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1、10申请公布号CN104148037A43申请公布日20141119CN104148037A21申请号201410389869X22申请日20140808B01J20/286200601B01J20/30200601B01D15/08200601C07B63/00200601C07C51/47200601C07C57/44200601C07C63/06200601C07C65/03200601C07C65/05200601C07C63/16200601C07C67/56200601C07C69/157200601C07D239/54200601C07D473/34200601C07D239/4。
2、7200601C07H19/073200601C07H1/0620060171申请人华东理工大学地址200237上海市徐汇区梅陇路130号72发明人杨丙成吴胜杰章飞芳沈国滨纪顺利何成霞梁鑫淼74专利代理机构上海翼胜专利商标事务所普通合伙31218代理人翟羽54发明名称一种精氨酸键合型亲水色谱固定相及制备方法57摘要本发明公开一种精氨酸键合型亲水色谱固定相及制备方法，即用点击化学方法制备精氨酸键合型亲水固定相。该方法包括如下步骤首先将硅胶炔基化，然后将叠氮化修饰后的精氨酸通过1,3环加成反应键合到硅胶表面，即得精氨酸键合型亲水固定相。本发明所采用的点击化学键合方法，具有制备简单、选择性高、反应条。
3、件温和等优点。利用精氨酸和点击化学反应过程中产生的1,4三唑环为强极性官能团在亲水模式下能够对极性化合物进行高效分离。51INTCL权利要求书1页说明书5页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图2页10申请公布号CN104148037ACN104148037A1/1页21一种精氨酸键合型亲水色谱固定相，其特征在于，其结构为2权利要求1所述的精氨酸键合型亲水色谱固定相的制备方法，其特征在于，使用点击化学将精氨酸键合到硅胶上，包括如下步骤1硅胶表面引入炔基在有机溶剂中加入硅烷偶联剂、丙炔胺，硅烷偶联剂与丙炔胺的摩尔比为15125，在60150的条件下反。
4、应824小时；然后加入活化硅胶；在60100条件下继续反应1248小时后，用砂芯漏斗过滤，依次用二氯甲烷、甲醇和丙酮洗涤，得到固体产物；将所得的固体产物在4080条件下干燥612小时，即得炔基硅胶衍生物；2用点击化学将精氨酸键合到硅胶表面将步骤1所得的炔基硅胶衍生物加入到体积比为2/110/1的水/甲醇混合溶剂中，每克炔基硅胶衍生物所需混合溶剂量2050ML；向其中加入修饰有叠氮基团的精氨酸及催化剂；在2080的条件下反应2472小时，用砂芯漏斗过滤，分别用水、饱和乙二胺四乙酸二钠溶液、水、丙酮和四氢呋喃抽滤洗涤，得到固体产物；将所得的固体产物在4080的真空干燥箱中干燥612小时，即得精氨酸。
5、亲水色谱固定相。3根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1中有机溶剂为N,N二甲基甲酰胺，每克硅胶所需的有机溶剂量为530ML。4根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1中硅烷偶联剂的结构为5根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2中修饰有叠氮基团的精氨酸的结构为修饰有叠氮基团的精氨酸的摩尔剂量与硅胶上炔基的摩尔剂量比为115。6根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所用的催化剂为二价铜离子和抗环血酸钠，且上述催化剂的摩尔剂量分别与硅胶上炔基摩尔剂量比为011和042。权利要求书CN104148037A1/5页3一种精氨酸键合型亲水色谱固定相及制备方法技术领。
6、域0001本发明涉及亲水色谱固定相制备技术，更具体地讲，涉及一种精氨酸键合型亲水色谱固定相及制备方法。背景技术0002亲水色谱HILIC是近些年发展起来的一种色谱技术，主要用来分离一些亲水和极性较大的物质。相对于反相色谱RPLC，亲水色谱能够解决C18、C8等对糖、氨基酸、多肽等强极性物质保留弱甚至无保留的问题。亲水色谱用于分离极性化合物，如氨基酸、肽和糖等已有文献报道。固定相的选择对于亲水分离具有重要作用，目前亲水色谱固定相的类型主要有氨基、酰胺基、二醇基、糖类等。氨基酸是氨基NH2和羧基COOH直接连接在一个CH结构上的有机化合物。氨基酸固定相的报道有很多，通常的合成路线是首先将缩水甘油氧。
7、丙基三甲氧基硅烷分子引入到硅胶表面，然后利用氨基酸分子自身带的氨基与缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷分子中的环氧基进行开环反应，实现将氨基酸引入到硅胶表面的目的。尽管该反应过程比较简单，但通常产率比较低表现为键合量低，而且还会引入副反应。0003点击化学CLICKCHEMISTRY作为一种高效、高选择性的键合硅胶固定相的方法，得到越来越广泛的应用。其中HUISGEN1,3偶极环加成反应在色谱固定相的合成上发挥了重要作用。其步骤是在催化剂的作用下末端炔基和叠氮化合物反应，选择性的生成1,4三唑环，从而将所需官能团引入到硅胶表面。本发明是通过将氨基酸分子自身携带的氨基转化为点击化学中所需要的叠氮基，然后。
8、通过点击化学反应引入到硅胶基质上。本发明考虑到精氨酸分子结构含有胍基及羧基基团均为高亲水性基团，尤其是胍基，其PKA为1248，在酸性、中性以及碱性条件下都带正电荷，并且能够形成多重氢键，可以提供多重作用机制。另外，点击化学反应过程中产生的三唑环也为一个碱性亲水性基团而有利于提高分离选择性。目前尚无类似的文献报道。发明内容0004本发明的目的在于提供一种精氨酸键合型亲水色谱固定相。0005本发明的第二个目的提供精氨酸键合型亲水色谱固定相的制备方法。0006为实现以上目的，本发明公开以下技术方案一种精氨酸键合型亲水色谱固定相，其结构为0007说明书CN104148037A2/5页40008精氨酸。
9、键合型亲水色谱固定相的制备方法，其特征在于，使用点击化学将精氨酸键合到硅胶上，包括如下步骤00091硅胶表面引入炔基0010在有机溶剂中加入硅烷偶联剂、丙炔胺，硅烷偶联剂与丙炔胺的摩尔比为15125，在60150的条件下反应824小时；然后加入活化硅胶；在60100条件下继续反应1248小时后，用砂芯漏斗过滤，依次用二氯甲烷、甲醇和丙酮洗涤，得到固体产物；将所得的固体产物在4080条件下干燥612小时，即得炔基硅胶衍生物；00112用点击化学将精氨酸键合到硅胶表面0012将步骤1所得的炔基硅胶衍生物加入到体积比为2/110/1的水/甲醇混合溶剂中，每克炔基硅胶衍生物所需混合溶剂量2050ML；。
10、向其中加入修饰有叠氮基团的精氨酸及催化剂；在2080的条件下反应2472小时，用砂芯漏斗过滤，分别用水、饱和乙二胺四乙酸二钠溶液、水、丙酮和四氢呋喃抽滤洗涤，得到固体产物；将所得的固体产物在4080的真空干燥箱中干燥612小时，即得精氨酸亲水色谱固定相。0013作为一个优选方案，步骤1中有机溶剂为N,N二甲基甲酰胺，每克硅胶所需的有机溶剂量为530ML。0014作为一个优选方案，步骤1中硅烷偶联剂的结构为00150016作为一个优选方案，步骤2中修饰有叠氮基团的精氨酸的结构为00170018修饰有叠氮基团的精氨酸的摩尔剂量与硅胶上炔基的摩尔剂量比为115。0019作为一个优选方案，步骤2中所用。
11、的催化剂为二价铜离子和抗环血酸钠，且上述催化剂的摩尔剂量分别与硅胶上炔基摩尔剂量比为011和042。0020本发明的优点在于1采用精氨酸作为极性功能基团，其结构简单，应用范围广，能够在亲水模式下实现小分子酸、核苷和糖类等多种物质的良好分离；2采用精氨酸作为功能基团，其性质十分稳定，不容易与溶质分子发生反应；3采用点击化学将精氨酸键合到硅胶上，能够在温和的条件下实现高选择性和高转化率的固载；4利用精氨酸和点击化学反应过程中产生的1,4三唑环为强极性官能团在亲水模式下能够对极性化合物说明书CN104148037A3/5页5进行高效分离。附图说明0021图1为本发明精氨酸色谱固定相的制备方法流程图。。
12、0022图2为本发明炔基硅胶A和精氨酸色谱固定相B的红外谱图。0023图3为本发明实施例制备的精氨酸固定相在亲水模式下分离小分子酸的色谱图。0024图4为本发明实施例制备的精氨酸固定相在亲水模式下分离核苷和碱基的色谱图。具体实施方式0025下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。0026实施例10027制备精氨酸亲水色谱固定相，图1为本发明精氨酸色谱固定相的制备方法流程图，包括如下步骤00281硅胶表面引入炔基002。
13、9在有机溶剂中加入硅烷偶联剂、丙炔胺，硅烷偶联剂与丙炔胺的摩尔比为08，在85的条件下反应18小时；然后加入活化硅胶；在90条件下继续反应20小时后，用砂芯漏斗过滤，依次用二氯甲烷、甲醇和丙酮洗涤，得到固体产物；将所得的固体产物在80条件下干燥10小时，即得炔基硅胶衍生物；00302用点击化学将精氨酸键合到硅胶表面0031将步骤1所得的炔基硅胶衍生物加入到体积比为5/1的水/甲醇混合溶剂中，每克炔基硅胶衍生物所需混合溶剂量40ML；向其中加入修饰有叠氮基团的精氨酸及催化剂；在25的条件下反应24小时，用砂芯漏斗过滤，分别用水、饱和乙二胺四乙酸二钠溶液、水、丙酮和四氢呋喃抽滤洗涤，得到固体产物；。
14、将所得的固体产物在80的真空干燥箱中干燥10小时，即得精氨酸亲水色谱固定相。0032步骤1采用的有机溶剂为N,N二甲基甲酰胺，每克硅胶所需的有机溶剂量为10ML；步骤1采用的硅烷偶联剂的结构为00330034其反应式为0035说明书CN104148037A4/5页60036步骤2所用的修饰后具有叠氮基团的精氨酸的结构为00370038其反应式为00390040步骤2中采用的修饰有叠氮基团的精氨酸的摩尔剂量与硅胶上炔基的摩尔剂量比为10。0041步骤2所用的催化剂为二价铜离子和抗环血酸钠，催化剂的摩尔剂量分别与硅胶上炔基摩尔剂量比为08和16。0042图2为炔基硅胶A和精氨酸色谱固定相B的红外谱。
15、图。0043下表为精氨酸色谱固定相和炔基硅胶的元素分析表00440045实施例20046制备精氨酸亲水色谱固定相00471硅胶表面引入炔基0048在有机溶剂中加入硅烷偶联剂、丙炔胺，硅烷偶联剂与丙炔胺的摩尔比为06，在100的条件下反应15小时；然后加入活化硅胶；在100条件下继续反应12小时后，用砂芯漏斗过滤，依次用二氯甲烷、甲醇和丙酮洗涤，得到固体产物；将所得的固体产物在80说明书CN104148037A5/5页7条件下干燥10小时，即得炔基硅胶衍生物；00492用点击化学将精氨酸键合到硅胶表面0050将步骤1所得的炔基硅胶衍生物加入到体积比为5/1的水/甲醇混合溶剂中，每克炔基硅胶衍生物。
16、所需混合溶剂量30ML；向其中加入修饰有叠氮基团的精氨酸及催化剂；在25的条件下反应24小时，用砂芯漏斗过滤，分别用水、饱和乙二胺四乙酸二钠溶液、水、丙酮和四氢呋喃抽滤洗涤，得到固体产物；将所得的固体产物在80的真空干燥箱中干燥10小时，即得精氨酸亲水色谱固定相。0051步骤1采用的有机溶剂为N,N二甲基甲酰胺，每克硅胶所需的有机溶剂量为8ML；步骤1采用的硅烷偶联剂的结构为00520053步骤2所用的修饰后具有叠氮基团的精氨酸的结构为00540055步骤2中采用的修饰有叠氮基团的精氨酸的摩尔剂量与硅胶上炔基的摩尔剂量比为8。0056步骤2所用的催化剂为二价铜离子和抗环血酸钠，催化剂的摩尔剂量。
17、分别与硅胶上炔基摩尔剂量比为08和14。0057实施例30058图3为本发明实施例制备的精氨酸固定相在亲水模式下分离小分子酸的色谱图。0059图3的色谱条件为流动相A为水，B为乙腈，C为甲酸铵250MM甲酸铵，PH305；2A/90B/8C；检测波长254NM；流速1ML/MIN；柱温30；图2中对应的峰分别为A肉桂酸；B苯甲酸；C对羟基苯甲酸；D乙酰水杨酸；E2,5二羟基苯甲酸；F邻苯二甲酸；分离结果显示这几种小分子酸在精氨酸色谱固定相得到基线分离，表现出典型的亲水作用模式特征。0060实施例40061图4为本发明实施例制备的精氨酸固定相在亲水模式下分离核苷和碱基的色谱图。0062图4的色谱。
18、条件为流动相B为乙腈，C为甲酸铵250MM甲酸铵，PH305；90B/10C；检测波长254NM；流速1ML/MIN；柱温30；图3中对应的峰分别为A尿嘧啶；B腺嘌呤；C5甲基尿苷；D尿苷；E胞嘧啶；分离结果显示这几种核苷和碱基在精氨酸色谱固定相得到了基线分离，表现出典型的亲水作用模式特征和良好的分离选择性。0063以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。说明书CN104148037A1/2页8图1图2说明书附图CN104148037A2/2页9图3图4说明书附图CN104148037A。