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1、10申请公布号CN104178586A43申请公布日20141203CN104178586A21申请号201410440620722申请日20140901C12Q1/70200601C12Q1/6820060171申请人亚能生物技术（深圳）有限公司地址518000广东省深圳市宝安67区留仙一路高新奇科技工业园2区1栋10楼72发明人林斯里陈志强田洁74专利代理机构深圳市博锐专利事务所44275代理人张明54发明名称用于HBV分型与耐药突变基因检测的核酸膜条和试剂盒57摘要本发明涉及一种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种用于HBV分型与耐药突变基因检测的核酸膜条和试剂盒。所述核酸膜条包括基底和。
2、固定于所述基底上的核酸探针，其所述核酸膜条包括G膜条和M膜条；所述G膜条包括用于乙型肝炎病毒分型的核酸探针，其碱基序列如SEQIDNO124；所述M膜条包括用于乙型肝炎病毒耐药突变检测的核酸探针，其碱基序列如SEQIDNO2558。本发明有益效果本发明用于HBV分型与耐药突变基因检测的核酸膜条和试剂盒能全面、快速地进行HBV基因分型和耐药突变检测。51INTCL权利要求书1页说明书33页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书33页附图2页10申请公布号CN104178586ACN104178586A1/1页21一种用于HBV分型与耐药突变基因检测的核酸膜条。
3、，包括基底和固定于所述基底上的核酸探针，其特征在于，所述核酸膜条包括G膜条和M膜条；所述G膜条包括用于乙型肝炎病毒分型的核酸探针，其碱基序列如SEQIDNO124；所述M膜条包括用于乙型肝炎病毒耐药突变检测的核酸探针，其碱基序列如SEQIDNO2558。2根据权利要求1所述的用于HBV分型与耐药突变基因检测的核酸膜条，其特征在于，所述基底为尼龙膜。3根据权利要求2所述的用于HBV分型与耐药突变基因检测的核酸膜条，其特征在于，所述G膜条还包括内参照核酸探针，其碱基序列如SEQIDNO75；所述M膜条还包括内参照核酸探针，其碱基序列如SEQIDNO75。4一种用于HBV分型与耐药突变基因检测的试剂。
4、盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求13任一项所述的用于HBV分型与耐药突变基因检测的核酸膜条，GPCR反应液和MPCR反应液；所述GPCR反应液包括分型扩增引物，所述分型扩增引物碱基序列如SEQIDNO5968；所述MPCR反应液包括耐药突变扩增引物，所述耐药突变扩增引物碱基序列如SEQIDNO6974。5根据权利要求4所述的用于HBV分型与耐药突变基因检测的试剂盒，其特征在于，所述引物5端标记生物素。权利要求书CN104178586A1/33页3用于HBV分型与耐药突变基因检测的核酸膜条和试剂盒技术领域0001本发明涉及一种疾病病原体基因检测，尤其涉及一种用于HBV分型与耐药突变基因检。
5、测的核酸膜条和试剂盒。背景技术0002乙型肝炎病毒HEPATITISBVIRUS，HBV属嗜肝DNA病毒科HEPADNAVIRIDAE，基因组长约32KB，为部分双链环状DNA。HBV感染引起宿主肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损坏的疾病，叫乙型病毒性肝炎，俗称乙肝。0003HBV主要经血和血制品、母婴、破损的皮肤和黏膜及性接触传播。HBV感染呈世界性流行，但不同地区HBV感染的流行强度差异很大。据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中35亿人为慢性HBV感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌。2006年全国乙型肝炎流行病学调查结果表明，我国159。
6、岁一般人群乙肝病毒表面抗原HBVSURFACEANTIGEN，HBSAG携带率为718，5岁以下儿童的HBSAG携带率仅为096。据此推算，我国现有的慢性HBV感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例。0004根据HBV全基因序列差异8或S区基因序列差异4，目前将HBV分为AI9个基因型。HBV基因型呈地域性流行，我国及亚洲常见的是B、C以及少量的D型。不同基因型HBV对药物的敏感不同与疾病进程的关系也不相同，HBVC较HBVB更容易引起严重的肝炎或肝癌，对干扰素的应答率HBVA高于HBVD型而HBVB型高于HBVC型。0005目前国内外对于慢性HBV感染患者的治疗共识是抗病毒。
7、长期治疗。HBV是一种突变率极高的病毒，自然突变率101011点突变/天，在长期药物治疗特别是核苷酸类似物药物选择压力下，HBV耐药突变发生频率高，临床耐药突变成为影响慢性乙肝治疗效果的主要因素之一。我国SFDA批准上市的核苷酸类似物药物有4种拉米夫定LAMIVUDINE，LAM、替比夫定TELBIVUDINE，LDT、阿德福韦酯ADEFOVIR，ADV和恩替卡韦ENTECAVIR，ETV；随着用药年限的增加，耐药发生率逐年递增。此外还有一种新药替诺福韦TENOFOVIR，TDF已经在欧美上市，虽然全球多中心临床研究尚未发现表型耐药，但大量的试验研究已经确定了TDF的具体耐药突变位点表1。00。
8、06表1核苷酸类似物药物热点耐药突变位点0007说明书CN104178586A2/33页40008注S敏感；I中度耐药；R耐药。0009现有技术中，要么只能进行耐药突变检测，要么只能进行分型检测，而且，现有的检测耐药突变的产品或专利中，检测的耐药突变类型不够全面，有的产品甚至未包含与恩替卡韦耐药密切相关的突变位点RT184、RT202、RT250；有的产品包含了这些位点，但包含的突变类型也不够全面；这将导致一些突变类型无法检出，导致检测报告不够全面，给临床指导造成困扰。另外，根据HBV分型的原则，HBV全基因序列差异8或S区基因序列差异4分为一个基因型。而现有的分型检测产品或专利中，只用少量的。
9、探针1条或2条进行分型，也就是说只用到基因组中的一两个位点进行分型，不够科学准确，或造成错检漏检，也无法检出重组型别。发明内容0010本发明所要解决的技术问题是提供一种检测结果准确、检测灵敏度高且检测时间短的能同时进行HBV分型与耐药突变基因检测的核酸膜条和试剂盒。0011为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为提供一种用于HBV分型与耐药突变基因检测的核酸膜条，包括基底和固定于所述基底上的核酸探针，其所述核酸膜条包括G膜条和M膜条；0012所述G膜条包括用于乙型肝炎病毒分型的核酸探针，其碱基序列如SEQIDNO124；0013所述M膜条包括用于乙型肝炎病毒耐药突变检测的核酸探针，其碱基序。
10、列如SEQIDNO2558；说明书CN104178586A3/33页50014本发明的另一技术方案为提供一种用于HBV分型与耐药突变基因检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的用于HBV分型与耐药突变基因检测的核酸膜条，GPCR反应液和MPCR反应液；0015所述GPCR反应液包括分型扩增引物，所述分型扩增引物碱基序列如SEQIDNO5968；0016所述MPCR反应液包括耐药突变扩增引物，所述耐药突变扩增引物碱基序列如SEQIDNO6974；0017本发明有益效果本发明用于HBV分型与耐药突变基因检测的核酸膜条和试剂盒能全面、快速地进行HBV基因分型和耐药突变检测，能在一次。
11、试验中，区分HBV的3种基因型并检测与核苷酸类似物药物耐药相关的8个热点突变位点的18种突变类型。用HBVS区的多个位点进行分型，分型结果更可靠，可为患者病情的进展和干扰素治疗效果的判断提供参考依据；耐药突变检测的突变类型更多更全面，可以快速、全面地评价患者感染的HBV发生基因耐药的情况，为合理用药，制定个体化医疗提供参考依据。附图说明0018图1为本发明试剂盒的的膜条检测结果图；0019图2为本发明试剂盒的膜条检测结果图；0020图3为本发明试剂盒的膜条检测结果图；0021图4为本发明试剂盒的膜条检测结果图；0022图5为本发明试剂盒的膜条检测结果图；0023图6为本发明试剂盒的膜条检测结果。
12、图；0024图7为本发明试剂盒的膜条检测结果图；0025图8为本发明试剂盒的膜条检测结果图；0026图9为本发明试剂盒的膜条检测结果图；0027图10为本发明试剂盒的膜条检测结果图。具体实施方式0028为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。0029本发明最关键的构思在于一次试验即可对HBV样本进行基因分型和耐药突变检测。将分型和耐药突变检测在相同试验条件下一次实现，涉及的引物探针数量多，要保证检测的特异性，对引物和探针的设计、试验条件的优化要求非常高。经过精心设计和大量的试验优化，实现了在一次试验中，特异地对HBV进行分型和耐药突变检测。0。
13、030实施例10031一、技术原理00321、根据已知的HBV基因组研究成果进行引物及扩增反应液的设计和实施。0033根据HBV基因组S区和逆转录酶区的序列特点，设计PCR引物以扩增获得用于分型和耐药突变检测的目的片段。为了提高PCR产物与探针的杂交效率，将PCR扩增产物设计在300BP以内，因此设计4对引物分4段扩增S区的基因用于分型检测；设计2对引物分说明书CN104178586A4/33页62段扩增逆转录酶区的基因用于耐药突变检测。为了提高扩增灵敏度，设计一对S区基因全长扩增引物与4对分型扩增引物在1管反应液中组成巢式4重PCR用于扩增分型检测产物；设计1对耐药位点区域全长扩增引物与2对。
14、耐药突变扩增引物在1管反应液中组成巢式2重PCR用于耐药扩增耐药突变检测产物。00342、本发明将开发的芯片建立在膜芯片的基础上0035基因芯片由玻璃片或尼龙膜和固定在其上的探针阵列构成，二者基本原理相似，玻璃芯片的制备工艺复杂，检测过程繁琐，尤其是信号检测需要激光扫描仪，直接导致了其使用成本高昂，在市场特别是临床检测中不能得到有效的推广，因此其研发方向主要针对科学研究机构；膜芯片的开发则具有制备相对简单、操作简便、成本低廉等明显优势，十分有利于市场的推广，更能快速、有效地实现研究成果的产业化。00363、根据已知的HBV基因组研究成果进行检测探针和基因芯片的设计和实施0037根据每一段分型检。
15、测扩增产物，HBVB、HBVC、HBVD型之间基因的差异，设计2条特异的分型检测探针；根据每一段耐药突变检测产物各突变位点及侧翼序列的特点，设计野生型和突变型的特异检测探针。将分型检测探针按一定的排列方式固定在尼龙膜上，制备成分型检测膜条；将各位点的野生型和突变型的检测探针按一定的排列方式固定在尼龙膜上，制备成耐药突变检测膜条。0038二、具体技术方案的实施00391、扩增引物的设计和筛选0040在GENEBANK数据库中查找并下载HBVB、HBVC、HBVD型的全基因组序列，用DNASTAR进行比对，找到S区基因和逆转录酶区。用PRIMERPREMIER50设计1对S区基因全长扩增引物，同时。
16、设计4对引物将S区基因分成4段进行扩增；设计1对耐药位点区域全长扩增引物，同时设计2对引物将耐药位点区域分成2段进行扩增。S区基因全长扩增产物和耐药位点区域全长扩增引物的TM相近，而4对分型扩增产物和2对耐药突变扩增引物的TM值相近，且比S区基因全长扩增产物和耐药位点区域全长扩增引物的TM低。如此，分型引物和耐药突变引物可以在同一条件下进行扩增。设计好的引物由LIFETECHNOLOGIES公司合成。引物合成后由公司人员核对序列，然后溶解稀释成所需浓度的引物溶液。通过大量试验筛选到能够高效稳定扩增的分型扩增引物和耐药突变扩增引物。此引物的长度和位置的改变会降低本发明试剂盒的灵敏度和重复性，因此。
17、，引物序列是本发明的重点。引物的编号和序列见表2。0041表2分型扩增引物和耐药突变扩增引物0042说明书CN104178586A5/33页700432、PCR扩增反应体系的确认0044利用正交试验方法，通过大量实验对比优化，最终确定的PCR反应体系见表3。0045表3PCR扩增反应体系配方0046说明书CN104178586A6/33页80047注扩增模板加样量为2L，总反应体积为25L。00483、PCR扩增反应条件的确定0049经过大量试验的对比优化，最终确定的PCR扩增反应条件见表4。0050表4PCR扩增反应条件0051说明书CN104178586A7/33页90052退火温度和退火。
18、时间对PCR扩增效率和特异性扩增影响较大，上述条件优化结果显示退火温度偏低会有非特异性扩增信号；温度偏高扩增效率偏低，灵敏度下降。本实验通过控制退火温度和退火时间可以做到特异性好，扩增效率高，灵敏度可达1000IU/ML。00534、探针和基因芯片的设计和实施0054在GENEBANK数据库中查找并下载HBVB、HBVC、HBVD型的全基因组序列以及RT180、RT181、RT184、RT194、RT202、RT204、RT236、RT250检测位点野生型和突变型的序列。根据各基因型S区基因的差异，设计基因型特异性检测探针，每个基因型的每段PCR产物设计2条探针进行检测；根据各检测位点野生型和。
19、突变型，以及检测位点侧翼序列的特点，设计各检测位点野生型及突变型的特异检测探针。为了保证这些探针在同一温度下进行杂交的特异性和灵敏度，探针设计时充分考虑序列的多态和二级结构的影响，并要求所有的探针的TM值差异不超过5。设计好的探针由LIFETECHNOLOGIES公司合成，并在每条探针的3端进行氨基修饰。探针合成后由公司人员核对序列，然后溶解稀释成所需浓度的引物溶液。通过氨基与羧基的缩合反应将探针固定在尼龙膜上，制备成分型检测芯片和耐药突变检测芯片。通过大量试验的优化和筛选，获得稳定、特异性强的分型和耐药突变检测探针。此探针的长度和碱基组成会影响本试剂盒检测的特异性和准确性，因此，探针序列是本。
20、发明的重点。各位点的探针编号和序列见表5。分型检测芯片位点图见表6，耐药突变检测芯片位点图见表7。0055表5探针序列和编号0056说明书CN104178586A8/33页100057说明书CN104178586A109/33页110058说明书CN104178586A1110/33页120059说明书CN104178586A1211/33页130060说明书CN104178586A1312/33页140061注，1所有探针的3端进行氨基NH2修饰。00622CC探针的3端进行氨基NH2修饰，5端进行生物素BIOTIN修饰。0063表6分型检测芯片位点图00640065表7耐药突变检测芯片位点。
21、图006600675、杂交条件的确定0068杂交温度对最后结果的判读影响很大，杂交温度偏低会导致PCR产物与膜条上的探针非特异结合，从而有可能误判为阳性；杂交温度偏高会导致目的产物与目的探针的结合效率下降，杂交信号强度减弱，从而有可能误判为阴性。洗膜时间和显色时间的长短对杂交结果也会有类似的影响。通过一系列优化实验，最终确定的杂交、洗膜和显色等条件如下006951、杂交0070含取15ML塑料离心管，放入标有样品编号的分型和耐药检测芯片膜条应在膜条的一角用铅笔标记，加入A液2SSC、01SDS67ML及分型和耐药突变扩增PCR反应液中所有PCR产物，拧紧管盖，再回旋一圈稍拧松。将离心管放入沸水。
22、浴中加热10分钟确说明书CN104178586A1413/33页15保杂交液液面完全位于沸水浴液面之下，取出拧紧盖子，放入杂交箱47杂交15小时。0071取50ML塑料管，加入40MLB液05SSC、01SDS于杂交箱中进行预热至47。007252、洗膜0073取出膜条，移至装有预热B液的50ML管中，于47轻摇洗涤15分钟每管40ML溶液，最多可同时洗涤4张膜。007453、显色0075按A液POD20001配制孵育液单做两张膜只需4LPOD母液，配制成8ML使用液，做四张膜可用6LPOD母液，配制成12ML使用液，室温轻摇浸泡30分钟，弃去POD溶液。用A液室温轻摇洗两次，每次5分钟。用C。
23、液01MOL/L柠檬酸钠，PH50室温洗膜12分钟，同时配制显色液各成份比例19MLC液，1MLTMB，2L30的H2O2。将膜条浸泡于显色液中避光显色15分钟即可观察结果。0076实施例2本发明试剂盒的使用00771、预期用途0078用于检测血清或血浆中的乙型肝炎病毒HBVDNA，并对其进行基因分型和耐药突变基因检测。0079在进行抗病毒治疗前和抗病毒治疗中进行HBV分型和耐药突变基因检测，能够00801区分中国和其他亚洲国家常见的HBVB、C、D3种基因型；00812检测HBV抗病毒药物8个热点突变位点的18种突变类型；00823对HBV实行动态监控，辅助确定个性化的临床诊疗方案，进行HB。
24、V流行病学研究。0083临床适应症背景0084乙型肝炎病毒HBV是传染性疾病乙型病毒性肝炎的主要病因，感染HBV可引起肝硬化甚至肝细胞癌变。0085HBV基因型分为9种AI，其分布具有地域性，中国乃至亚洲流行的乙型肝炎病毒几乎都是B、C型，此外还有少量D型，不同的基因型易发生的突变类型不同，与病情转归也密切相关，如基因型C较B更容易引起严重的肝炎或肝癌，对干扰素的应答率A型高于D型，B型高于C型。0086核苷酸类似物，如拉米夫定LAMIVUDINE，LAM、替比夫定TELBIVUDINE，LDT阿德福韦酯ADEFOVIR，ADV、恩替卡韦ENTICAVIR，ETV、替诺福韦TENOFOVI，T。
25、DF等是抗HBV的常见药物。这些药物无法彻底清除大多数乙肝病人体内的HBV，患者需要长期维持治疗。HBV在宿主体内感染以及抗病毒治疗的过程中会发生基因变异，并在宿主体内免疫系统的压力下和在治疗干预过程中进行变异的优势选择，以达到逃逸免疫、对抗药物、实现物种生存的目的，进而发生耐药。乙肝病人一旦出现耐药突变，其肝功能恶化的比例将显著增高，甚至快速进展至肝衰竭。0087本发明试剂盒主要组成成份如表8所示。0088表80089说明书CN104178586A1514/33页160090说明试剂盒中不同批号的组分可以互换使用。“G”表示分型检测，“M”表示耐药突变检测。00912、辅助试剂0092A液1。
26、00ML20SSC，10ML10SDS加纯水定容至1000ML，常温保存。0093B液25ML20SSC，10ML10SDS加纯水定容至1000ML，常温保存。0094C液100ML1M柠檬酸钠加纯水定容至1000ML，常温保存。0095显色液19MLC液加入1MLTMB和2L30H2O2。0096储存条件试剂盒置于20保存；试剂盒置于28保存。如果打开包装各组分分开保存时，除了满足各自的温度保存条件之外，需特别注意TMB应该避光保存。0097有效期6个月。00983、适用仪器0099PCR仪黑马96000100分子杂交箱FINEPCRCOMBIH120101注PCR仪退火速率设置为14/S可。
27、能获得最佳的扩增效果。01024、样本要求0103本试剂盒样本来源为血清或血浆。0104制备好的血清或血浆室温放置不超过2小时，28保存不超过48小时，18以下保存不超过半年，应避免反复冻融。运输时需用冰壶或泡沫箱加冰袋密封，在途时限不宜超过48小时。01055、本发明试剂盒检验流程01061、HBVDNA的提取0107建议使用亚能公司生产的乙型肝炎病毒DNA提取试剂盒提取HBVDNA。也可以使用其他商品化的病毒DNA提取纯化试剂盒来提取HBVDNA的提取。0108阳性质控品和阴性质控品与待检血清或血浆样本的处理方式相同，并应与样本同说明书CN104178586A1615/33页17步处理。0。
28、109提取的HBVDNA如不立即使用，必须置于18以下保存。01102PCR扩增0111取出PCR反应管稍事离心，在管盖上做好标记，加入2L已提取的待测样品DNA。同时应取PCR反应管分别加入阳性质控品和阴性质控品DNA，作为产品使用的质量控制。0112PCR按以下表9条件进行扩增0113表9011401153杂交0116取15ML塑料离心管，放入标有样本编号的膜条G膜条和M膜条应在膜条的编号处用铅笔标记，加入A液67ML，取相应样本编号的PCR产物GPCR反应液和MPCR反应液25L加到A液液面以下，拧紧管盖。将离心管放入沸水浴中加热10分钟确保杂交液液面完全位于沸水浴液面之下，取出离心管，。
29、放入杂交箱47杂交15小时。0117取50ML塑料离心管，加入40MLB液于杂交箱或水浴箱中进行预热至47。0118阳性质控品和阴性质控品同步处理。01194洗膜0120取出膜条移至装有预热B液的50ML管中，于47轻摇洗涤15分钟每管40MLB液最多可同时洗涤4张膜条。按A液POD20001配制孵育液单做2张膜条只需4LPOD配制成8ML孵育液，做4张膜条可用6LPOD配制成12ML孵育液，室温轻摇孵育30分钟。01215显色0122取出膜条，用A液室温轻摇洗两次，每次5分钟。用C液室温洗膜12分钟，同时配制显色液。将膜条浸泡于显色液中20ML显色液最多浸泡10张膜条避光显色15分钟即可观察。
30、结果。01236结果判读0124膜条阵列位点如下G膜条如表10所示，M膜条如表11所示。0125表10说明书CN104178586A1716/33页1801260127表1101280129注M膜条第一排的基因型为各位点的野生型；M膜条第二、三排的基因型为各位点的突变型。0130根据显色蓝色斑点出现的阵列位点直接判读HBV的基因型和耐药突变类型。01316、检验结果的解释01321临床样本试验成立条件0133显色控制点CC正常显色。0134阳性质控品正常显色且阴性质控品除CC外其他所有阵列位点不显色。01352结果判读0136在试验成立的条件下，根据显色蓝色斑点出现的阵列位点直接判读HBV的基。
31、因型和耐药突变类型。0137当临床样本除CC外其余所有阵列位点均不显色，表明被检样本中无HBV病毒或者病毒量在本试剂盒最低检出限以下，即10103IU/ML。0138注释各位点突变引起临床耐药的程度不同，具体模式详见使用指南。01393异常结果分析0140显色控制点CC不显色，提示显色不成功，建议重做。0141阳性质控品相应阵列位点部分不显色或所有阵列位点不显色，提示可能是样本DNA提取、PCR扩增、杂交失败，建议重做。0142阴性质控品除CC外任何阵列位点显色，提示发生污染，建议排除污染后重做。0143在试验成立的条件下，根据显色蓝色斑点出现的阵列位点直接判读HBV的基因型和耐药突变类型。请。
32、参阅图1图10。0144如图1、图2的膜条显色所示，检测结果为HBVB，野生敏感型；0145如图3、图4的膜条显色所示，检测结果为HBVB，RT180M，RT204V；0146如图5、图6的膜条显色所示，检测结果为HBVC，RT236N；0147如图7、图8的膜条显色所示，检测结果为HBVB，RT180M，RT204V，RT202G；0148如图9、图10的膜条显色所示，检测结果为HBVB/C，RT204I。01494产品性能指标01501准确性使用本发明试剂盒检测105例临床慢性HBV感染阳性样本，结果与测序比较显示为相同的基因型和耐药突变类型，准确率为100。01512特异性使用本发明试剂。
33、盒检测50例临床HBV阴性样本结果全部为阴性；检测非HBV感染性病原体DNA，包括C型肝炎病毒HCV、乙型脑炎病毒、梅毒螺旋体和HIV，结果均为阴性。说明书CN104178586A1817/33页1901523灵敏度使用本发明试剂盒能稳定检测血清HBV的最低检出限为10103IU/ML。01534精密度使用本发明试剂盒检测20103IU/ML的血清HBV，批内和批间的一致性为100。01545稳定性使用本发明试剂盒产品有效期为6个月，在有效期内产品性能稳定。0155以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接。
34、运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。0156说明书CN104178586A1918/33页200157说明书CN104178586A2019/33页210158说明书CN104178586A2120/33页220159说明书CN104178586A2221/33页230160说明书CN104178586A2322/33页240161说明书CN104178586A2423/33页250162说明书CN104178586A2524/33页260163说明书CN104178586A2625/33页270164说明书CN104178586A2726/33页280165说明书CN104178586A2827/33页290166说明书CN104178586A2928/33页300167说明书CN104178586A3029/33页310168说明书CN104178586A3130/33页320169说明书CN104178586A3231/33页330170说明书CN104178586A3332/33页340171说明书CN104178586A3433/33页35说明书CN104178586A351/2页36图1图2图3图4图5图6说明书附图CN104178586A362/2页37图7图8图9图10说明书附图CN104178586A37。