假高粱及其近似种单粒种子DNA快速提取方法 【技术领域】
本发明涉及用于作物品种种子鉴定的方法，尤其涉及一种从单粒假高粱及其近似种种子中直接快速提取微量DNA的方法，属于种子真实性鉴定的技术领域。
背景技术
假高粱是世界十大恶性杂草之一，我国已将其列入有害生物名单。假高粱的种子特征与拟高粱、苏丹草等Sorghum属其他种十分相似，加之口岸截获的假高粱种子由于小穗轴，颖壳等特征部位易被挤压而折断、破损，给以种子鉴定为主的口岸检疫工作带来更大困难，因此用PCR方法快速鉴定假高粱及其近似种是一种简便可靠的鉴定方法。但口岸检疫工作中通常能提供分子鉴定的样品量仅为1-2粒种子，传统的DNA提取方法以及现有的试剂盒均未提出过对如此微量种子样品的提取方案。
现有的DNA提取方法有SDS法、CTAB法、试剂盒法。郭琼霞等已比对过假高粱及七个近似种的DNA的四种提取方法(SDS法、CTAB法、moller法、TAKARA试剂盒)(郭琼霞等，Sorhum属7个近似种的DNA微量提取方法比较，植物检疫[J]，2005，19(2)：65-68)，得到结论：对有限的检疫性有害杂草样品(0.05g-0.1g)DNA的提取，采用Moller方法的提取率最高，分别为SDS法的2.11倍，CTAB法的1.17倍，takara试剂盒的5.8倍。
目前市面上的植物DNA提取试剂盒大多以0.05g的重量为限，而假高粱的种子平均单粒种量为0.005g，即现有的试剂盒不能保证满足提取更微量样品DNA的需求。
本发明的目的在于避免DNA提取的传统方法以及现有试剂盒的样品量仍然较大以及耗时较长的不足而提供一种能够从单粒种子中提取足以满足后期分子鉴定需要量的DNA提取方法。本方法能够从单粒假高粱成熟种子提取出30ul220ng/ul的DNA。而一次PCR的DNA需求量约为50ng，即本方法提取得单粒种子DNA量可以至少满足做130次PCR检测的需求。
郭琼霞研究组在《Sorghum属7个近似种的DNA微量提取方法比较》一文中已对Sorghum属7个近似种多粒种子DNA提取得方法进行了报道。本发明是继上述研究后继续探索Sorghum属7个近似种单粒种子DNA提取率和提取纯度以及提取时间所得结果。此处将郭琼霞等2005年报道《Sorghum属7个近似种的DNA微量提取方法比较》的moller方法列出：取样品0.05g，经液氮速冻后研磨至粉末，加入500μlTES[100mM Tris，10mM EDTA，2％SDS]，加50-100μg蛋白酶K，55-60℃温育0.5-1h，期间轻轻摇动混匀；调节NaCl浓度至1.4mol/L，加1/10体积10％CTAB，65℃10min；加入1体积氯仿：异戊醇(24∶1)，轻摇混匀，于0℃30min，之后4℃12000rpm离心10min；取上清，加入225μl 5molNH4AC，混匀，放在冰上30min以上，4℃12000rpm离心10min；取上清，加3ul Rnase，于37℃15min，4℃12000离心10min；取上清，加0.55体积异丙醇沉淀DNA，立即12000rpm离心5min，若无DNA团出现，立即置样品于冰上15-30min；弃上清，70％乙醇洗沉淀2次，干燥后溶解于50μlTE中。
【发明内容】
本方法的目的在于力求在最短的时间从假高粱及其近似种单粒种子中提取高浓度高纯度的DNA。
假高粱及其近似种单粒种子直接快速提取DNA的方法，包括如下步骤：
(1)取假高粱或其近似种单粒成熟种子，经液氮速冻后研磨至粉末；
(2)往前述粉末中，先后加入TES和蛋白酶K，55-60℃温育；
(3)加入浓度为1.4mol/LNaCl，然后，加入1/10体积10％CTAB，温育；
(4)往步骤(3)加入1体积的氯仿：异戊醇，氯仿与异戊醇的体积比为24∶1，混匀，冰育之后充分离心；
(5)取前述离心之后上清液，加入适量NH4AC，冰育之后充分离心；
(6)取前述(5)中离心之后的上清液，加0.55体积异丙醇沉淀DNA，立即充分离心，若无DNA团出现，立即将离心管置于冰上；
(7)弃步骤(6)的上清液，乙醇洗沉淀，干燥后溶解于TE中。
前述方法中，所述的TES提取液含有100mM pH为8.0的Tris，10mM pH为8.0的EDTA以及质量浓度为2％的SDS。
本发明无需经发芽的过程，只需单粒种子磨碎提取，样品量极其微量，能从0.005g假高粱种子种提取出30ul 220ng/ul的DNA。现有的市售植物材料微量DNA提取试剂盒在说明书中的样品量均不低于0.05g。本法提取DNA的全程时间约为200min。完全能满足口岸检疫快速检测的要求，大大简化了过程，节约了时间，是一种极为方便、经济、有效的方法。在假高梁及其近似种种子真实性快速鉴定研究中，本发明具有重大的应用价值。
【附图说明】
图1是植株叶片rbcL-PCR电泳的效果。
图2是单粒种子rbcL-PCR电泳的效果。
图1、图2中：数字1到10分别表示假高梁、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、明福1号、苏丹草、高丹草、二色高粱、光高梁、清水对照。rbcL引物序列为：
5’-ATGTCACCACAAACAGA-3’，
5’-GATTGGGCCGAGTTTAATT-3’。
【具体实施方式】
假高粱及其近似种单粒种子直接快速提取DNA的方法包括如下步骤：
(1)取1粒假高粱或其近似种单粒成熟种子，经液氮速冻后研磨至粉末；
(2)加入500μlTES(TES提取液含有100mM pH为8.0地Tris，10mM pH为8.0的EDTA以及质量浓度为2％的SDS)，加50-100μg蛋白酶K，55-60℃温育1h，期间轻轻摇动混匀；
(3)调节NaCl浓度至1.4mol/L，加1/10体积10％CTAB，65℃10min；
(4)加入1体积氯仿：异戊醇(24∶1)，轻摇混匀，于0℃30min，之后4℃12000rpm离心10min；
(5)取上清，加入225μl 5mol NH4AC，混匀，放在冰上1h，4℃12000rpm离心10min；
(6)取上清，加0.55体积异丙醇沉淀DNA，立即12000rpm离心5min，若无DNA团出现，立即置样品于冰上15-30min；
(7)弃上清，70％乙醇洗沉淀2次，干燥后溶解于30μlTE中。
本发明与郭琼霞等2005年报道的方法不同之处：本方法明确了加蛋白酶K后水浴的时间以及加入NH4Ac后冰浴的时间，确定了最佳提取效果的水浴与冰浴时间；并根据分子鉴定的实际需要，删除添加Rnase的步骤。
实施例1
对假高梁、黑高粱、丝克高粱、拟高粱、明福1号、苏丹草、高丹草、二色高粱、光高梁等9个高粱属(Sorghum)植物的单粒种子进行了DNA提取。步骤如下：
(1)取1粒假高粱或其近似种单粒成熟种子，经液氮速冻后研磨至粉末；
(2)加入500μlTES[100mM Tris，10mM EDTA，2％SDS]，加50-100μg蛋白酶K，55-60℃温育1h，期间轻轻摇动混匀；
(3)调节NaCl浓度至1.4mol/L，加1/10体积10％CTAB，65℃10min；
(4)加入1体积氯仿：异戊醇(24∶1)，轻摇混匀，于0℃30min，之后4℃12000rpm离心10min；
(5)取上清，加入225μl 5mol NH4AC，混匀，放在冰上1h，4℃12000rpm离心10min；
(6)取上清，加0.55体积异丙醇沉淀DNA，立即12000rpm离心5min，若无DNA团出现，立即置样品于冰上15-30min；
(7)弃上清，70％乙醇洗沉淀2次，干燥后溶解于30μlTE中。
为了比较从叶片中提出DNA的效果，同时对实施例一中的9个物种的鲜叶进行DNA提取，每个物种取0.05g鲜叶，步骤同上。在核酸蛋百分析仪下测定了它们的OD260、OD280、OD260/280以及浓度(ng/ul)，并对提取的DNA进行rbcL-PCR琼脂糖凝胶电泳检测。以OD260/280值为指标来衡量DNA的纯度，该值等于1.8表示DNA相对较纯；小于1.8表示DNA中有蛋白质污染；大于1.8则表示DNA中有RNA污染。从本发明的测定结果看(表1，表2)，从假高梁及其8个近似种单粒种子和幼苗叶片中提取的DNA OD260/280值均十分接近1.8，说明本发明提取单粒假高梁及其近似种种子的DNA纯度符合要求。
表1 从假高梁及其近似种幼苗叶片提取DNA的OD值
物种 OD260/280 OD260/230 浓度(ng/ul) 假高梁 1.726 1.026 369 黑高粱 1.664 0.441 134 丝克高粱 1.754 1.239 167 拟高粱 1.831 1.232 239
物种 OD260/280 OD260/230 浓度(ng/ul) 明福1号 1.820 0.884 226 苏丹草 1.703 0.875 271 高丹草 1.735 0.898 275 二色高粱 1.802 1.165 343 光高粱 1.903 1.974 140
表2 从假高梁及其近似种单粒种子提取DNA的OD值
物种 OD260/280 OD260/230 浓度(ng/ul) 假高梁 1.82 1.28 220 黑高粱 1.82 1.10 232 丝克高粱 1.66 1.12 180 拟高粱 1.910 1.243 210 明福1号 1.973 1.269 187 苏丹草 1.636 1.331 225 高丹草 1.935 1.626 338 二色高粱 1.812 1.165 380 光高粱 1.974 1.303 190
将提取出的9个Sorghum属植物种子和叶片的DNA稀释至50ng/ul，进行rbcL-PCR琼脂糖凝胶电泳检测，在400bp处呈现出清晰、一致的片断。结合核酸蛋白分析仪的测定结果和电泳图谱，无论是种子提取的DNA还是植株叶片提取的DNA，均符合作为PCR扩增模板的试验要求。