一种利用玉米芯生产L-乳酸的方法及其专用米根霉 【技术领域】
本发明涉及一种利用玉米芯生产L-乳酸的方法及其专用米根霉。
背景技术
乳酸(Lactic acid)，又名2-羟基丙酸，是需求量很大的一种有机酸。乳酸及其盐类和酯类广泛应用于食品、医药、农业和化工等行业。由于人体只能代谢和利用L-乳酸，因此，世界卫生组织提倡将L-乳酸作为食品添加剂和内服药，取代目前普遍使用的DL-乳酸。近年来，L-乳酸作为生产聚乳酸的原料而倍受重视，聚乳酸有望在将来代替PVC、PP等各种不可生物降解的塑料，以消除“白色污染”所造成的环境危机。此外，由于聚乳酸具有良好的生物相容性，被广泛用作医用材料，如药物缓释材料、组织工程材料、手术缝合线和骨折固定件等，是目前最有发展前途的可生物降解的高分子材料，备受国内外关注。
自然界中可产生乳酸的微生物很多，但产酸能力强、可以应用到工业上的只有霉菌中的根霉属和细菌中的乳酸菌类。其中，根霉属中常用的菌种有米根霉、行走根霉、小麦曲根霉和美丽根霉；用于工业生产的乳酸菌主要有乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属和足球菌属等。由于米根霉发酵生产乳酸具有光学纯度高、营养需求简单、好氧发酵及产物容易提纯等优点，而成为国内外生产L-乳酸普遍采用的菌种。
传统乳酸发酵所用的原料主要是葡萄糖或淀粉类原料，如果能够以植物纤维为原料发酵生产乳酸，则将扩大其原料的来源，有效降低原料的成本。我国是玉米生产大国，年产玉米1.1亿-1.3亿吨，每年有3000万吨的玉米芯，而玉米芯的利用不足，大多当作柴火烧掉，同时引发了许多环境问题，如何有效地将玉米芯转化为能源或其它工业产品有着极其深远的意义。
夏黎明等研究了以玉米芯纤维残渣为底物利用纤维素酶与米根霉同时糖化发酵生产L-乳酸，发酵70小时，L-乳酸产量为25.6g/L，虽然产酸量低，但该方法具有较高的潜在应用和研究价值(夏黎明等.纤维素酶和米根霉同时糖化发酵纤维素为L-乳酸.食品发酵工业，2000，(3)：6-9)。Ruengruglikit等利用一种具有纤维素酶和木聚糖酶的商品苹果汁加工用酶Rapidase Pomaliq及米根霉NRRL-395同时糖化发酵生产L-乳酸，每千克玉米芯可产生299.4g乳酸(Ruengruglikit C，Hang Y D.L(+)-Lactic acid production from corncobs by Rhizopus oryzae NRRL-395.Lebensm.-Wiss.u-Technol，2003，(36)：573-575)，该方法明显提高了乳酸的产量。
目前，发酵法生产乳酸的培养基原料以淀粉、糖、粮食为主，采用的菌种主要有乳酸菌属(Lactobacillus)和根霉属(Rhizopus)等。专利号为ZL 03814886.2的专利中公开了一种以淀粉为原料，以中度嗜热产乳酸细菌为生产菌株，发酵生产乳酸的方法；还有一个中国发明专利中公开了一种以多种单糖或双糖为原料，以乳酸细菌为生产菌株，发酵生产乳酸的工艺；申请号为01109905.4的专利中公开了一种以玉米、大米、甘薯、淀粉等为原料，添加淀粉酶液化，再糖化，然后接入耐高糖、高酸和高温的德式乳杆菌yjs-2-1和米根霉L-A6，并添加适量的辅料(麸皮、麦根、玉米浆和麸皮水解液)，生产高浓度DL-乳酸和L-乳酸的方法。以上专利均以淀粉和大米等粮食为原料，以乳酸菌为发酵菌株生产乳酸，一方面原料成本较高，另一方面，乳酸细菌对营养要求高且发酵产物中含有DL-乳酸，光学纯度不高，为后续工作带来麻烦，若能利用废弃的玉米芯为原料发酵生产乳酸，则可以有效的降低生产成本。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种利用米根霉(Rhizopus oryzae)发酵生产L-乳酸的方法；
所述方法中，发酵培养基的组成为：碳源、氮源、无机盐和用于控制发酵液pH值的中和剂；所述碳源为玉米芯纤维渣酶解液和玉米芯酸解液中的至少一种；所述氮源为尿素、硫酸铵、氯化铵和蛋白胨中的至少一种；所述无机盐为KH2PO4、MgSO4·7H2O和ZnSO4·7H2O中的至少一种；所述培养基的pH为5-7；
上述方法中，所述玉米芯纤维渣酶解液是按照如下方法制备的：将玉米芯用酸浸泡后进行高压处理，收集纤维渣，加入纤维素酶进行酶解，收集滤液，得到玉米芯纤维渣酶解液；所述玉米芯酸解液是按照如下方法制备的：将玉米芯用酸浸泡后进行高压处理，收集滤液，过离子交换柱，再收集滤液，得到玉米芯酸解液；所述高压至少为0.07MPa。
在制备玉米芯纤维渣酶解液时，所述玉米芯和酸的配比为1g玉米芯：(5-30)mL酸；所述纤维渣和纤维素酶的配比为1g纤维渣：(200-800)U纤维素酶。
所述发酵培养基的碳源为玉米芯纤维渣酶解液和玉米芯酸解液的至少一种。
所述发酵培养基中的氮源为氯化铵，所述氯化铵的浓度为0.5-3.0g/L。
所述发酵培养基中的无机盐为KH2PO4、MgSO4·7H2O和ZnSO4·7H2O，所述KH2PO4的浓度为0.1-1.0g/L；所述MgSO4·7H2O的浓度为0.1-1.0g/L；所述ZnSO4·7H2O的浓度为0.01-0.1g/L。
所述用于控制发酵液pH值的中和剂为CaCO3、Na2CO3和NaOH中的至少一种，所述中和剂为CaCO3，所述CaCO3的浓度为40-80g/L。
米根霉的发酵条件为20-50℃静置培养36-72h。
所述米根霉为米根霉GY-18，其保藏号为CGMCC 2681。
保藏号为CGMCC 2681的米根霉GY-18也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的米根霉GY-18是从土壤中筛选得到的，鉴定为米根霉(Rhizopusoryzae)。米根霉GY-18已于2008年9月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC 2681。
本发明以玉米芯为原料，将玉米芯用酸进行预处理，将获得的纤维渣与酸解液分别进行酶解与去离子处理后单独或合并作为底物发酵生产乳酸。结果表明，米根霉GY-18CGMCC 2681不但能够利用高浓度的葡萄糖，而且能够较好的利用木糖，从而高效利用玉米芯地酶解液与酸解液发酵生产L-乳酸。以葡萄糖为原料，利用米根霉GY-18CGMCC 2681生产L-乳酸，L-乳酸产量最高可达115.3g/L，转化率为72.1％；以木糖为原料，利用米根霉GY-18 CGMCC 2681生产L-乳酸，转化率达80.4％；以玉米芯为原料，利用米根霉GY-18CGMCC 2681生产L-乳酸，L-乳酸的产量可达20-70g/L。本发明方法可以有效降低原料成本，具有较好的工业应用前景。
【附图说明】
图1为菌株GY-18代谢不同浓度葡萄糖的L-乳酸产量及转化率
图2为菌株GY-18代谢不同浓度木糖的L-乳酸产量及转化率
图3为菌株GY-18代谢40g/L葡萄糖和40g/L木糖的混糖溶液产L-乳酸的过程曲线
图4a为菌株GY-18代谢玉米芯水解液的产L-乳酸过程曲线
图4b为菌株GY-18代谢玉米芯水解液产乳酸换算为每克干玉米芯产乳酸量的过程曲线
【具体实施方式】
实施例1、以葡萄糖为原料发酵生产L-乳酸
1、菌种的分离和纯化
1)富集分离
将大米饭置于铺有二层湿滤纸的培养皿中(滤纸用质量百分含量为1％的乳酸喷湿)，再将大米饭表面用质量百分含量为1％的乳酸喷湿。取1g土样(取自山西运城奶牛场附近)撒于米饭表面，盖上皿盖，30℃培养3～4天。
2)平板分离纯化
挑取培养皿中的单菌落接种于单菌落分离初筛培养基中，30℃培养3～4天。将产生较大黄色变色圈的单菌落转接至PDA培养基上并以相同条件培养，得到米根霉(Rhizopus oryzae)GY-18。
单菌落分离初筛培养基的组成为：普通PDA培养基中加入脱氧胆酸钠和溴甲酚绿，使二者在培养基中的浓度为0.1g/L。
2、菌株的鉴定
上述步骤1筛选得到的米根霉(Rhizopus oryzae)GY-18菌落稠密，菌丝初期为白色，后变为灰褐色至黑褐色，菌丝无隔膜、有分枝和假根，营养菌丝体上产生匍匐枝，匍匐枝的节间形成特有的假根，从假根处向上丛生直立、不分枝的孢囊梗，顶端膨大形成圆形的孢子囊，囊内产生孢囊孢子。孢子囊内囊轴明显，球形或近球形，具有米根霉典型的产孢结构。
基于以上特征，将本株米根霉GY-18鉴定为米根霉(Rhizopus oryzae)，并于2008年9月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC 2681。
3、以葡萄糖为原料发酵生产乳酸
发酵培养基的配制：葡萄糖分别为60、80、100、120、140、160和180g、NH4Cl2.0g、KH2PO4 0.3g、MgSO4·7H2O 0.25g、ZnSO4·7H2O 0.08g、CaCO3 80g(单独灭菌)，补水至1000mL，调节pH至6.0，115℃高压灭菌30min备用。
将上述步骤1筛选得到的米根霉GY-18CGMCC 2681接于PDA培养基上，25-35℃培养箱中培养2-3天，待孢子成熟后，用20％(质量百分含量)的甘油洗脱孢子，制成1×105-1×108/mL的孢子悬浮液。取20mL上述孢子悬浮液接种于1000mL上述发酵培养基中，35℃条件下180rpm(旋转半径15mm)培养72h，将所得发酵液用等体积1mol/L的硫酸溶液沉淀其中的钙离子，12000rpm离心10min，取上清，即为待检测的发酵液。
高效液相色谱法检测发酵液中L-乳酸的浓度，具体检测条件如下：色谱柱为迪马公司的C18反相柱，250×4.6(5μm)，流动相采用0.005mol/L的H2SO4溶液，流速0.8mL/min，检测波长210nm，进样量20μL，柱温为室温，流动相使用前用0.45μm孔径的合成纤维素酯膜进行抽滤。
标准曲线的制作：称取L-乳酸标准品(Fluka公司，纯度为98％)0.1g，用重蒸水定容到100mL，作为标样品储备液。分别吸取1、3、5、7、9mL标准品储备液加入到10mL容量瓶中，重蒸水定容，即为用于制作标准曲线的标准品。每次进样20μL，每个浓度重复5次，取平均值，建立标准曲线的外标方程为：Y＝(1.279×106)X-0.0165，r＝0.99。式中，X为峰面积，Y为样液浓度。
实验设3次重复，按照下述公式计算发酵液中L-乳酸的浓度和葡萄糖的转化率。
L-乳酸浓度＝[(1.279×106)×峰面积-0.0165]×稀释倍数
葡萄糖转化率＝L-乳酸浓度/残糖浓度×100％
结果如图1所示。图1中，深色柱子表示L-乳酸的产量，浅色柱子表示转化率。从图1中可以看出，随着葡萄糖浓度的增加，乳酸的产量先升高后下降，葡萄糖转化率逐渐降低，当葡萄糖浓度达160g/L时，产酸量最高，可达123g/L，此时葡萄糖转化率可达78.3％，更高浓度的葡萄糖对发酵会产生抑制，使转化率降低。以上实验结果表明，米根霉GY-18CGMCC 2681具有良好的发酵性能，在72h内乳酸的产量为45.9-115.3g/L，葡萄糖的转化率为56.4-76.5％。
实施例2、以木糖为原料发酵生产乳酸
发酵培养基的配制：木糖分别为20、40、60、80和100g、NH4Cl 2.0g、KH2PO40.3g、MgSO4·7H2O 0.25g、ZnSO4·7H2O 0.08g、CaCO3 40g，补水至1000mL，调节pH至6.0，115℃高压灭菌30min备用。
将上述实施例1步骤1筛选得到的米根霉GY-18 CGMCC 2681接于PDA培养基上，25-35℃培养箱中培养2-3天，待孢子成熟后，用20％(质量百分含量)的甘油洗脱孢子，制成1×105-1×108/mL的孢子悬浮液。取10mL上述孢子悬浮液接种于1000mL上述发酵培养基中，35℃条件下180rpm(旋转半径15mm)培养120h，将所得发酵液用等体积1mol/L的硫酸溶液沉淀其中的钙离子，12000rpm离心10min，取上清，即为待检测的发酵液。
高效液相色谱法检测发酵液中L-乳酸的浓度，具体检测条件同实施例1。
实验设3次重复，发酵液中L-乳酸的浓度和木糖的转化率的计算方法与实施例1相同。
结果如图2所示。图2中，深色柱子表示L-乳酸的产量，浅色柱子表示转化率。从图2中可以看出，随着木糖浓度的增加，乳酸的产量先升高后下降，当木糖浓度高于60g/L时，木糖的转化率急剧下降，说明木糖的底物抑制作用较葡萄糖明显，综合考虑，当木糖浓度为40g/L时，乳酸产量和木糖的转化率都比较高，此时乳酸的产量为32.1g/L，木糖的转化率为80.4％，发酵液中的残糖含量为5-8g/L。以上实验结果表明，米根霉GY-18 CGMCC 2681具有良好的发酵性能，在120h内乳酸的产量为14.4-43.6g/L，木糖的转化率为26.8-80.4％。
实施例3、以葡萄糖和木糖为原料发酵生产乳酸
发酵培养基的配制：葡萄糖40g、木糖40g、NH4Cl 2.0g、KH2PO4 0.3g、MgSO4·7H2O 0.25g、ZnSO4·7H2O 0.08g、CaCO3 40g，补水至1000mL，调节pH至6.0，115℃高压灭菌30min备用。
将上述实施例1步骤1筛选得到的米根霉GY-18CGMCC 2681接于PDA培养基上，25-35℃培养箱中培养2-3天，待孢子成熟后，用20％(质量百分含量)的甘油洗脱孢子，制成1×105-1×108/mL的孢子悬浮液。取20mL上述孢子悬浮液接种于1000mL上述发酵培养基中，35℃条件下180rpm(旋转半径15mm)培养120h，将所得发酵液用等体积1mol/L的硫酸溶液沉淀其中的钙离子，12000rpm离心10min，取上清，即为待检测的发酵液。
高效液相色谱法检测发酵液中L-乳酸的浓度，具体检测条件同实施例1。
实验设3次重复，发酵液中乳酸的浓度与实施例1相同。
结果如图3所示。从图3中可以看出，当葡萄糖与木糖混合发酵时，米根霉GY-18CGMCC 2681优先利用葡萄糖，发酵24h时代谢完葡萄糖，此前木糖含量基本不变，经过一段时间的适应期，于36h开始代谢木糖，96h时基本完成产酸过程，此时乳酸的产量为45.0g/L，发酵液无残糖。以上实验结果表明，米根霉(Rhizopus oryzae)GY-18CGMCC 2681具有良好的发酵性能，在120h内乳酸的产量为45.2g/L。
实施例4、利用玉米芯酸解液发酵生产乳酸
称取100g玉米芯(20-40目)(山东龙力生物科技有限公司)，按1∶10的配比加入1000mL体积百分含量为1％的H2SO4，室温浸泡24h后加入高压锅中，121℃、0.1MPa水解40min，将水解产物用布氏漏斗进行抽滤，收集滤液。过离子交换柱脱离子(732强酸性阳离子交换树脂，D311弱碱性阴离子交换树脂)，用3mol/L的NaOH调pH值为6.0，所得溶液即为玉米芯酸解液。
以上述制备的玉米芯酸解液为碳源，取玉米芯酸解液50mL，向其中添加NH4Cl0.1g、KH2PO4 0.015g、MgSO4·7H2O 0.0125g、ZnSO4·7H2O 0.04g、CaCO3 2g(分开灭菌)，调节pH至6.0，115℃高压灭菌30min备用。
将上述实施例1步骤1筛选得到的米根霉GY-18 CGMCC 2681接于PDA培养基上，25-35℃培养箱中培养2-3天，待孢子成熟后，用20％(体积百分含量)的甘油洗脱孢子，制成1×105-1×108/mL的孢子悬浮液。取0.02mL上述孢子悬浮液接种于50mL上述发酵培养基中，35℃条件下180rpm(旋转半径15mm)培养120h，将所得发酵液用等体积1mol/L的硫酸溶液沉淀其中的钙离子，12000rpm离心10min，取上清，即为待检测的发酵液。
高效液相色谱法检测发酵液中L-乳酸的浓度，具体检测条件同实施例1。
实验设3次重复，结果如图4所示。其中，图4a为菌株GY-18代谢玉米芯水解液的产L-乳酸过程曲线，图4b为菌株GY-18代谢玉米芯水解液产乳酸换算为每克干玉米芯产乳酸量的过程曲线。结果表明，米根霉GY-18CGMCC 2681具有良好的发酵性能，在120h内乳酸的产量为15-30g/L。
实施例5、利用玉米芯纤维渣酶解液发酵生产乳酸
称取100g玉米芯(20-40目)(山东龙力生物科技有限公司)，按1∶10的配比加入1000mL体积百分含量为1％的H2SO4，室温浸泡24h后加入高压锅中，121℃、0.1MP水解40min，将水解产物用布氏漏斗进行抽滤，收集纤维渣，将纤维渣用蒸馏水冲洗至中性，105℃恒温干燥。取5g上述干燥后的纤维渣，在50mL pH为5.0的柠檬酸缓冲液中加入0.8g酶活力为2500U/g的纤维素酶(购自肇东市日成酶制剂有限公司)，50℃180rpm的条件下酶解24h后，收集滤液，得到纤维渣酶解液。
以玉米芯酶解液为碳源，取玉米芯酶解液50mL，向其中添加NH4Cl 0.1g、KH2PO4 0.015g、MgSO4·7H2O 0.0125g、ZnSO4·7H2O 0.04g、CaCO3 2g(分开灭菌)，调节pH至6.0，115℃高压灭菌30min备用。
将上述实施例1步骤1筛选得到的米根霉GY-18CGMCC 2681接于PDA培养基上，25-35℃培养箱中培养2-3天，待孢子成熟后，用20％(质量百分含量)的甘油洗脱孢子，制成1×105-1×108/mL的孢子悬浮液。取0.02mL上述孢子悬浮液接种于50mL上述发酵培养基中，35℃条件下180rpm(旋转半径15mm)培养72h，将所得发酵液用等体积1mol/L的硫酸溶液沉淀其中的钙离子，12000rpm离心10min，取上清，即为待检测的发酵液。
高效液相色谱法检测发酵液中L-乳酸的浓度，具体检测条件同实施例1相同。
实验设3次重复，结果如图4所示。结果表明，米根霉GY-18CGMCC 2681具有良好的发酵性能，在72h内L-乳酸的平均产量为20-50g/L。
实施例6、利用玉米芯纤维渣酶解液和玉米芯酸解液发酵生产乳酸
将上述实施例4制备的玉米芯酸解液加热浓缩至10mL，加入到50mL上述实施例4制备的酶解液中，得到玉米芯纤维渣酶解液和玉米芯酸解液的混合溶液。
以玉米芯纤维渣酶解液和玉米芯酸解液的混合溶液60mL为碳源，向其中添加NH4Cl 0.12g、KH2PO4 0.018g、MgSO4·7H2O 0.015g、ZnSO4·7H2O 0.0048g、CaCO3 2.4g(分开灭菌)，调节pH至6.0，115℃高压灭菌30min备用。
将上述实施例1步骤1筛选得到的米根霉GY-18CGMCC 2681接于PDA培养基上，25-35℃培养箱中培养2-3天，待孢子成熟后，用20％(质量百分含量)的甘油洗脱孢子，制成1×105-1×108/mL的孢子悬浮液。取20mL上述孢子悬浮液接种于1000mL上述发酵培养基中，35℃条件下180rpm(旋转半径15mm)培养120h，将所得发酵液用等体积1mol/L的硫酸溶液沉淀其中的钙离子，12000rpm离心10min，取上清，即为待检测的发酵液。
高效液相色谱法检测发酵液中乳酸的浓度，具体检测条件同实施例1。
实验设3次重复，结果如图4所示。结果表明，米根霉GY-18CGMCC 2681具有良好的发酵性能，在120h内乳酸的产量为20-70g/L。