EBVDNA酶肽抗原ELISA法检测EBVDNA酶IGA抗体.pdf

本发明是关于一种以EB病毒DNA酶(EBV-DNase)蛋白的优选肽抗原作为包被抗原ELISA法检测EBV-DNA酶IgA抗体的技术。该优选的EBV-DNA酶肽抗原包含的氨基酸序列是：EBV-Dnase-7(序列ATCTLGSDLL?LDASVEIPVA)和EBV-Dnase-8(序列VLVTPVCLPD?SIVRKELNTA)。该EBV-Dnase-7和EBV-Dnase-8多肽最佳包被浓度为200ng∶100ng混合包板。

1.  一种EBV-DNA酶肽抗原EBV-Dnase-7，其特征在于，该EBV-Dnase-7的氨基酸序列组成如下：ATCTLGSDLL LDASVEIPVA。

2.  一种EBV-DNA酶肽抗原EBV-Dnase-8，其特征在于，该EBV-Dnase-8的氨基酸序列组成如下：VLVTPVCLPD SIVRKELNTA。

3.  一种EBV-DNA酶肽抗原，其特征在于：其包括权利要求1所述的EBV-DNA酶肽抗原EBV-Dnase-7以及权利要求2所述的EBV-DNA酶肽抗原EBV-Dnase-8。

4.  根据权利要求3所述的EBV-DNA酶肽抗原，其特征在于：EBV-Dnase-7和EBV-Dnase-8多肽最佳包被浓度为200ng：100ng混合包板。

5.  一种ELISA法检测血清或血浆中EBV-DNA酶IgA抗体方法，其特征在于：其是用优选的以EBV-Dnase-7和EBV-Dnase-8为序列合成的混合肽抗原建立的，该检测方法包括以下步骤：
1)包被：用0.05M PH9.6的碳酸盐包被缓冲液将多肽稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜；
2)封闭：次日，弃去孔内溶液，再每孔加入3％BSA[BSA粉剂为SIGMA，溶于0.01mol/L PBS(pH 7.2-7.4)中，]200μl，37℃，孵育1小时；
3)洗涤：
①手工：倒掉反应孔中的液体，用稀释后的清洗液(配方见表2所示)洗4次，每次每孔300ul；或者是
②洗板机：程序设定为稀释后的清洗液洗4次，每次每孔300ul；
4)加样：将标准品、阳性对照、阴性对照以及按1：100与样本稀释液稀释之后的待检样品加入反应孔中，并做空白对照(即加100ul样本稀释液稀释)，100ul/孔，置37℃，孵育1小时；
5)洗涤：同上；
6)加酶标抗体：于各反应孔中，加入酶标抗体，100ul/孔，置37℃，孵育1小时；
7)再次清洗：清洗6次，方法同上；
8)加底物液显色：于各反应孔中加入底物A溶液50ul，底物B(含TMB)溶液50ul，轻摇混匀，置于阴暗处，15分钟
其中，
底物A为体积百分比浓度为0.6％过氧化氢溶液，
底物B配方以10mg TMB(四甲基联苯胺)溶于1ml DMSO(二甲基亚砜)中作为原液，并按照如下方式配制
上述原液                        1ml

0.  1Mol/L的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液 57.5ml

0.  2mol/L枸橼酸缓冲液            42.5ml
9)终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml，轻摇混匀，置5分钟；
10)测OD值：在酶标仪上，于450nm波长测OD值。

6.  权利要求1至4中任一权利要求所述的EBV-DNA酶肽抗原在制备鼻咽癌诊断试剂中的应用。

EBV-DNA酶肽抗原ELISA法检测EBV-DNA酶IgA抗体
技术领域
本发明涉及一种酶肽抗原ELISA法检测EBV-DNA酶IgA抗体，特别是涉及一种筛选和优化组合EBV-DNA酶肽抗原，验证优选的酶肽抗原检测EBV-DNA酶IgA的特异性和灵敏度，并建立EBV-DNA酶肽抗原ELISA技术检测血清或血浆中EBV-DNA酶IgA抗体的方法，应用于鼻咽癌的筛查和辅助诊断。
背景技术
鼻咽癌(NPC)是发生于鼻咽部上皮细胞的恶性肿瘤，最常见于中国南方(如广东、广西、湖南、福建等省)和东南亚的一些国家，全世界80％以上的鼻咽癌发生在中国南方。早期诊断是提升癌症治愈率的关键，但由于早期临床症状不明显，且缺乏好的早期诊断指标和筛查技术，一般确诊时鼻咽癌都为晚期。
鼻咽癌的早期诊断对患者的治疗效果、预后判断极为重要。多年来，人们对NPC的早期诊断方法进行了大量研究。血清EA-IgA、VCA-IgA检测因其易行已成为目前常用的血清学诊断方法，但存在一定程度的假阳性和假阴性。大量报道EBV-DNA酶的出现提示EBV处于病毒的增殖周期，其在受染机体内的含量高低直接反映病毒复制的活跃程度，鼻咽癌血清样本中含有高滴度的EBV-DNase抗体，EBV-DNA酶可用于鼻咽癌的早期诊断。目前，检测EBV-DNase抗体主要是同位素中和法，此法操作繁琐，且有同位素污染，不易推广。
发明内容
本发明的目的在于提供一种EBV-DNA酶肽抗原ELISA法检测EBV-DNA酶IgA抗体，应用本发明作为鼻咽癌筛查手段，早期发现鼻咽癌，早期治疗，有助于鼻咽癌的愈后。
本发明公开了一种以EB病毒DNA酶(EBV-DNase)蛋白的优选肽抗原作为包被抗原ELISA法检测EBV-DNA酶IgA抗体的技术。该优选的EBV-DNA酶肽抗原包含的氨基酸序列是：EBV-Dnase-7(序列ATCTLGSDLL LDASVEIPVA)和EBV-Dnase-8(序列VLVTPVCLPD SIVRKELNTA)。该EBV-Dnase-7和EBV-Dnase-8多肽最佳包被浓度为200ng∶100ng混合包板。
本发明还提供了一种ELISA法检测血清或血浆中EBV-DNA酶IgA抗体方法是用优选的以EBV-Dnase-7和EBV-Dnase-8为序列合成的混合肽抗原建立的，该检测方法包括以下步骤：
1)包被：用0.05M PH9.6的碳酸盐包被缓冲液将多肽稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜；
2)封闭：次日，弃去孔内溶液，再每孔加入3％BSA[BSA粉剂为SIGMA，溶于0.01mol/L PBS(pH 7.2-7.4)中，]200μl，37℃，孵育1小时；
3)洗涤：
①手工：倒掉反应孔中的液体，用稀释后的清洗液(配方见表2所示)洗4次，每次每孔300ul；或者是
②洗板机：程序设定为稀释后的清洗液洗4次，每次每孔300ul；
4)加样：将标准品、阳性对照、阴性对照以及按1∶100与样本稀释液稀释之后的待检样品加入反应孔中，并做空白对照(即加100ul样本稀释液稀释)，100ul/孔，置37℃，孵育1小时；
5)洗涤：同上；
6)加酶标抗体：于各反应孔中，加入酶标抗体，100ul/孔，置37℃，孵育1小时；
7)再次清洗：清洗6次，方法同上；
8)加底物液显色：于各反应孔中加入底物A(含过氧化氢)溶液50ul，底物B(含TMB)溶液50ul，轻摇混匀，置于阴暗处，15分钟；
底物A为体积百分比浓度为0.6％过氧化氢溶液，
底物B配方以10mg TMB(四甲基联苯胺)溶于1ml DMSO(二甲基亚砜)中作为原液，并按照如下方式配制
上述原液                           1ml
0.1Mol/L的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液    57.5ml
0.2mol/L枸橼酸缓冲液               42.5ml
9)终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml，轻摇混匀，置5分钟；
10)测OD值：在酶标仪(Thermo公司)上，于450nm波长测OD值。
借由上述技术方案，本发明一种EBV-DNA酶肽抗原ELISA法检测EBV-DNA酶IgA抗体至少具有的有益效果是：操作简便，没有污染，成本低，易推广，便于大规模操作；应用本发明作为鼻咽癌筛查手段，早期发现鼻咽癌，早期治疗，有助于鼻咽癌的预后。
附图说明
图1为用Kyte&Doalittle软件对EBV-DNase蛋白的1-470氨基酸的进行抗原决定簇分析示意图。
图2为用OHM软件对EBV-DNase蛋白的1-470氨基酸的进行抗原决定簇分析示意图。
图3为用OHM软件对EBV-DNase蛋白的1-470氨基酸的进行抗原决定簇分析示意图。
图4为用EBV-Dnase-7和EBV-Dnase-8混合多肽检测300份鼻咽癌病人血清和300份正常人血清得出的OD值的ROC曲线图。
具体实施方式
我们对EB病毒特异性DNA酶(EBV-DNase)抗体的检测进行了改进，筛选和优化组合了EBV-DNA酶肽抗原，验证了优选的酶肽抗原检测EBV-DNA酶IgA的特异性和灵敏度，并建立了EBV-DNA酶肽抗原ELISA技术检测血清或血浆中EBV-DNA酶IgA抗体的方法，用于鼻咽癌的筛查和辅助诊断。其中，实验中所用的血清来源于中山大学肿瘤医院。
1.优选EBV-DNA酶的抗原肽
首先，用EMBOSS Pepinfo/Pepwindow/Pepstats软件对Epstein-Barr virus(EBV)DNase进行抗原性分析。然后，根据抗原性分析挑选以上三种软件算法分析蛋白抗原性相同的肽，长度为40aa。合成多肽，用ELISA检测法检测病理确诊的鼻咽癌病人和正常人血清，优选出只与鼻咽癌病人血清反应，不与正常人血清反应或与正常人血清发生弱反应的多肽。
2.ELISA检测法
ELISA法检测血清EBV-DNA酶抗体的方法，按照以下步骤进行：用合成的优选Epstein-Barr virus(EBV)DNase抗原肽包被ELISA板，BSA封闭后，加入待检血清，血清中的EBV-DNA酶抗体可与优选Epstein-Barr virus(EBV)DNase抗原肽结合，洗去杂质，加入HRP标记的抗人IgA，形成Epstein-Barr virus(EBV)DNase抗原肽抗EBV-DNA酶抗体-HRP-抗人IgA复合物，洗涤后，加入TMB显色，酶标仪检测。
结果判断
按以下公式计算对照血清或患者样本吸光度值和标准品吸光度值的比值：
比值＝对照或患者样本吸光度值-空白对照吸光度值/两个标准品吸光度值的平均值-空白对照吸光度值
按以下方法解释结果：
比值≥1.2            阳性
比值≥1.0但＜1.2     可疑
比值＜1.0            阴性
定性：结果判定采用ELISA结果判定标准，即SCO判定方法(Cut-off值判定方法)。测定值大于或等于1.2倍的Cut-off值为阳性(真阳性率99％)，测定值位于1.2倍的Cut-off值和1.0(包含1.0)倍的Cut-off值之间为可疑阳性，测定值小于1.0倍的Cut-off值为阴性(真阴性率99％)。
Cut-off值的确定：用SPSS软件的ROC方法分析用本法大样本量(正常人血清和病理确诊的鼻咽癌病人血清各300份)检测所得出的OD值，获得ROC曲线图和cutoff值，以Cutoff值上下0.005范围内的样本血清混合后作为标准血清。
一.查看Epstein-Barr virus(EBV)DNase氨基酸序列
1MADVDELEDP MEEMTSYTFA RFLRSPETEA FVRNLDRPPQ MPAMRYVYLYCLCKQIQEFS
61GETGFCDFVS SLVQENDSQD GPSLKSIYWG LQAATDEQRT VLCSYVESMTRGQSENLMWD
121ILRNGIISSS KLLSTIKNGP TKVFEPAPIS TNHYFGGPLA FGLRCEDTVKDIVCKLICGD
181ASANRQFGFM ISPTDGIFGV SLDLCVNVES QGDFILFTDR SCIYEIKCRFKYLFSKSEFD
241PIYPSYTALY KRPCKRSFIR FINSIARPTV EYVPDGRLPS EGDYLLTQDEAWNLKDVRKR
301KLGPGHDLVA DSLAANRGVE SMLYVMTDPS ENAGRIGIKD RVPVNIFINPRHNYFYQVLL
361QYKIVGDYIR HSGGGKPGRN CSPRVNIVTA FFRKRSPLDP ATCTLGSDLLLDASVEIPVA
421VLVTPVCLPD SIVRKELNTA AGSWKAYADD TFDTAPWVPS GLFA
二.Epstein-Barr virus(EBV)DNase抗原性分析
用EMBOSS Pepinfo/Pepwindow/Pepstats软件分析(如下图1～3所示)
图1：用Kyte&Doalittle软件对EBV-DNase蛋白的1-470氨基酸的进行抗原决定簇分析示意图。
图2：用OHM软件对EBV-DNase蛋白的1-470氨基酸的进行抗原决定簇分析示意图。
图3：用Consensus软件对EBV-DNase蛋白的1-470氨基酸的进行抗原决定簇分析示意图。
上述图1～3的纵坐标为亲水性参数，横坐标为EBV-DNase的1-470氨基酸序列，峰值越高，表示亲水性越好。挑选三种软件分析相同的亲水性片段作为候选肽抗原。
三.Epstein-Barr virus(EBV)DNase抗原肽挑选(根据抗原性分析挑选)，挑选原则：挑选三种算法分析蛋白抗原性相同的肽，长度为40aa。
8个肽序列在全长中的位置(用下划线标出)
1MADVDELEDP MEEMTSYTFA RFLRSPETEA FVRNLDRPPQ MPAMRYVYLYCLCKQIQEFS
61GETGFCDFVS SLVQENDSQD GPSLKSIYWG  LQAATDEQRTVLCSYVESMT RGQSENLMWD
121ILRNGIISSS KLLSTIKNGP TKVFEPAPIS TNHYFGGPLA FGLRCEDTVKDIVCKLICGD
181ASANRQFGFM ISPTDGIFGV SLDLCVNVES QGDFILFTDR SCIYEIKCRFKYLFSKSEFD
241PIYPSYTALY KRPCKRSFIR FINSIARPTV EYVPDGRLPS EGDYLLTQDEAWNLKDVRKR
301KLGPGHDLVA DSLAANRGVE SMLYVMTDPS ENAGRIGIKDRVPVNIFINP RHNYFYQVLL
361QYKIVGDYIR HSGGGKPGRN CSPRVNIVTA FFRKRSPLDP ATCTLGSDLLLDASVEIPVA
421VLVTPVCLPD SIVRKELNTA AGSWKAYADD TFDTAPWVPS GLFA
分别编号
EBV-Dnase-1  41MPAMRYVYLY CLCKQIQEFS   60
EBV-Dnase-2  61GETGFCDFVS SLVQENDSQD   80
EBV-Dnase-3  121ILRNGIISSS KLLSTIKNGP  140
EBV-Dnase-4  191ISPTDGIFGV SLDLCVNVES  210
EBV-Dnase-5  306DLVADSLAAN RGVESMLYVM  325
EBV-Dnase-6  361QYKIVGDYIR HSGGGKPGRN  380
EBV-Dnase-7  401ATCTLGSDLL LDASVEIPVA 420
EBV-Dnase-8  421VLVTPVCLPD SIVRKELNTA 440
四.分别按以上序列合成多肽(上海强耀生物科技有限公司)，纯度＞98％。经质谱鉴定，肽序列正确。
五.以上合成的多肽诊断NPC的筛选
1.标本(中山大学肿瘤医院提供)：
正常人血清和病理确诊的鼻咽癌病人血清各300份
2.方法：分别用ELISA检测(具体操作如下)
1)包被：用0.05M PH9.6的碳酸盐包被缓冲液将多肽稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
2)封闭：次日，弃去孔内溶液，再每孔加入3％BSA[BSA粉剂为SIGMA，溶于0.01mol/L PBS(pH 7.2-7.4)中，PBS配方见表1所示]200μl，37℃，孵育1小时。
表1PBS配方
0.01mol/L PBS(pH 7.2-7.4)
0.2mol/L NaH2PO4        19ml；
0.2mol/L Na2HPO4        81ml；
NaCl                    17g；
蒸馏水至                2000ml
3)洗涤(可以任选以下一种方式)：
①手工：倒掉反应孔中的液体，用稀释后的清洗液(配方见表2所示)洗4次，每次每孔300u；
②洗板机：程序设定为稀释后的清洗液洗4次，每次每孔300ul。
(每次清洗时清洗液在反应孔中至少保留30-60秒，然后再倒掉。清洗完后将微孔板在滤纸上拍干)。(简称洗涤，下同)。
表2清洗液配方(即PBS-T)
0.01mol/L PBS(pH 7.2-7.4)    2000ml
TWEN-20                      2ml
4)加样：将标准品、阳性对照、阴性对照以及按1∶100与样本稀释液(配方见附表3所示)稀释之后的待检样品加入反应孔中，并做空白对照(即加100ul样本稀释液稀释)，100ul/孔，置37℃，孵育1小时。(标准品平行做两孔)
表3样本稀释液(100ml)
BSA                1g
Triton x-100       100ul
PBS-T至            100ml
5)洗涤：同上
6)加酶标抗体：于各反应孔中，加入酶标抗体，100ul/孔，置37℃，孵育1小时。
7)再次清洗：清洗6次，方法同上。
8)加底物液显色：于各反应孔中加入底物A(含过氧化氢)溶液50ul，底物B(含TMB)溶液50ul，轻摇混匀，置于阴暗处，15分钟。
底物A为体积百分比浓度为0.6％过氧化氢溶液，
底物B配方以10mg TMB(四甲基联苯胺)溶于1ml DMSO(二甲基亚砜)中作为原液，并按照如下方式配制
上述原液                            1ml
0.1Mol/L的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液     57.5ml
0.2mol/L枸橼酸缓冲液                42.5ml
9)终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml，轻摇混匀，置5分钟。
10)测OD值：在酶标仪(Thermo公司)上，于450nm波长测OD值。
3、所得数据用SPSS软件分析，结果如下表(表4)：
                     Cutoff值     灵敏度(％)  特异性(％)
EBV-Dnase-1肽抗原    0.203        75.0        81.2
EBV-Dnase-2肽抗原    0.311        46.3        53.9
EBV-Dnase-3肽抗原    0.189        58.7        79.6
EBV-Dnase-4肽抗原    0.406        66.3        90.2
EBV-Dnase-5肽抗原    0.356        80.5        77.9
EBV-Dnase-6肽抗原    0.256        49.6        88.4
EBV-Dnase-7肽抗原    0.297        82.9        85.5
EBV-Dnase-8肽抗原    0.312        83.3        88.6
4、由上述表4可见EBV-Dnase-7和EBV-Dnase-8多肽最为合适。
Cutoff值为判定阴阳性的临界值。
灵敏度也叫阳性检出率，表示在确诊为有病者中检测为阳性者所占的比例。
特异性也叫真阴性率，表示在确诊为正常人中检测为阴性者所占的比例。
判断EBV-Dnase-7和EBV-Dnase-8最为合适的标准是：在保证灵敏度较高的情况下，特异性也较高。
六、⑦和⑧多肽混合检测
1、将EBV-Dnase-7和EBV-Dnase-8多肽按200ng∶100ng(每个反应孔)混合包板按以上方法实验(具体方法同五.2)。
2、所得数据用SPSS软件分析，得出结果(如下图4所示)
              Cutoff值    灵敏度(％)  特异性(％)
混合肽抗原    0.297       86.3        87.5
图4为用EBV-Dnase-7和EBV-Dnase-8多肽检测300份鼻咽癌病人血清和300份正常人血清得出的OD值的ROC曲线。
由图4可知，以EBV-Dnase-7和EBV-Dnase-8混合多肽为包被抗原检测人血清中EBV-DNA酶IgA抗体，对病人既有较高的检出率(即灵敏度高)，同时对正常人也有较高的排除率(即特异性高)。
七.因此，我们可以用⑦和⑧多肽混合检测血清，以得出的Cutoff值来为鼻咽癌筛查和辅助诊断提供检测依据。
具体判断方法如下：
为了减少操作过程中的误差，我们选出经检测吸光度在Cutoff值上下0.005范围内的样本作为标准品。
按以下公式计算对照血清或患者样本吸光度值和标准品吸光度值的比值：
比值＝对照或患者样本吸光度值/两个标准品吸光度值的平均值
按以下方法解释结果：
比值≥1.2            阳性
比值≥1.0但＜1.2     可疑
比值＜1.0            阴性
定性：结果判定采用ELISA结果判定标准，即SCO判定方法(Cut-off值判定方法)。测定值大于或等于1.2倍的Cut-off值为阳性(真阳性率99％)，测定值位于1.2倍的Cut-off值和1.0(包含1.0)倍的Cut-off值之间为可疑阳性，测定值小于1.0倍的Cut-off值为阴性(真阴性率99％)。
Cut-off值的确定：用SPSS软件的ROC方法分析用本法大样本量(正常人血清和病理确诊的鼻咽癌病人血清各300份)检测所得出的OD值，获得ROC曲线图和cutoff值，以Cutoff值上下0.005范围内的样本血清混合后作为标准血清。
序列表
<110>广州市搏克生物技术有限公司
<120>EBV-DNA酶肽抗原ELISA法检测EBV-DNA酶IgA抗体
<160>2
<210>1
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Ala Thr Cys Thr Leu Gly Ser Asp Leu Leu Leu Asp Ala Ser Val
1                5                   10                  15
Glu Ile Pro Val Ala
                20
<210>2
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
Val Leu Val Thr Pro Val Cys Leu Pro Asp Ser Ile Val Arg Lys
1                5                   10                  15
Glu Leu Asn Thr Ala
                 20