行测序反应，在ABI3730XL(AppliedBiosystems，Foster City，CA)上进行测序，以Polyphred读取序列。
以SNaPshot Multiplex kit(Applied Biosystems)对所有cDNA以及5个DNA样本的标记SNP(marker SNP)进行分型，以DNA样本两个等位基因(allele)峰高比值作为参照，通过检测marker SNP在cDNA样本中的两个allele的比值来确定两个allele表达量的情况。以此作为后续关联研究的表现型。这个步骤重复4次，取平均值。所有16个tagSNP的纯合与杂合状态作为研究的基因型。
以SPSS VERSION15.0(SPSS Inc.，Chicago，IL)对6)所述基因型和表现型进行秩和检验，以检测是否有与等位基因表达比值有相关关系的tagSNP位点。以Kruska-Wallis test和ANOVA对tagSNPs和CYP1A2的表达量进行相关性分析。
在秩和检验得到部分位点的基础上，进一步挑取了一个与较显著等位基因表达不平衡(allele expression imbalance，AEI)有显著相关的位点tag09，进行了体外转录试验。设计了一个包含tag09的650bp的片段，位置从cyp1a2的5’非翻译区。选取一个tag09的杂合个体进行PCR扩增。该PCR上下游引物分别设计了KpnI和XhoI酶切位点。PCR产物以KpnI和XhoI进行酶切，然后克隆至pGL-3启动子载体(购自Promega公司).然后将其转化至常规的E.coli DH10B菌株，培养后挑取分别包含两个allele的序列的细菌进行培养，序列以测序验证无新发突变，确证挑取出的菌落只包含tag09位点不同的两个序列。细菌培养后以QIAGEN plasmid purification kit(Qiagen)进行质粒抽提。
将人类HepG2细胞在24孔培养盘中进行培养，密度为1x105细胞/孔，培养过夜使覆盖率为50-80％作为转染细胞。以质粒和pRL-SV40组成转染DNA mix。用jetPEI转染试剂(Polyplus Transfection Inc.)进行细胞转染。细胞转染后37℃过夜，然后以0.1％DMSO或10nM TCDD处理过夜。用市售的luciferase分析试剂盒(TMO46，Promega)进行细胞处理后，以Microlumat Plus LB 96Vluminometer(Berthold Technologies，Bad Wildbach，Germany)进行荧光检测。
试验结果
结果表明，Tag SNP09(rs11632814)与样本中的CYP1A2的拷贝数之间存在显著相关性。Tag09(SEQ ID NO：1中第761位A→G)的G等位基因比A等位基因多产生约25％的拷贝数。这提示，SNP rs11632814通过影响基因表达，调控了CYP1A2基因的功能，并影响了该基因所代谢的药物的代谢情况。
实施例2
SNP rs11632814的验证
2.1DNA提取
用常规酚氯仿法从人的血液中提取DNA，浓度校正至20ng/ul后，用于常规PCR扩增。
2.2PCR及测序引物的设计
根据SEQ ID NO：1所示的CYP1A2基因的序列，设计和合成以下引物。具体引物如下表1所示。
表1引物序列表
引物名称 序列(5′-3′) SEQID NO： 有义引物 gcgccactgc actccagcct gggcg 2 反义引物 tcacctcatt tcccatccct tcctc 3
1.2.3CYP1A2基因的PCR扩增
以提取的DNA为模板，用Taq酶，在GeneAmp 9700PCR仪上以Touchdown程序进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，63℃退火40秒，72℃延伸40秒，共10个循环，每个循环退火温度递减0.5℃；以后94℃变性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30个循环；最后72℃延伸7分钟。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证。
结果，获得1620bp的扩增产物。
1.2.4SNP的发现和检测
PCR产物经Resin树脂纯化后，用ABI-PRISMTM377DNA测序仪(美国应用生物系统公司appliedbiosystems(ABI))进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件(美国华盛顿大学http://droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)进行序列的判读和SNP确认。
结果，发现存在以下SNP：761位A→G。
实施例3
个体的药物代谢活性测定
因为已知在人体中咖啡因约90％由CYP1A2代谢，因此CYP1A2的活性高低与咖啡因的代谢快慢之间存在相关性。
在本实施例中，应用实施例2的方法，在健康的中国人群中对CYP1A2基因基于SEQ ID NO：1中的：761位A→G的SNP位点进行了基因分型。并观察不同基因型与血浆咖啡因代谢比值之间的关系。
选取20名(男性和女性各10名)年龄为18-30岁(平均年龄21±2岁)的健康受试者参与本试验，其中SEQ ID NO：1中的：761位为A和G的各10名。整个实验过程按照国家人类基因组研究伦理学准则进行，并获得了所有受试者的知情同意。
所有受试者均为非吸烟个体，在进行咖啡因代谢率检测前1周之内未曾摄入咖啡、茶、可口可乐、巧克力以及其它含咖啡因的饮料。同时，所有的受试者试验前1周之内未曾服用任何药物。
以咖啡因为测试药物，对所有受试者CYP1A2的体内活性进行测定。受试者晨起(7:00～7:30AM)空腹口服咖内因胶囊100mg。分别在服药前(0小时)和服药后(5小H)取静脉血5ml，用EDTA抗凝。
离心分离血浆和血细胞，并保存于-20℃，分别用于进行咖啡因代谢表型的测定。应用高效液相色谱。紫外检测法对血浆中咖啡因(C咖啡因)浓度及其代谢产物1，7-二甲基黄嘌呤(C代谢产物)的浓度按以下方法进行测定：
0.5ml待测血浆中加入80μM的p-羟乙基茶碱(内标)100微升和300mg硫酸胺，然后加入5ml氯仿∶异丙醇(体积比为9∶1)，振荡2分钟后于2000g 离心8分钟，取下层有机相在氮气下挥发干燥，50微升流动相重新溶解，取20微升上色谱柱。
高效液相色谱系统包括Agilent 1100系列、C18色谱柱(250mm×4mm，颗粒直径为5微米)。流动相的组成包括甲醇(A)、0.05％的醋酸(B)和乙腈(C)。采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗出条件为：0-8分钟A∶B∶C的体积比为10∶82∶8，流速为0.75ml/min；8-12分钟A∶B∶C的体积比为10∶78∶12，流速为1ml/min，柱温恒定在45℃。紫外检测的波长为282nm。
结果表明，按以下公式计算的口服咖啡因100mg后第5小时血浆中咖啡因(C咖啡因)浓度及其代谢产物1，7-二甲基黄嘌呤(C代谢产物)的浓度的比值1和2。
结果：比值1大于1(约150％)，提示SEQ ID NO：1中的：761位A→G的SNP位点后，个体的CYP1A2活性和药物代谢活性有所提高(高于普通人群)。
比值2小于1，也提示SEQ ID NO：1中的：761位A→G的SNP位点后，个体的CYP1A2活性和药物代谢活性有所提高(高于普通人群)。
实施例4
药物代谢活性检测试剂盒
如实施例1所述，SEQ ID NO：1中761位A→G的突变与药物代谢活性检测密切相关。因此，可基于这个突变设计CYP1A2基因特异性引物在以待测个体的DNA为模板进行扩增并进行检测。
制备一试剂盒(100人次)，它含有：
抽取待测男性病人的血液3ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将药物代谢活性检测预测试剂盒中的PCR引物稀释到1ìmol/ìl，以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后，用ABI-PRISMTM377DNA测序仪进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件进行序列的判读和SNP确认。
或者，将扩增产物与正常对照用变性高效液相色谱仪(DHPLC)进行色谱分析，也可检测出761位A→G。
结果表明，含761位A→G的测试对象中CYP1A2的mRNA的拷贝数比正常人群高约25％，且该位点为A的个体的将咖啡因转化为1，7-二甲基黄嘌呤的能力也比正常人群高(高约20％)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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【序列表】
<110>上海人类基因组研究中心
<120>CYP1A2基因的SNP rs11632814及其在相关药物代谢活性检测中的应用
<130>085804
<160>3
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>1620
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>(761)..(761)
<223>SNP rs11632814 A→G
<400>1
gcgccactgc actccagcct gggcgacaga gtgagactcc atctcaaaaa taataataat 60
aataataata aaataaatta aattaaataa ttgcaaggtg tggggagttt ttctgaaagg 120
gggataagtg gcaagagata cactctagtc tctctggcct ttgtcaggtg tggatgatgt 180
gatggccaga gctaccgcag ccatcttgtg accacaaggg agccagcgtg gggggaagct 240
gcattcaaag attagcagtg caaaaatgca gaaagatcct gcatttttca ggatcctggt 300
aataaacaga ggatccactc aaactggatt attagaagaa ttcaataagg gggctattta 360
caaaagtgca ggcagagcat agagaaacta acccaggata gtgtagtacc aatggactag 420
taacggaggg gagccctcac caccttgggc ctgaaggagc aaggggcagg aacccagaga 480
gacactataa ggagaggaga gctgcctagc aggtgtcttc acagacaggg tctggagggg 540
aacaacccca aactcattct tctcctaccc gcccatctta tgccagtgcc ttccattggc 600
tgaacccaac aagaagccag tgggcgggga gcccatggac aatatgcaga ggtcatcctc 660
ccagaacaca gagactcgca gagtgatcta gaggacaaag gattttcagc actacccggg 720
cctgcaatta tctttttcat ctgtttgcct gcatattggc rgtctcctcc ctgaaggcag 780
gaactgcctt actgctgtaa gtttcctcct agaacagcgg atggctgcac aacttacgct 840
caaagaatat ggttgagcac ccactatgca gcaggcactg tactagaaat caaatgaagc 900
cgggtgtggt ggctcacgac tatgatccca gcaatttggg aggcttaggc aggaggattg 960
cttgagccca ggagtttaag actagcctgg gcaacatgat gagaccctgg atctacaaga 1020
attttttaaa attagccagg catggtggtg tgtgcctgtg gtcccagcta tgcaagagac 1080
tgaaggggag gattgcttga gcccgggagg tcgaggctgc agtgagccat gatggtgcca 1140
ctatacgcca gcctgggcaa cagagcaaga ctctccaaaa aaaaaaaatc aaatgaataa 1200
aacatagcgt gcctcagttg ttcacaagct ggagagggag agtaaaacca aagcaatatg 1260
gcatcttggt gtcataccag gagagagaca tgcccaagga aggaggctct gaccagagta 1320
gggcctggag gaggtgggcc tggtaccaag tgttgaagga cttgttttaa tggagaggtg 1380
aggatgcttt gtcattaatg catcataata ttgcagtatg agtaagtatc tctaacccaa 1440
aagcaatgca tttccttgag ggtgtttgtt gaatggggaa gaagtggttg gaaggaaggt 1500
tgggtgttcc aaacagaggg aacatcatgt gtgcatgcag aaagacagaa aactagagaa 1560
attgtcccca ctggctggtg ggaaaattgt gtgaggagga agggatggga aatgaggtga 1620
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
gcgccactgc actccagcct gggcg 25
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>3
tcacctcatt tcccatccct tcctc 25