一种荧光定量PCR技术筛选低富集镉花生品种的方法 技术领域：
本发明是涉及一种筛选低富集镉花生品种的方法，具体是涉及一种荧光定量PCR技术筛选低富集镉花生品种的方法。
背景技术：
花生是世界四大油料作物之一，也是我国单产、总产最高的油料作物和经济作物，种植面积超过500万公顷，其产量占油料作物总产量地1/2，占世界花生总产量的45％，已达1450万吨以上。多年来，花生一直是我国出口创汇额最高的油料作物。目前，我国花生生产面临的主要挑战是黄曲霉毒素污染、农药残留(主要是丁酰肼污染)和籽粒镉(Cd)含量偏高等问题。Cd以其高毒性、高生物迁移性而备受关注。据2003年我国北方产区花生普查结果显示，花生Cd含量平均为0.2～0.3mg/kg，其中山东产区花生Cd含量一般在0.2mg/kg以下，而山东以北地区花生Cd含量多在0.2mg/kg以上。在广西进行市场抽检发现，花生籽粒Cd含量范围为0.07～0.79mg/kg，平均0.21mg/kg。市场上的花生Cd含量水平基本符合国家新近颁布的0.5mg/kg限量标准(GB2762-2005)，但多数超过国家无公害食品Cd含量要求(Cd≤0.05mg/kg)，半数以上高于WAO/WHO规定的限量标准(Cd≤0.1mg/kg)，甚至达不到《国际卫生法典》规定的0.2mg/kg的花生Cd限量标准，已威胁到食品安全和人体健康，控制和降低花生籽仁镉污染亟待解决。
针对当前花生田土壤以及籽仁中重金属镉污染的日益严重的现状，国内外开展了大量有关花生镉低积累品种筛选和农艺栽培技术研究。土壤中能够被植物所吸收的镉(有效态镉)是影响花生镉吸收与积累的重要因素。因此，通过农艺栽培技术措施降低花生田土壤有效态镉含量来降低花生镉积累是有其理论基础的，比如施用石灰提高土壤的PH，降低花生田土壤有效态镉含量，但该技术也存在极大弊端，在土壤PH提高的同时，土壤中有效态铁、锌、锰、铜镍等金属矿质营养元素含量下降，影响花生生长和产量。花生镉积累存在极显著的品种间差异是花生镉低积累品种筛选的本质和基础。然常规的筛选方法有通过盆栽镉处理收获花生饱果，进行原子吸收测定籽仁镉含量和测定不同花生品种对镉胁迫生理响应的差异来进行筛选，但品种繁多，生长周期长，操作繁琐，成本高，分析处理烦等问题。
发明内容：
本发明的目的是提供一种荧光定量PCR技术筛选低富集镉花生品种的方法，它利用营养液培养花生幼苗，利用幼苗叶片AhMT2a基因序列，应用荧光定量PCR技术检测该基因表达差异的方法进行镉敏感品种的筛选；检测方法简单，不需要设计探针，成本低，通用性好，且能够进行融解曲线分析检测扩增反应的特异性。
为了解决背景技术所存在的问题，本发明是是采用以下技术方案：1、利用营养液培养花生幼苗：花生种子先经75％乙醇处理1分钟，再用0.1％的氯化汞进行消毒处理15分钟，最后用去离子水反复冲洗3-4遍备用。恒温箱25℃浸种12h，将吸胀后的种子，摆放于小的塑料盆中的尼龙网上，每盆20粒，用含Cd2+(CdCl2·2.5H2O溶液)的Hongland营养液在25℃室温无菌培养室下培养，每天光照14小时。试验采用完全随机排列，对照用无Cd2+的Hongland营养液培养。每两天换一次营养液。花生营养液培养6天后，幼苗长出第一真叶，随机取不同镉处理水平幼苗，提取RNA，重复3次，反转录为cDNA，以其为模板进行罗氏荧光定量PCR分析。
2、设计特定的不同镉处理水平：对照、低镉处理水平10μM和高镉处理水平200μM。
3、花生AhMT2a基因表达差异检测与分析方法：依据荧光定量PCR引物设计原则对基因进行引物设计，以恒定表达基因Actin作为内参基因对同一样品cDNA模板利用Roche荧光定量PCR仪进行定量分析。引物设计如下：
AhMT2a-F：5’-GAAGGTGCTGAAATGGGTGT-3’
AhMT2a-R：5’-CAATTGGATTTGCCTGAGGT-3’
Actin-F：5’-GTCCATCAGGCAACTCGTAGC-3’
Actin-R：5’-GCCCTCGACTATGAGCAAGAG-3’
Roche荧光定量PCR仪染料法检测程序如下：
第一步预变性：95℃变性2分钟；
第二步荧光收集：95℃15秒-58℃15秒-72℃20秒本步结束时进行荧光信号收集40个循环；
第三步融解曲线分析：65℃30秒逐步升至95℃，每隔0.2℃收集一次荧光。
结果分析：利用罗氏定量PCR仪自带的lightcycler4.05版软件进行分析。
4、筛选依据：1、花生籽仁中镉的容纳能力与AhMT2a基因的表达量相关；不同条件下，表达量的高低是筛选镉低积累品种的主要依据。2、镉低积累花生在对照(无镉离子处理)下，该基因与内参基因actin的表达差异不显著，而镉高积累花生则表达差异大。3、镉低积累花生在低镉处理水平(10μM)下，该基因表达量与对照比小量增加，但增加不显著，而镉高积累花生该基因表达量与对照比则极显著增加。4、镉低积累花生在高镉处理水平(200μM)下，该基因表达量与对照比小幅降低，但不显著；而镉高积累花生该基因表达量与对照比则极显著增加。
本发明具有以下有益效果：利用营养液培养花生幼苗，大大缩短生长周期；利用幼苗叶片AhMT2a基因序列，应用荧光定量PCR技术检测该基因表达差异的方法进行镉敏感品种的筛选，检测方法简单，不需要设计探针，成本低，通用性好，且能够进行融解曲线分析检测扩增反应的特异性。
附图说明：
图1是本发明不同处理水平目的基因与内参基因的相对表达量的示意图；
图2是本发明不同镉处理水平与对照目的基因的相对表达量的示意图。
具体实施方式：
本具体实施方式采用以下技术方案：花生品种：镉高积累品种XA004和镉低积累品种XD011。
试验材料处理：花生种子先经75％乙醇处理1分钟，再用0.1％的氯化汞进行消毒处理15分钟，最后用去离子水反复冲洗3-4遍备用。恒温箱25℃浸种12h，将吸胀后的种子，摆放于小的塑料盆中的尼龙网上，每盆20粒，分别用含Cd2+(CdCl2·2.5H2O溶液)低镉处理水平10和高镉处理水平200μM的Hongland营养液在25℃室温无菌培养室下培养，每天光照14小时。试验采用完全随机排列，对照用无Cd2+的Hongland营养液培养。每两天换一次营养液。花生营养液培养6天后，幼苗长出第一真叶，随机取不同镉处理水平幼苗，提取RNA，重复3次，反转录为cDNA，以其为模板进行罗氏荧光定量PCR分析。
花生AhMT2a基因表达差异检测过程：依据荧光定量PCR引物设计原则对基因进行引物设计，以恒定表达基因Actin作为内参基因对同一样品cDNA模板利用Roche荧光定量PCR仪进行定量分析。引物设计如下：
AhMT2a-F：5’-GAAGGTGCTGAAATGGGTGT-3’
AhMT2a-R：5’-CAATTGGATTTGCCTGAGGT-3’
Actin-F：5’-GTCCATCAGGCAACTCGTAGC-3’
Actin-R：5’-GCCCTCGACTATGAGCAAGAG-3’
Roche荧光定量PCR仪染料法检测程序如下：
第一步预变性：95℃变性2分钟；
第二步荧光收集：95℃15秒-58℃15秒-72℃20秒本步结束时进行荧光信号收集40个循环；
第三步融解曲线分析：65℃30秒逐步升至95℃，每隔0.2℃收集一次荧光。
结果分析：利用罗氏定量PCR仪自带的lightcycler4.05版软件进行分析。
实验结果与分析：由图1可知，镉低积累花生XD011在对照(无镉离子处理)下，目的基因与内参基因actin的相对表达量为1.07，而镉高积累花生XA004则高达27.85，极显著大于XD011(P＜0.01)；而且不同镉处理水平下，镉高积累花生XA004相对表达量均极显著大于XD011(P＜0.01)。
由图2可知，镉低积累花生XD011在低镉处理水平(10μM)下，目的基因表达量与对照比小量增加，而镉高积累花生XA004该基因表达量与对照比则增加2倍多，增量极显著的大于镉低积累花生XD011(P＜0.01)；当镉处理水平达到200μM，镉低积累花生XD011目的基因表达量与对照比小幅降低，但不显著；而镉高积累花生XA004表达量与对照比则极显著增加。