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本发明公开了一种用于乏氧检测的荧光探针及其合成方法和用途。合成方法包括如下步骤：1)在氮气保护下，以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为1∶2～10∶1的丁二酸酐、2，4-二甲基吡咯、三氟化硼乙醚，反应；依次滴加三乙胺、三氟化硼乙醚，摩尔比为5∶6～8，反应；用饱和食盐水洗，干燥，减压蒸除溶剂，用硅胶柱层析得到中间产物；2)以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为1∶1～2∶1～2∶0.1～0.2的上述中间产物、4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶，反应；过滤，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到荧光探针。本发明的荧光探针的合成简便，成本低廉，具有非常高的检测灵敏度，在荧光分子成像领域有良好的应用前景。

1.  一种荧光探针，其特征在于该荧光探针具有如下结构式：


2.  一种如权利要求1所述荧光探针的合成方法，其特征在于包括如下步骤：
1)在氮气保护下，以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为1∶2～10∶1的丁二酸酐、2，4-二甲基吡咯和三氟化硼乙醚，反应12～24h；在5～10℃下依次滴加摩尔比为5∶6～8的三乙胺和三氟化硼乙醚，，氮气保护下继续反应24～36h；用饱和食盐水洗2～3次，有机相用无水Na₂SO₄干燥，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到中间产物；
2)以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为1∶1～2∶1～2∶0.1～0.2的上述中间产物、4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，反应1～2h；过滤，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到荧光探针。

3.  一种如权利要求1所述荧光探针的用途，其特征在于用于乏氧细胞的检测分析。

一种荧光探针及其合成方法和用途
技术领域
本发明涉及化学分析，生物分析，临床医学检测领域，尤其涉及一种荧光探针及其合成方法和用途。
背景技术
乏氧是实体肿瘤的一个重要特征，许多研究表明，肿瘤的抗药性与乏氧密切相关。对肿瘤乏氧的研究具有非常重要的意义。
目前有许多体内或体外检测肿瘤乏氧组织的方法，如氧敏感微电极法、免疫组织化学技术等，这些方法均为损伤性检测方法。另外，一些无损检测技术如磁共振(MRI)分子显像技术、PET分子显像技术等，也被应用于肿瘤乏氧的显像研究，但其设备昂贵，且检测效果很大程度上受制于探针的开发，因此在基础研究中的实际应用受到限制。针对现有技术及不足，本发明提供了一种用于乏氧检测的荧光探针，其检测手段简便，灵敏度高，适合于配备荧光检测仪器的常规实验室应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种荧光探针及其合成方法和用途。
荧光探针具有如下结构式：

荧光探针的合成方法包括如下步骤：
1)在氮气保护下，以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为1∶2～10∶1的丁二酸酐、2，4-二甲基吡咯和三氟化硼乙醚，反应12～24h；在5～10℃下依次滴加摩尔比为5∶6～8的三乙胺和三氟化硼乙醚，，氮气保护下继续反应24～36h；用饱和食盐水洗2～3次，有机相用无水Na₂SO₄干燥，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到中间产物；
2)以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为1∶1～2∶1～2∶0.1～0.2的上述中间产物、4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，反应1～2h；过滤，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到荧光探针。
荧光探针用于乏氧细胞的检测分析。
本发明的优点是：1)荧光探针的合成简便，原料易得，成本低廉；2)该荧光探针具有非常高的检测灵敏度，适合微量检测，有良好的应用前景；3)该探针适合荧光显微镜、流式细胞仪、分光光度计、荧光酶标仪等多种荧光检测仪器。
附图说明
图1是探针被还原后的荧光变化情况，维生素C溶液用磷酸缓冲液PBS(pH7.4)配制，终浓度分别为0μM，50μM，100μM，150μM(从左至右)，加入探针，使其终浓度为5μM。反应5分钟后紫外光激发，拍设图像；
图2(a)是细胞用氯化钴(浓度50μM)处理48h，PBS洗后，加入探针溶液(浓度5μM)，15分钟后在荧光显微镜下拍摄；
图2(b)是细胞用PBS处理48h，加入探针溶液(浓度5μM)，15分钟后在荧光显微镜下拍摄，作为对照组。
具体实施方式
本发明的合成方程式：

实施例1
1)在氮气保护下，以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为1∶10∶1的丁二酸酐(10mmol)、2，4-二甲基吡咯(100mmol)、三氟化硼乙醚(10mmol)，反应24h；在5～10℃下依次滴加三乙胺(50mmol)、三氟化硼乙醚(80mmol)，氮气保护下继续反应36h；用饱和食盐水洗3次，有机相用无水Na2SO4干燥，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到中间产物0.25g，产率7.8％；
2)以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为1∶2∶2∶0.2的上述中间产物(0.2mmol)、4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基(0.4mmol)、二环己基碳二亚胺(0.4mmol)、4-二甲氨基吡啶(0.04mmol)，反应2h；过滤，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到荧光探针0.020g，产率18.6％。
实施例2
1)在氮气保护下，以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为1∶2∶1的丁二酸酐(10mmol)、2，4-二甲基吡咯(20mmol)、三氟化硼乙醚(10mmol)，反应12h；在5～10℃下依次滴加三乙胺(50mmol)、三氟化硼乙醚(60mmol)，氮气保护下继续反应24h；用饱和食盐水洗2次，有机相用无水Na2SO4干燥，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到中间产物0.22g，产率6.8％；
2)以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为1∶1∶1∶0.1的上述中间产物(0.2mmol)、4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基(0.2mmol)、二环己基碳二亚胺(0.2mmol)、4-二甲氨基吡啶(0.02mmol)，反应1h；过滤，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到荧光探针。最终得到中间产物0.019g，产率18.5％。
实施例3
1)在氮气保护下，以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为1∶2∶1的丁二酸酐、2，4-二甲基吡咯、三氟化硼乙醚，反应12h；在5～10℃下依次滴加三乙胺、三氟化硼乙醚，摩尔比为5∶6，氮气保护下继续反应24h；用饱和食盐水洗2次，有机相用无水Na₂SO₄干燥，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到中间产物；
2)以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为1∶1∶1∶0.1的上述中间产物、4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶，反应1h；过滤，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到荧光探针。
实施例4
1)在氮气保护下，以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为1∶10∶1的丁二酸酐、吡咯、三氟化硼乙醚，反应24h；在5～10℃下依次滴加三乙胺、三氟化硼乙醚，摩尔比为5∶8，氮气保护下继续反应36h；用饱和食盐水洗3次，有机相用无水Na₂SO₄干燥，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到中间产物；
2)以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为1∶2∶2∶0.2的上述中间产物、4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶，反应2h；过滤，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到荧光探针。
实施例5
1)将丁二酸酐(10mmol)、2，4-二甲基吡咯(20mmol)、BF₃·OEt₂(10mmol)加入到三颈烧瓶中，氮气保护下注入100ml二氯甲烷；搅拌反应12小时后，在5～10℃下依次小心滴加三乙胺(50mmol)、三氟化硼乙醚(60mmol)，氮气保护下继续反应36h；反应结束后，反应溶液用饱和食盐水洗两次(2×20mL)，有机相用无水硫酸钠干燥，之后真空旋干有机溶剂。得到的黑色油状物用硅胶柱层析分离(洗脱剂选用石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)。最终得到中间产物0.32g，产率10％。mp 190-192℃；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)6.09(s，2H)，3.33(t，J＝8.8Hz，2H)，2.64(t，J＝8.8Hz，2H)，2.53(s，6H)，2.46(s，6H)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：δ173.1，154.0，144.9，141.4，131.0，122.3，35.3，23.8，16.2，14.5；IR(film)v/cm^-1：2913，1702，1549，1510，1475，1305，1199，1155，1076，974；MS(ESI)：m/z＝319.2；HRMS(ESI)：m/z calcd for(M-H)^-319.1435，found 319.1433.
2)将上述中间产物(0.2mmol)、二环己基碳二亚胺(0.2mmol)、4-二甲氨基吡啶(0.02mmol)、4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基溶解在干燥的二氯甲烷中(10ml).室温下搅拌反应1小时。旋转蒸干溶剂，硅胶柱层析分离，得最终产物21mg，产率19％。MS(ESI)：m/z＝475.5
实施例6
探针被还原后的荧光变化情况。维生素C溶液用磷酸缓冲液PBS(pH7.4)配制，终浓度分别为0μM，50μM，100μM，150μM。加入探针，使其终浓度为5μM。反应5分钟后紫外光激发，拍设图像。
实施例7
以氯化钴处理的乏氧细胞模型为例，使用探针对乏氧细胞进行成像。细胞用氯化钴(浓度50μM)处理24h，PBS洗后，加入探针溶液(浓度5μM)。15分钟后在荧光显微镜下拍摄。