小鼠Akt1基因启动子荧光素酶质粒的构建方法 【技术领域】
本发明涉及一种小鼠Akt1基因启动子荧光素酶质粒的构建方法。
背景技术
随着全世界人口和寿命的增长，癌症发病率和死亡率持续上升，癌症继续流行。PI3K/Akt途径是人类肿瘤中最为活跃的细胞途径之一，导致癌细胞的生存和增长，途径中的许多成分是新药研发的候选靶标。Akt1是该信号途径的活性中心，在癌症中是联系上游突变调控蛋白和下游存活信号途径蛋白的中间环节。2007年6月研究人员在人类乳腺癌、结肠直肠癌和卵巢癌中发现了Akt1中的一个复发突变(E17K)，该突变通过增强其膜联系作用来激发这种激酶，这将Akt1与癌症的发生直接关联了起来。这一发现可以说是癌症生物学中具有启示意义的一个发现，证实Akt1是乳腺癌、结肠癌和卵巢癌的致癌基因。Akt1抑制药物有可能很快走入临床研究，将对包括肺癌、乳腺癌、直结肠癌和卵巢癌在内的肿瘤治疗以及个性化治疗产生重大影响，并有可能改变抗肿瘤药物的研究方向。近年来，我们通过抑制PI3K信号通路治疗肿瘤，临床前的研究均表现出良好的结果。在国家863、国家自然科学基金等国家级科研项目基金的大力支持下，该通路的抑制剂已经非常接近成药了。在相关的基础研究方面，我们通过分子克隆技术构建小鼠Akt1基因启动子荧光素酶质粒，而且对影响小鼠Akt1基因启动子转录活性药物也展开了深入的研究。因此，Akt1基因启动子荧光素酶质粒有望成为探讨抗肿瘤药物筛选有效的研究手段，具有良好运用前景。可以预见，今后很多发育生物学和肿瘤机制研究将围绕小鼠Akt1基因启动子荧光素酶质粒。同时，影响小鼠Akt1基因启动子转录活性研究也将引起高度重视。通过构建小鼠Akt1基因启动子荧光素酶质粒，方法简单易行，在抗肿瘤药物筛选中具有有广泛的应用前景。
本发明首次利用分子克隆技术构建小鼠Akt1基因启动子荧光素酶质粒，为研究Akt1在抗肿瘤药物筛选找到了合适的研究途径。此法也可用于肿瘤发病机制的研究和应用。
【发明内容】
本发明目的是通过分子克隆的方法构建小鼠Akt1基因启动子荧光素酶质粒，以便用于抗肿瘤药物筛选及肿瘤学的研究。
本发明所采用的技术方案是：
一种小鼠Akt1基因启动子荧光素酶质粒的构建方法，它包括下列步骤：
(1)将包含小鼠Akt1基因启动子片段插入pBluescriptIISKM(pBS)载体的XbaI位点间，构建包含小鼠Akt1基因启动子片段的pBS/XbaI4.5质粒；
(2)将包含小鼠Akt1基因第一编码外显子ATG片段插入pBluescriptIISKM载体的NotI位点间，构建包含小鼠Akt1基因第一编码外显子片段的pBS/LA1.9质粒；
(3)将小鼠Akt1基因启动子插入pGL3-basic载体的SamI和NcoI位点间，构建小鼠Akt1基因启动子荧光素酶质粒pGL3/mAkt1-pro。
上述的构建方法，其特征在于通过探针检测小鼠Akt1基因启动子序列，其扩增核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
上述的构建方法，其特征在于所述构建包含小鼠Akt1基因启动子片段的真核表达载体为pBluescriptIISKM，小鼠Akt1基因启动子核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
上述的构建方法，其特征在于所述构建包含小鼠Akt1基因第一编码外显子ATG片段(1.9kb)的真核表达载体为pBluescriptIISKM，其扩增核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
上述的构建方法，其特征在于所述构建小鼠Akt1基因启动子的真核表达载体为pGL3-basic，小鼠Akt1基因启动子荧光素酶质粒核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
具体的操作如下：
(1)用含有小鼠Akt1基因的BAC(bMQ-94N15)用XbaI限制性内切酶消化，插入到用XbaI限制性内切酶消化并用碱性磷酸酶处理的pBluescriptIISKM质粒中，转化后建立一个小型基因组文库。然后用包含有Akt1基因Exon 0的片段一对引物作为探针，PCR后回收，对上述小型基因组文库进行筛选，得到一个含有大小约4.5kb的片段，命名为pBS/XbaI4.5。将该4.5kb进行全序列测定，获得该片段全长序列；
(2)参考GeneBank AF534134的小鼠Akt1启动子序列，设计一对引物，以小鼠基因组DNA为模板，用PCR法高保真扩增，加“A”后连入pGEMT-easy载体，纯化连接产物，将纯化产物用NotI酶切后插入到用碱性磷酸酶处理的pBluescriptIISKM质粒中，挑取单克隆，用XbaI进行酶切鉴定，得到插入方向正确的克隆，命名为pBS/LA1.9；
(3)将pBS/XbaI4.5和pBS/LA1.9分别用XbaI酶切后进行连接，挑取单克隆并用BamHI鉴定插入方向，得到插入方向正确的克隆；然后用EcoRV和NcoI限制性内切酶消化，回收大片段(大小约5kb).用SmalI和NcoI限制性内切酶消化质粒pGL3-basic，与上述回收的大片段(大小约5kb)进行连接，即获得小鼠Akt1基因启动子荧光素酶质粒，并进行序列测定，命名为pGL3/mAkt1-pro。
本发明的有益效果体现在：本发明利用分子克隆技术构建小鼠Akt1基因启动子荧光素酶质粒，从而便于对抗肿瘤药物的筛选研究。
【附图说明】
图1为小鼠Akt1基因启动子荧光素酶质粒构建流程图；
图2为小鼠Akt1基因启动子荧光素酶质粒结构图谱。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例：利用分子克隆技术构建小鼠Akt1基因启动子荧光素酶质粒。
利用发明内容中所述的方法，构建小鼠Akt1基因启动子荧光素酶质粒具体方法如下：
(一)构建包含小鼠Akt1基因启动子片段的pBS/XbaI4.5质粒；
(1)首先将bMQ-94N15(中国大连Takara公司提供)用XbaI限制性内切酶(中国大连Takara公司提供)消化2小时；
10×M Buffer 3ul
BSA(中国大连Takara公司提供) 3ul
XbaI(10U/ul) 1ul
bMQ-94N15 3ul
ddH2O(双蒸馏水) 20ul
Total 30ul
pBluescriptIISKM(中国大连Takara公司提供)用XbaI限制性内切酶消化；
10×M Buffer 3ul
BSA 3ul
XbaI(10U/ul) 1ul
pBluescriptIISKM 3ul
ddH2O 20ul
Total 30ul
消化1小时后，再用碱性磷酸酶处理1小时，回收并纯化酶切产物，体系如下：
10×CIAP Buffer 3.5ul
CIAP(中国大连Takara公司提供，10U/ul) 1.5ul
Mix 30ul
Total 35ul
将bMQ-94N15酶切产物插入到用XbaI限制性内切酶消化并用碱性磷酸酶处理的pBluescriptIISKM质粒中，转化后建立一个小型基因组文库，反应体系如下：
10×T4DNA Ligase Buffer 2ul
T4DNA Ligase(中国大连Takara公司提供，350U/ul) 2ul
bMQ-94N 15Enzyme Digestion 12ul
pBluescriptIISKM 4ul
Total 20ul
将连接产物转化，涂板，37℃烘箱16小时。用标记方向的尼龙滤膜覆盖在培养板上进行转膜。尼龙滤膜用2×SSC浸泡，待用。
(2)设计小鼠Akt1启动子的探针引物序列如下：
Primer1 5’GCCTCTTGAGAGTCAAACTG 3’
Primer2 5’ACTTCCTGCTCCTACTCCGA 3’
以小鼠基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增片段大小为650bp：
10×Pfu Buffer 5ul
dNTP 1ul
Primer1 1ul
Primer2 1ul
Pfu(中国南京天为公司提供，100U/ul) 0.5ul
DNA 2ul
ddH2O 39.5ul
Total 50ul
95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃褪火30s，72℃延伸50s，28个循环，
最后72℃延伸7min
(3)核酸杂交
1)将固定好的膜放入6×SSC(6×盐水柠檬酸钠，NaCl 58.4g，柠檬酸钠29.4g，加dH2O(蒸馏水)至1000ml，高压灭菌)的皿中2min，直到膜自下而上完全润湿；
2)轻轻将润湿的膜卷成圆柱状放入杂交瓶中，按每平方厘米0.2ml加入预杂交液(6×SSC，5×Denhardt液[聚蔗糖(Ficoll，400型)10g，聚乙烯吡咯烷酮360(PVP-360)10g，牛血清白蛋白(BSA，组分V)10g，ddH2O to 1000ml]，0.5％SDS，1ug/ml的poly(A)，50％甲酰胺(v/v)，100ug/ml的鲑鱼精DNA，10％硫酸葡聚糖，现用现配)，将瓶盖凝紧；
3)将杂交管放入42℃杂交炉中，预杂交5小时；
4)探针标记，按GE公司Healthcare Lifesciences Random Primer DNALabeling Kit方案进行；
5)将预杂交液从杂交瓶中倒出，加入新鲜的含有探针的杂交液；
6)拧紧瓶盖，置于42℃杂交炉中杂交12小时；
7)倒去杂交液，夹住露出瓶口地一角，将多余的杂交液晾干；
8)将膜浸入100ml 2×SSC中漂洗5min；
9)将膜浸入100ml洗膜液I(2×SSC，0.1％SDS)中，42℃轻轻震荡15min；
10)将膜浸入100ml洗膜液II(1×SSC，0.1％SDS)中，42℃轻轻震荡10min；
11)将膜浸入100ml洗膜液III(0.5×SSC，0.1％SDS)中，42℃轻轻震荡10min；
12)将膜浸入100ml洗膜液IV(0.1×SSC，0.1％SDS)中，56℃轻轻震荡15min；当放射强度指示数值是环境背景的1-2倍时是洗膜的终止点。
13)将洗好的膜放入100ml 2×SSC中漂洗2min；
14)将膜从洗膜液中捞出，放于滤纸上晾干，膜表面无可见水为止；
15)用保鲜膜包裹膜，膜与保鲜膜之间不能有气泡，膜的正面朝上，放入暗盒中(双向增感屏)；
16)在暗室的红光下，贴附两张X光片，每一片都用透明胶带固定，合上暗盒，置于-70℃中曝光2天；
17)在暗室的红光灯下，取出X光片，置于显影液中至杂交带显现出来；
18)转入去离子水中漂洗，然后放入定影液中定影至清亮；
19)自来水冲洗干净，晾干，读片。
(4)通过对上述小型基因组文库进行筛选，得到一个含有大小约4.5kb的片段，命名为pBS/XbaI4.5。将该4.5kb进行全序列测定，获得该片段全长序列。
(二)包含有小鼠Akt1基因第一编码外显子ATG片段pBS/LA1.9的构建；
(1)参考GeneBank AF534134的小鼠Akt1基因序列，设计一对引物，在一个引物中引入NcoI识别位点(CCATGG)，设计引物序列如下；
Primer3 5’CGGTCTCCCGGATCCGGGAT 3’
Primer4 5’CCATGGTATCCGTGGCCCCC 3’
(2)以小鼠基因组DNA为模板，用Pfu酶高保真扩增；
10×Pfu Buffer 5ul
dNTP 1ul
Primer3 1ul
Primer4 1ul
Pfu(100U/ul) 0.5ul
DNA 2ul
ddH2O 39.5ul
Total 50ul
95℃预变性5min，95℃变性30s，59℃褪火30s，72℃延伸2min，28个循环，最后72℃延伸7min。
(3)上述PCR扩增产物加入0.5ul Taq酶，72℃延伸10min加“A”，琼脂糖凝胶电泳后割胶回收，与pGEMT-easy(中国大连Takara公司提供)载体连接，反应体系如下：
10×T4DNA Ligase Buffer 2ul
T4DNA Ligase(350U/ul) 2ul
PCR扩增产物 12ul
pGEMT-easy 4ul
Total 20ul
16℃连接过夜，转化后涂板，37℃烘箱放置16小时，挑取单克隆，摇菌后提取质粒用EcoRI(中国大连Takara公司提供)和XbaI(中国大连Takara公司提供)进行酶切鉴定，得到插入方向正确的克隆。
(4)将(3)得到的正确的质粒用NotI(中国大连Takara公司提供)酶切，同时经过碱性磷酸酶处理的pBluescriptIISKM用NotI(中国大连Takara公司提供)酶切，两者进行连接反应，转化后涂板，37℃烘箱放置16小时，挑取单克隆，提取质粒用BamHI进行酶切鉴定，得到插入方向正确的克隆，命名为pBS/LA1.9，5’端有BamHI限制性内切酶位点，3’端有NcoI位点。
10×H Buffer 3ul
BSA 3ul
Triton X-100(中国大连Takara公司提供) 3ul
NotI 1ul
pBluescriptIISKM 2ul
ddH2O 18ul
Total 30ul
TA克隆产物酶切体系：
10×H Buffer 3ul
BSA 3ul
Triton X-100 3ul
NotI(10U/ul) 1ul
pGEMT-easy-A 6ul
ddH2O 14ul
Total 30ul
37℃酶切2h。
连接反应体系：
10×T4DNA Ligase Buffer 2ul
T4DNALigase(350U/ul) 2ul
pBluescriptIISK 3ul
pGEMT-easy-A 12ul
ddH2O 1ul
Total 20ul
16℃连接过夜。
(三)构建小鼠Akt1基因启动子荧光素酶质粒pGL3/mAkt1-pro。
(1)将pBS/XbaI4.5用XbaI限制性内切酶处理，得到4.5kb大小的片段，与用XbaI处理pBS/LA1.9的大片段进行连接反应，转化后涂板，37℃烘箱放置16小时，挑取单克隆，提取质粒用BamHI进行酶切鉴定，得到插入方向正确的克隆。
pBS/LA1.9酶切体系：
10×M Buffer 3ul
BSA 3ul
XbaI(10U/ul) 1ul
pBS/XbaI4.5 3ul
ddH2O 20ul
Total 30ul
pBS/LA1.9酶切体系：
10×M Buffer 3ul
BSA 3ul
XbaI(10U/ul) 1ul
pBS/LA1.9 3ul
ddH2O 20ul
Total 30ul
37℃酶切2h。
连接反应体系：
10×T4DNALigase Buffer 2ul
T4DNA Ligase(350U/ul) 2ul
pBS/XbaI4.5 4ul
pBS/LA1.91 2ul
Total 20ul
16℃连接过夜。
(2)然后用EcoRV(中国大连Takara公司提供)和NcoI(中国大连Takara公司提供)限制性内切酶消化，回收大片段(大小约5kb)。用SmalI和NcoI限制性内切酶消化质粒pGL3-basic(中国大连Takara公司提供)，与上述回收的大片段(大小约5kb)进行连接，即获得小鼠Akt1基因启动子荧光素酶质粒，命名为pGL3/mAkt1-pro。
pGL3-basic酶切体系：
10×T Buffer 3ul
BSA 3ul
SmaI(10U/ul) 1ul
NcoI(10U/ul) 1ul
pGL3/basic 3ul
ddH2O 19ul
Total 30ul
pBS/XbaI4.5和pBS/LA1.9连接产物的酶切体系：
10×K Buffer 3ul
BSA 3ul
EcoRV(10U/ul) 1ul
NcoI(10U/ul) 1ul
pBS/XbaI4.5-pBS/LA1.9 6ul
ddH2O 16ul
Total 30ul
37℃酶切2h。
连接反应体系：
10×T4DNA Ligase Buffer 2ul
T4DNA Ligase(350U/ul) 2ul
pBS/XbaI4.5 4ul
pBS/LA1.9 12ul
Total 20ul
16℃连接过夜。
(3)将上述连接产物转化后涂板，37℃烘箱放置16小时后挑取单克隆，提取pGL3/mAkt1-pro，用XbaI进行酶切鉴定，并进行序列测定，证实小鼠Akt1基因启动子荧光素酶质粒构建成功。
经过测序，转基因质粒载体序列结果完全正确。
小鼠Akt1基因启动子荧光素酶质粒的序列表.ST25
<110>南京大学
<120>小鼠Akt1基因启动子荧光素酶质粒构建
<160>6
<210>1
<211>650
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gcctcttgag agtcaaactg attcacttcc cacgctggcc tccctccttg gggtctggag 60
agctaggcag ggaagggcca ggtcccacaa accgggaaac ccagaccaga gctggagctc 120
tggatctgcg gcggggctcc gttacccgcg tggccctggc tcggggccac ccgagggcgg 180
cgcctgcggg gccgcgctcg cgctcacggg gtgcctcgcc ctggccgcgg gccgcgccgg 240
gggcgcccgg ggcggcggag gcggatgtgg gcgggcggcg cgggcgcggg gcggggagaa 300
ggcgggccgg cggcggcggc ggcagcaccg agtcggcggg cggccggccc agcgcggcag 360
cgcacgcgag tccgggacca gcggagcgga ccgagcagcg tcctgtggcc ggcaccgcgg 420
cggcccagat ccggccagca gcgcgcgccc ggacgccgct gccttcagcc ggccccgccc 480
agcgcccgcc cgcgggatgc ggagcggcgg gcgcccgagg ccgcggcccg gctaggccca 540
gtcgcccgca cgcggcggcc cggtgagtgc ccgcgccgcg ccctgttccg ggccgcggcc 600
accccgcttt gttcccggcc gcgccgcgcc tcggagtagg agcaggaagt 650
<210>2
<211>4621
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tctagatttc gggtgccatc taacttggga gctgtctcaa gagcatatct cactatgtag 60
ctgatgccca gacctcttag ctcaggatag tgcctgcatc ctaccaagct gccagggatg 120
agagggagga agacctctgt gagagagggg ggaagacctc tgtgaggggg gaagagggtc 180
aggaaccaca ggttggtttg tttgtttttg gtttttggtt tttttttttt tgaagattta 240
tttattatta tacataagta ctgtagctgt cttcagacgc accagaaggg ggcgtcagat 300
ctcattacgg gtggttgtga gccaccacgt ggttgctggg atttgaactc aggaccttcg 360
gaagagcagt catcttaccc gctgagccat ctcgccagcc cccgggacca gtttttgttg 420
gagagcatgg ctgcagagca ggccagtggc aagtctcagt aaggcggacc ttactcacct 480
tgtggctctg tctaggaggc ccaaagaggt gttgccaaag tgtggaccca gaaggagtcg 540
cctatccccc aacccactcc ggactcgggg gaagatagag acacaaagaa gggaggcggg 600
actggttact gcatagaaac agggctcacc acaggtagga gctgtctcca acagtggctt 660
ccaggaagag catccgagtg agaagggtca ctagagaaca gccagaaatt gctgtgttcc 720
acaagagggc gccctgctgg ctctaactgt gtagcaacgg gatgggggaa gtaggagagg 780
aggagttggg ggcctggggt gaaggtttgc tgggcgagtg atggatattt gtgtgactct 840
cagcctctga aggccactct cagggtcagg gatactgctg gagcagaaca gaactgctgc 900
tgagcctctg acttagcgcc ctggaggctc tctgagctgg ggcagctgtg cagcagatag 960
ggcacagaac agagcccccc atccccatcc ccgtctgaag ggtatggggc gtggctgaga 1020
ggagagtgag ttcttctccg ggagtggggt gtgcttccca ggtcagcccc aggagcccga 1080
gaaggagctc cgatttccat cctgggcgat agcgtggact actaaatcta ccctcttgtt 1140
tacactcctg gtgaactctg acccttgtat gaaaaacaaa aaatgccccc tggttaaaaa 1200
taccaaacac atgaaggtaa attcacaaaa gggttactat caagtcgggc ttctgggacg 1260
agggaggggc cctgcgcagg aactgctgag gctggccgaa gggggaagga ctgaggatgg 1320
ataagaggca ggaaccacct tgactcttca attccgggac accataagga accgcccccc 1380
aagcctcacc catctgagtc cacagcaagg tcttggctga ctgagtccta cccctgaatc 1440
tgccccctct gggtgtccag gtgtgctccc gtcctccctg tcacctgggg agtccttatc 1500
agttgctgtg gcaggcagta ctgggttgga tgagccctca atagccttct ttcttgtgtt 1560
ggctggcctt taggacaccg gtgaccggtc tctcccggct cccaagatgg ggacagttgg 1620
gcctcttgag agtcaaactg attcacttcc cacgctggcc tccctccttg gggtctggag 1680
agctaggcag ggaagggcca ggtcccacaa accgggaaac ccagaccaga gctggagctc 1740
tggatctgcg gcggggctcc gttacccgcg tggccctggc tcggggccac ccgagggcgg 1800
cgcctgcggg gccgcgctcg cgctcacggg gtgcctcgcc ctggccgcgg gccgcgccgg 1860
gggcgcccgg ggcggcggag gcggatgtgg gcgggcggcg cgggcgcggg gcggggagaa 1920
ggcgggccgg cggcggcggc ggcagcaccg agtcggcggg cggccggccc agcgcggcag 1980
cgcacgcgag tccgggacca gcggagcgga ccgagcagcg tcctgtggcc ggcaccgcgg 2040
cggcccagat ccggccagca gcgcgcgccc ggacgccgct gccttcagcc ggccccgccc 2100
agcgcccgcc cgcgggatgc ggagcggcgg gcgcccgagg ccgcggcccg gctaggccca 2160
gtcgcccgca cgcggcggcc cggtgagtgc ccgcgccgcg ccctgttccg ggccgcggcc 2220
accccgcttt gttcccggcc gcgccgcgcc tcggagtagg agcaggaagt ggccgagcgg 2280
aggcctgggc ggggagcgcg cggggccggg ctggtcgcgc aggaggccca cgccggcgag 2340
ggtgcgggcg gccgctgcgt gaccttgggt ggccgctcca cggggccagg tcgcgggaga 2400
ggggcgctgt tggtgtgcgc agtgggggcc ggtgcgccct ggggcctggg gctgcccggg 2460
cactcggcca gcgagggtag gagaaaggct cgccccgcgg cctgcgtgcg gtgggagggc 2520
cctgggaagg agaactcatt tcccacggac agaaagttgt gcgcggtggc acagtgccca 2580
ggctagccca caaaggactg ctaaccctcc tgggcccgga agctgcttcc tggactaggt 2640
ggtttctgga ggtgccgggg gggggggggg ccttgaggac ggcgtggact cggtctcccg 2700
gatccgggat actggctgag ctgatggaat tgtctaaaga ggactggttt ctaagttggg 2760
cggtggtgga accttgggcc tctgctgtgt ggccaaactc ctccttcccc caggcccctg 2820
gtcttgctcc aggtggctag ccttgactgc ctagagccat cactaaagtg aagggcgagt 2880
cgccttggtg gggccccagc tgggcgtgtg gctcacgggc cagtgtccca gaggggctga 2940
actcttaaga cttaacaata gcaaccatat gcccttacgg catggcatgg tgggaagagt 3000
gtcccatgct taagtcggct tgatgtggac attggcgtta acatggctgt gtttcttcac 3060
tccgtgtgta tgaatttatt tttacacggc tctggacagc tgactgtcat cagcagacct 3120
tggggctggg tgggggtagg ggacatccac cgagagagat cttgcagtac agccctctgc 3180
ttcaggccac acccactctg acagtcactg agctgggatt tcttcttggc ttatcttttt 3240
cgttctggct tttagtcgcc acctgcttgc tgagggaagg gctctttcct tcttgggcca 3300
ggtgtggtct ttcctacttt ggcatttggc atttgacaca tagcagccgg cctccctttt 3360
gttccacatt tagcttcata caaggcaaag tgacagagac tctgggtgcc agcttgtgtc 3420
ttctgggcta gagagatgac atagggggtt gccagtcagc tgtagtagac cctagttggg 3480
atctattcca cggcggcctt ccagtctttt cttggggatt gtccacatga actccaggtg 3540
aagggacaac acaggcttgc tggtcaaggg ctgttcaggt gcactttccc agaatgtcca 3600
gacttgggga tatttgaagg atacctaggt gtccctctga agagaagcaa ttggggggcg 3660
gggggatctt tgcgaggtga gctggcaccc tttgctttgc acaggctagc tagttggccg 3720
ctgcaggacc cttgtgtgtt acctgccctg tttgtgggct cccggatact gtaattgtgg 3780
gtcgtaacca ctgctttggg tgttcccagc aggctgtctc agagtctctc tgtctcaggc 3840
gtagggtgaa ggctcgacag aaccatatgt gcctagtgtg tactcaccaa gtgaagggga 3900
cagcttcaca ggcagggtgc tgtgttccca aggggtctgg ggttctgcct gaggagtttt 3960
tagtgttgtc ctgaaggact ttgggctcag cttcataccg tgcctgttct acttgtgctc 4020
tccagtgttg gccttcccgc gttcctaacg tgagccgtag ggaccctgcg acctgcagta 4080
ggcctcccag actgtagggg gtggtgagac agtggtaagc acccctcact agtgcgaggc 4140
agagcagaag cagtcagggc tgcctggagg aggtggccta atctgctggg gtagcaaatt 4200
gaacaagctg cctaacagga aaagccttct ggaaatgaat gtttctagca gagaccagga 4260
tgatgggggt tggccacagc cttgcacccc ggactaccag gcctagatct gggtgtgtag 4320
catctactac tggagggagg tcttctatag caacctttgg agacacgtca ggcaggctgg 4380
cagggagtaa gggtgaggag ggaacctggg aaccagagat gggtagatca catgagggga 4440
catgggtaat tgtgggccct ctggggctca cggaagctag tcccaagtgg gaccttgtct 4500
cacgtgcttt ctcggcttct tctagacgct gcggccaggc cggctgggct cagcctaccg 4560
agaagagact ctgagcatca tccctgggtt acccctgtct ctgggggcca cggataccat 4620
g 4621
<210>3
<211>1932
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
cggtctcccg gatccgggat actggctgag ctgatggaat tgtctaaaga ggactggttt 60
ctaagttggg cggtggtgga accttgggcc tctgctgtgt ggccaaactc ctccttcccc 120
caggcccctg gtcttgctcc aggtggctag ccttgactgc ctagagccat cactaaagtg 180
aagggcgagt cgccttggtg gggccccagc tgggcgtgtg gctcacgggc cagtgtccca 240
gaggggctga actcttaaga cttaacaata gcaaccatat gcccttacgg catggcatgg 300
tgggaagagt gtcccatgct taagtcggct tgatgtggac attggcgtta acatggctgt 360
gtttcttcac tccgtgtgta tgaatttatt tttacacggc tctggacagc tgactgtcat 420
cagcagacct tggggctggg tgggggtagg ggacatccac cgagagagat cttgcagtac 480
agccctctgc ttcaggccac acccactctg acagtcactg agctgggatt tcttcttggc 540
ttatcttttt cgttctggct tttagtcgcc acctgcttgc tgagggaagg gctctttcct 600
tcttgggcca ggtgtggtct ttcctacttt ggcatttggc atttgacaca tagcagccgg 660
cctccctttt gttccacatt tagcttcata caaggcaaag tgacagagac tctgggtgcc 720
agcttgtgtc ttctgggcta gagagatgac atagggggtt gccagtcagc tgtagtagac 780
cctagttggg atctattcca cggcggcctt ccagtctttt cttggggatt gtccacatga 840
actccaggtg aagggacaac acaggcttgc tggtcaaggg ctgttcaggt gcactttccc 900
agaatgtcca gacttgggga tatttgaagg atacctaggt gtccctctga agagaagcaa 960
ttggggggcg gggggatctt tgcgaggtga gctggcaccc tttgctttgc acaggctagc 1020
tagttggccg ctgcaggacc cttgtgtgtt acctgccctg tttgtgggct cccggatact 1080
gtaattgtgg gtcgtaacca ctgctttggg tgttcccagc aggctgtctc agagtctctc 1140
tgtctcaggc gtagggtgaa ggctcgacag aaccatatgt gcctagtgtg tactcaccaa 1200
gtgaagggga cagcttcaca ggcagggtgc tgtgttccca aggggtctgg ggttctgcct 1260
gaggagtttt tagtgttgtc ctgaaggact ttgggctcag cttcataccg tgcctgttct 1320
acttgtgctc tccagtgttg gccttcccgc gttcctaacg tgagccgtag ggaccctgcg 1380
acctgcagta ggcctcccag actgtagggg gtggtgagac agtggtaagc acccctcact 1440
agtgcgaggc agagcagaag cagtcagggc tgcctggagg aggtggccta atctgctggg 1500
gtagcaaatt gaacaagctg cctaacagga aaagccttct ggaaatgaat gtttctagca 1560
gagaccagga tgatgggggt tggccacagc cttgcacccc ggactaccag gcctagatct 1620
gggtgtgtag catctactac tggagggagg tcttctatag caacctttgg agacacgtca 1680
ggcaggctgg cagggagtaa gggtgaggag ggaacctggg aaccagagat gggtagatca 1740
catgagggga catgggtaat tgtgggccct ctggggctca cggaagctag tcccaagtgg 1800
gaccttgtct cacgtgcttt ctcggcttct tctagacgct gcggccaggc cggctgggct 1860
cagcctaccg agaagagact ctgagcatca tccctgggtt acccctgtct ctgggggcca 1920
cggataccat gg 1932
<210>4
<211>9407
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
gtaccgagct cttacgcgtg ctagcccatc gaattcctgc agcccggggg atccactagt 60
tctagatttc gggtgccatc taacttggga gctgtctcaa gagcatatct cactatgtag 120
ctgatgccca gacctcttag ctcaggatag tgcctgcatc ctaccaagct gccagggatg 180
agagggagga agacctctgt gagagagggg ggaagacctc tgtgaggggg gaagagggtc 240
aggaaccaca ggttggtttg tttgtttttg gtttttggtt tttttttttt tgaagattta 300
tttattatta tacataagta ctgtagctgt cttcagacgc accagaaggg ggcgtcagat 360
ctcattacgg gtggttgtga gccaccacgt ggttgctggg atttgaactc aggaccttcg 420
gaagagcagt catcttaccc gctgagccat ctcgccagcc cccgggacca gtttttgttg 480
gagagcatgg ctgcagagca ggccagtggc aagtctcagt aaggcggacc ttactcacct 540
tgtggctctg tctaggaggc ccaaagaggt gttgccaaag tgtggaccca gaaggagtcg 600
cctatccccc aacccactcc ggactcgggg gaagatagag acacaaagaa gggaggcggg 660
actggttact gcatagaaac agggctcacc acaggtagga gctgtctcca acagtggctt 720
ccaggaagag catccgagtg agaagggtca ctagagaaca gccagaaatt gctgtgttcc 780
acaagagggc gccctgctgg ctctaactgt gtagcaacgg gatgggggaa gtaggagagg 840
aggagttggg ggcctggggt gaaggtttgc tgggcgagtg atggatattt gtgtgactct 900
cagcctctga aggccactct cagggtcagg gatactgctg gagcagaaca gaactgctgc 960
tgagcctctg acttagcgcc ctggaggctc tctgagctgg ggcagctgtg cagcagatag 1020
ggcacagaac agagcccccc atccccatcc ccgtctgaag ggtatggggc gtggctgaga 1080
ggagagtgag ttcttctccg ggagtggggt gtgcttccca ggtcagcccc aggagcccga 1140
gaaggagctc cgatttccat cctgggcgat agcgtggact actaaatcta ccctcttgtt 1200
tacactcctg gtgaactctg acccttgtat gaaaaacaaa aaatgccccc tggttaaaaa 1260
taccaaacac atgaaggtaa attcacaaaa gggttactat caagtcgggc ttctgggacg 1320
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ataagaggca ggaaccacct tgactcttca attccgggac accataagga accgcccccc 1440
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agttgctgtg gcaggcagta ctgggttgga tgagccctca atagccttct ttcttgtgtt 1620
ggctggcctt taggacaccg gtgaccggtc tctcccggct cccaagatgg ggacagttgg 1680
gcctcttgag agtcaaactg attcacttcc cacgctggcc tccctccttg gggtctggag 1740
agctaggcag ggaagggcca ggtcccacaa accgggaaac ccagaccaga gctggagctc 1800
tggatctgcg gcggggctcc gttacccgcg tggccctggc tcggggccac ccgagggcgg 1860
cgcctgcggg gccgcgctcg cgctcacggg gtgcctcgcc ctggccgcgg gccgcgccgg 1920
gggcgcccgg ggcggcggag gcggatgtgg gcgggcggcg cgggcgcggg gcggggagaa 1980
ggcgggccgg cggcggcggc ggcagcaccg agtcggcggg cggccggccc agcgcggcag 2040
cgcacgcgag tccgggacca gcggagcgga ccgagcagcg tcctgtggcc ggcaccgcgg 2100
cggcccagat ccggccagca gcgcgcgccc ggacgccgct gccttcagcc ggccccgccc 2160
agcgcccgcc cgcgggatgc ggagcggcgg gcgcccgagg ccgcggcccg gctaggccca 2220
gtcgcccgca cgcggcggcc cggtgagtgc ccgcgccgcg ccctgttccg ggccgcggcc 2280
accccgcttt gttcccggcc gcgccgcgcc tcggagtagg agcaggaagt ggccgagcgg 2340
aggcctgggc ggggagcgcg cggggccggg ctggtcgcgc aggaggccca cgccggcgag 2400
ggtgcgggcg gccgctgcgt gaccttgggt ggccgctcca cggggccagg tcgcgggaga 2460
ggggcgctgt tggtgtgcgc agtgggggcc ggtgcgccct ggggcctggg gctgcccggg 2520
cactcggcca gcgagggtag gagaaaggct cgccccgcgg cctgcgtgcg gtgggagggc 2580
cctgggaagg agaactcatt tcccacggac agaaagttgt gcgcggtggc acagtgccca 2640
ggctagccca caaaggactg ctaaccctcc tgggcccgga agctgcttcc tggactaggt 2700
ggtttctgga ggtgccgggg gggggggggg ccttgaggac ggcgtggact cggtctcccg 2760
gatccgggat actggctgag ctgatggaat tgtctaaaga ggactggttt ctaagttggg 2820
cggtggtgga accttgggcc tctgctgtgt ggccaaactc ctccttcccc caggcccctg 2880
gtcttgctcc aggtggctag ccttgactgc ctagagccat cactaaagtg aagggcgagt 2940
cgccttggtg gggccccagc tgggcgtgtg gctcacgggc cagtgtccca gaggggctga 3000
actcttaaga cttaacaata gcaaccatat gcccttacgg catggcatgg tgggaagagt 3060
gtcccatgct taagtcggct tgatgtggac attggcgtta acatggctgt gtttcttcac 3120
tccgtgtgta tgaatttatt tttacacggc tctggacagc tgactgtcat cagcagacct 3180
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ttcaggccac acccactctg acagtcactg agctgggatt tcttcttggc ttatcttttt 3300
cgttctggct tttagtcgcc acctgcttgc tgagggaagg gctctttcct tcttgggcca 3360
ggtgtggtct ttcctacttt ggcatttggc atttgacaca tagcagccgg cctccctttt 3420
gttccacatt tagcttcata caaggcaaag tgacagagac tctgggtgcc agcttgtgtc 3480
ttctgggcta gagagatgac atagggggtt gccagtcagc tgtagtagac cctagttggg 3540
atctattcca cggcggcctt ccagtctttt cttggggatt gtccacatga actccaggtg 3600
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gacttgggga tatttgaagg atacctaggt gtccctctga agagaagcaa ttggggggcg 3720
gggggatctt tgcgaggtga gctggcaccc tttgctttgc acaggctagc tagttggccg 3780
ctgcaggacc cttgtgtgtt acctgccctg tttgtgggct cccggatact gtaattgtgg 3840
gtcgtaacca ctgctttggg tgttcccagc aggctgtctc agagtctctc tgtctcaggc 3900
gtagggtgaa ggctcgacag aaccatatgt gcctagtgtg tactcaccaa gtgaagggga 3960
cagcttcaca ggcagggtgc tgtgttccca aggggtctgg ggttctgcct gaggagtttt 4020
tagtgttgtc ctgaaggact ttgggctcag cttcataccg tgcctgttct acttgtgctc 4080
tccagtgttg gccttcccgc gttcctaacg tgagccgtag ggaccctgcg acctgcagta 4140
ggcctcccag actgtagggg gtggtgagac agtggtaagc acccctcact agtgcgaggc 4200
agagcagaag cagtcagggc tgcctggagg aggtggccta atctgctggg gtagcaaatt 4260
gaacaagctg cctaacagga aaagccttct ggaaatgaat gtttctagca gagaccagga 4320
tgatgggggt tggccacagc cttgcacccc ggactaccag gcctagatct gggtgtgtag 4380
catctactac tggagggagg tcttctatag caacctttgg agacacgtca ggcaggctgg 4440
cagggagtaa gggtgaggag ggaacctggg aaccagagat gggtagatca catgagggga 4500
catgggtaat tgtgggccct ctggggctca cggaagctag tcccaagtgg gaccttgtct 4560
cacgtgcttt ctcggcttct tctagacgct gcggccaggc cggctgggct cagcctaccg 4620
agaagagact ctgagcatca tccctgggtt acccctgtct ctgggggcca cggataccat 4680
ggaagacgcc aaaaacataa agaaaggccc ggcgccattc tatccgctgg aagatggaac 4740
cgctggagag caactgcata aggctatgaa gagatacgcc ctggttcctg gaacaattgc 4800
ttttacagat gcacatatcg aggtggacat cacttacgct gagtacttcg aaatgtccgt 4860
tcggttggca gaagctatga aacgatatgg gctgaataca aatcacagaa tcgtcgtatg 4920
cagtgaaaac tctcttcaat tctttatgcc ggtgttgggc gcgttattta tcggagttgc 4980
agttgcgccc gcgaacgaca tttataatga acgtgaattg ctcaacagta tgggcatttc 5040
gcagcctacc gtggtgttcg tttccaaaaa ggggttgcaa aaaattttga acgtgcaaaa 5100
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tcagtcgatg tacacgttcg tcacatctca tctacctccc ggttttaatg aatacgattt 5220
tgtgccagag tccttcgata gggacaagac aattgcactg atcatgaact cctctggatc 5280
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tgtaaacaat ccggaagcga ccaacgcctt gattgacaag gatggatggc tacattctgg 5940
agacatagct tactgggacg aagacgaaca cttcttcatc gttgaccgcc tgaagtctct 6000
gattaagtac aaaggctatc aggtggctcc cgctgaattg gaatccatct tgctccaaca 6060
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agtaccgaaa ggtcttaccg gaaaactcga cgcaagaaaa atcagagaga tcctcataaa 6300
ggccaagaag ggcggaaaga tcgccgtgta attctagagt cggggcggcc ggccgcttcg 6360
agcagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa 6420
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ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca 7800
atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc 7860
ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat 7920
tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc 7980
attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt 8040
tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc 8100
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gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt 8220
gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg 8280
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aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg 8400
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gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc 9000
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cattcgccat tcaggctgcg caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta 9180
ttacgccagc ccaagctacc atgataagta agtaatatta aggtacggga ggtacttgga 9240
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