本发明是有关用缺乏L-丝氨酸脱氨酶活性的突变菌株生产色氨酸的方法。下面称之为L-丝氨酸脱氨酶，它的活性本质与尿酸梭菌分离出的一种酶相似。它已被命名为EC4，2，1，14，下面称之为L-丝氨酸脱氨的活性，参见卡特（Carter J·F·）和塞耶斯（Sa-yers·R·D）的文章“尿酸梭菌”、发表在细菌学杂志（J·Bacte-rial）109期，757-763页（1972年）。发明特别与利用L-丝氨酸脱氨酶（L-SD）活性缺乏的大肠杆菌K12的几个突变菌株有关。 用微生物从碳水化合物中生产L-色氨酸现有技术中有两种方法来完成。第一个是选择抗色氨酸及类似物的反馈物的野生型微生物的突变菌株。这种方法的例子包括抗-5氟色氨酸的一个枯草芽杆菌的菌株（Bacillus substilis）。（见美国专利4，363，875）抗5-甲基色氨酸的短杆菌属的一些种（Brevi bacterium）（见美国专利3，700，539）;及其它需要苯丙氨酸和酪氨酸，並且抗4-甲基色氨酸、6-氟色氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-氟色氨酸、酪氨酸-氧酸盐（酯）和苯丙氨酸-氧酸盐（酯）的各氨酸棒杆菌（ATCC21851）。后一个菌株可以利用15克/10毫升甘蔗赤糖糊密糖转化地蔗糖生产出16.8毫克/升的色氨酸。
第二个增加色氨酸生产的方法是提供一个质粒和几个质粒上携带控制色氨酸生物合成遗传信息给宿主微生物。后一个方法的例子是美国专利4，371，614所述的通过携带色氨酸生物合成信息的质粒转化缺乏色氨酸酶的大肠杆菌宿主〔EC4、1，99，1〕。
不论用于色氨酸合成的微生物是一个突变菌株还是转化菌株，色氨酸都是通过下列途径合成的：
图表1
邻氨基苯甲酸是在色氨酸生物合成途径的第一个主要前体。生产色氨酸的最后一步是色氨酸合成酶参与了一个吲哚-3-磷酸甘油分子和一个丝氨酸分子缩合，成色氨酸和3-磷酸甘油醛。
人们发现，在微生物中通过吲哚-3-磷酸甘油集中起来的色氨酸前体库是很多的。丝氨酸的供应决定着色氨酸的生产率。一般丝氨酸生物合成是沿下列途径进行的。
图表2
3-磷酸甘油酸
3-磷酸羟基丙酮酸
3-磷酸红氨酸
（叶酸）
丝氨酸 甘氨酸
L-丝氨酸脱水酶
丙酮酸（L-丝氨酸脱氨酶）
丙酮酸
乙酰辅酶A
丝氨酸在几条途径里被消耗。一条是丝氨酸通过四氢叶酸反应转化成甘氨酸。另一条主要降解途径是L-丝氨酸脱氨酶作用于丝氨酸导致产生丙酮酸和乙酰辅酶A。在尿酸梭菌中，L-丝氨酸脱氨酶被认为是尿酸发酵途径的一种酶。该酶一般在一系列丝氨酸生成和它作为主要碳素代谢部分的进一步代谢活动中起作用。L-丝氨酸脱氨酶的水平随着氮素营养，碳源和氨基酸可利用程度而改变。L-丝氨酸脱氨酶活动的诱导物是很具特征性的。这些诱导物包括氮素的缺乏，甘氨酸和亮氨酸的存在（但不是丝氨酸，因为它不影响甘氨酸和亮氨酸的诱导），和在葡萄糖基本培养基上的生长。
在生产氨基酸最廉价的葡萄糖基本培养基上培养，L-丝氨酸脱氨酶的水平是高的。（参见纽曼（Newman F·B·）和卡普尔（Kapo-or·V·的文章“大肠杆菌K12菌株中L-丝氨酸脱氨酶活性的离体研究”刊载在加拿大生化杂志（Can·J·Biochem·）58期，1292-1297页，（1980年）。据信它通过脱氨作用导致细胞内丝氨酸水平的下降，保持丝氨酸库处于低水平，避免了丝氨酸对L-苏氨酸脱氨酶的抑制作用。（参见伊森伯格（Isenberg'S·）和纽曼（NewmanE·B·）的文章“大肠菌K12菌株中L-丝氨酸脱氨酶的研究”，载在细菌学杂志118期，53-58页（1974年）。可以肯定的是在有L-丝氨酸脱氨酶存在时，大肠杆菌K12菌株不可逆地把L-丝氨酸转化为丙酮酸或者一个和丙酮酸处于同一氧化水平的化合物。既使L-丝氨酸脱氨酶的一个自然底物，它也能在生理上有意义的反应中被L-丝氨酸脱氨酶降解（参见纽曼（Newman'E·B·）和沃克（Wa-lker'C·）文章“在大肠杆菌K12菌株中L-丝氨酸的降解：L-丝氨酸，甘氨酸和亮氨酸联合作为碳源”，刊载在细菌学杂志151期777-782页（1982年）。
丝氨酸对色氨酸生物合成或丝氨酸发酵生产的可利用性可以通过利用缺乏丝氨酸降解酶的微生物得到加强。叶酸盐缺乏的微生物从代谢的观点来看过于应激反应以致于在培养中不能继续维持。然而，缺乏L-丝氨酸脱氨酶的微生物可以继续培养，并用来，并用来作为加强色氨酸生物合成的微生物来源。
L-丝氨酸脱氨酶缺乏活性的微生物在色氨酸生产中的有用性特别是体现在那些被修饰为增强色氨酸生产的微生物。例如，一些在美国专利4，371，614中被揭示的微生物，其中用携带色氨酸生物合成信息的质粒转化了的色氨酸酶活性缺乏的大肠杆菌K12菌株在生产色氨酸时就比未加修饰的大肠杆菌菌株产量高得多。在这些菌株中色氨酸生产的限制因子是L-丝氨酸的降解及是否通过微生物合成它或是否通过L-丝氨酸脱氨酶从外源来供应它。
在美国专利4，371，164揭述的菌株及其它为增加色氨酸生产而修饰了的菌株可以通过在L-丝氨酸脱氨酶缺乏活性的菌株中生长的噬菌体P，用它转导产生色氨酸的菌株，再筛选出降低L-丝氨酸脱氨酶活性的转导体或增加色氨酸生产或二者兼有之的转导菌株进一步增加色氨酸的生产。
发明者制造和分离了一些微生物菌株，特别是革兰氏阴性菌，像L-丝氨酸脱氨酶活性缺乏或几乎没有的大肠杆菌。术语“L-丝氨酸脱氨酶活性缺乏菌株”在此是指微生物中L-丝氨酸脱氨酶活性低于野生型亲本的菌株。（L-丝氨酸脱氨酶活性的测定是用后面例子中描述的方法进行的）。根据这个定义，L-丝氨酸脱氨酶活性缺乏菌株中该酶活性在5个毫单位或更低（在后面的例子中确定）。L-丝氨酸脱氨酶活性缺乏的大肠杆菌菌株不能在含丝氨酸，甘氨酸或亮氨酸的基质上生长，当它生长在葡萄糖基本培养基上缺乏L-丝氨酸脱氨酶的活性。根据本发明，大肠杆菌K12菌株暴露在紫外线照射或利用增变噬菌体Mu的dx转座子（Mudx）插入到大肠杆菌K12菌株后的转座子诿变再适当的培养基上筛选出缺乏L-丝氨酸脱氨酶的突变菌株。
根据发明所叙述的程序提供了一个从广泛可利用的微生物中制造和分离缺乏L-丝氨酸脱氨酶活性的突变菌株的方法。这些可以利用的微生物包括革兰氏阴性菌如：大肠杆菌。
图Ⅰ是一个表示不同氨基酸的不同浓度与181-34菌株产量关系的曲线图。
图Ⅱ是质粒PD2643内切酶切点图解。
从下面例子我们可以更好地理解发明。
例Ⅰ
1、MEW128菌株的分离：
一个在ilva部分缺失的野生型大肠杆菌CU1008菌株是从美国密苏里州圣路易斯市华盛顿大学医学院威廉斯先生（L·S·Wi-lliams）处得到的。
MEW 128菌株：用紫外光照射CU1008菌株，再根据戴维斯（Davis'B·D·）等人的方法在含青霉素并含丝氨酸2毫克/毫升，甘氨酸200微克/毫升，亮氨酸50微克/毫升的葡萄糖培养基上在37℃下继代培养。（参见“用青霉素分离生化缺陷型细菌”，刊在美国化学协会杂志70卷4267页（1948）。把残存者转移到葡萄糖基本培养基，用影印法筛选并在添加了如上配方中含量的丝氨酸，甘氨酸、和亮氨酸的细菌甲琼脂（Bacto-Agar）培养基上培养（称之为SGL-平板培养基）。MEW128菌株由于不能在SGL-平板上生长，也不能在液体的葡萄糖基本培养基上生长而被选择了。这个菌株也是需要硫胺素的，它已被贮存在美国样品培养收集中心（ATCC）。该中心的地址是：美国，马里兰州，罗克威尔，帕克龙-德策伏12301，Parklawn，Drive，Rockvill，Maryland，U·S·A·20852）登记号为39577。登记时间为1984年1月12日。
尽管MEW128菌株初步分离已如上述进行了，它还需要进一步通过在葡萄糖基本培养基追加其它物质的培养基上用影印法筛选。如上述加丝氨酸、甘氨酸和亮氨酸，再加8克/升的捷特利特（一种凝固剂的商品名Gelrite商标为Kelco 63002A），使培养液凝固成平板。再加硫胺素10毫升/升，氯化铁5毫克/升，钼酸钠0.1毫克/升，氯化锰0.12毫克/升。
MEW 128菌株不能在这种培养基上生长。
2、酶试验：
L-丝氨酸脱氨酶活性试验是用伊森伯格（Lsenberg'S·）和纽曼（Newman'E·B·）所述的方法，用甲苯处理了的完整细胞内进行的。见“大肠杆菌K12菌株L-丝氨酸脱氨酶的研究。”载在细菌学杂志118期，53-58页（1974年），它已被列在参考文献中。结果在下面的表1，单位是毫单位（mu），也就是0.1毫升含100Klette单位的细胞悬液在35分钟产生的酮酸的毫微克分子数。在这个试验中5毫单位是最低的可靠值。
表1
L-丝氨酸脱氨酶在MEW128菌株及其它相关菌株中的活性
其它相关菌株中的活性 不依赖硫胺
试验号 培养条件 CU1008 MEW128 素的回复体
1 葡萄糖基本培养基 19 5 7
2 加甘氨酸和亮氨酸 110 5 31
3 紫外线照射 130 5 38
4 42℃ 34 5 25
5 LB培养基 230 30 51
＊LB培养基含有细菌用胰化蛋白（.Bactryptone是其商品名）10克/升，细菌用酵母提取物5克/升，氯化钠10克/升（参见米勒Miller，J·H·著的“分子遗传学实验”，冷泉港（1973年），下面将提及米勒。）
把37℃下在葡萄糖基本培养基上生长的对数生长期细胞在下面五种条件下继代培养：与上面一样的培养基，37℃（实验1）和42℃下实验4）;与上面一样的培养基加上一些氨基酸（实验2）;在LB培养基上培养（实验5）;把一些细胞先用紫外光照射60秒后再葡萄糖基本培养基上培养（实验3）。没特殊说明的均是在37℃下恒温培养。培养后1小时测定L-丝氨酸脱氨酶的活性。实验方法的细节在纽曼（Newman'E·B·）等人的文章“用把大肠杆菌K12菌株暴露于DNA损伤剂的方法所诱导的L-丝氨酸脱氨酶的活性”中已叙述。该文刊在细菌学杂志152期，702-705页（1982年）。
3氧MEW128的特征：
①生长要求：
MEW128菌株不能在添加上述浓度的丝氨酸、甘氨酸和亮氨酸的葡萄糖基本平板培养基上生长。葡萄糖基本培养基支持MEW128生长;但是液体葡萄糖培养基不行，除非添加1/200（体积/体积）的LB培养基。硫胺素3微克/升能代替对LB培养基的需要。对硫胺素的需要可以通过在每个液体葡萄糖培养基里添加超过300微克/毫升的琥珀酸和醋酸或5微克/毫升的赖氨酸和10微克/毫升的蛋氨酸来代替。真正依赖硫胺素的菌株缺乏乳酸脱氢酶（LDH），因为这种酶需要硫胺素做为辅助因子。这样，依赖硫胺素的微生物菌株分泌丙酮酸。MEW 128分泌丙酮酸可以通过非酸化的培养物上清液和商品乳酸脱氢酶（伯林格-曼海姆公司出品，Boehringer Mannheim Co·）反应以及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化实验来鉴定。（参见霍浩斯特Hohorst'H·-J·的文章“用乳酸脱氢酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸鉴定L-（+）乳酸”，刊在酶学分析方法（于1965年学院出版公司出版，第二版，编者是伯格姆耶（Bergmya'H·V·）和沃策格，舍米（Vellag Chemi）。结果表明本质上所有的酮酸都是丙酮酸。
②L-丝氨酸脱氨酶活性：
实验表明37℃，在葡萄糖基本培养基上生长的MEW 128菌株很少（仅5毫单位）或没有L-丝氨酸脱氨酶活性（表1）。然而在LB培养基上的培养物诱导出实在量的活性（30毫单位），大大低于在同样条件下生长的亲本菌株的活性（230毫单位）。其它已知的L-丝氨酸脱氨酶诱导物-紫外光、甘氨酸和亮氨酸以及增加温度（42℃）都没发生有意义的效应。（都差不多只有5个毫单位）。很明显，MEW 128菌株虽然对大多数常规诱导条件无反应，它却保留了产生一些L-丝氨酸脱氨酶活性的能力。
用生长在加硫胺素的葡萄糖基本培养基上的细胞重复相同的实验，结果相同。添加过量的硫胺素是不能恢复L-丝氨酸脱氨酶的活性。为了保证硫胺素在正常情况下不影响L-丝氨酸脱氨酶的活性。可以肯定，硫胺素在正常情况下不影响L-丝氨酸脱氨酶的活性。按上述方法测定了在添加或不加硫胺素条件下生长的亲本CU1008菌株细胞内L-丝氨酸脱氨酸脱氨酶的活性。可以看到，活性没有不同。（资料未给）。
总之，MEW 128菌株在两个方面与亲本不同：它生长需要硫胺素;既使在诱导L-丝氨酸脱氨酶的条件下，它也缺乏这个酶的活性。
③不依赖硫胺素的MEW128回复体：
没有硫胺素就可以在葡萄糖基本培养基上生长的MEW128的回复体被分离出来。它的单菌落分离物被接种到液体葡萄糖基本培养基，恒温培养到生长盛期。通过把液体培养物涂于葡萄糖基本培养基平板来分离菌落。因为MEW 128生长在葡萄糖基本培养基平板上，所以很明显，液体培养基仅仅是为了选择不依赖硫胺素的菌株。
用上述方法在葡萄糖基本培养基上测定同时分离出的不依赖硫胺素的二十五个菌种的L-丝氨酸脱氨酶活性。结果表明都显示有些活性。这些菌株中的五个在葡萄糖基本培养基和添加了甘氨酸250微克/毫升，亮氨酸50微克/毫升的基本培养基上测定其L-丝氨酸脱氨酶活性。该酶在没诱导时其值为9-18毫单位，诱导时为27-47毫单位。从未见过恢复到野生型的水平。一种回复体在各种诱导条件下测定的值示在表1。在所有情况下只观察到了部分诱导。
例Ⅱ
1、MEW 191菌株的分离：
携带一个乳糖操纵子缺失的CU 1008菌株的衍生体（后面称为CU1008△lac），通过用青霉素选择分离出的脯氨酸营养缺陷型，然后用一个携带乳糖操纵子缺失的给体转导成不需脯氨酸的菌株。给体菌株CAG5050（MudxCAM（APr lac）Pro lac his met rpsl nalr/FPro lac Z8305∶∶Mu Cts62）是从美国威斯康星、麦迪逊，威斯康星大学的豪（M·Howe）那里得到的。这个菌株对MudlB∶∶Tng噬菌体-一个Mndl噬菌株的X突变体是溶源性的。（见卡萨达班Casadaban，M·J·和科恩cohen'S·N·的文章“一个Mu-lac噬菌体一步将乳糖基因融合到外源启动子：体内的转录控制顺序的探钎”，刊在美国科学院学报76卷4530-4533页（1979年）。Mudl噬菌体X突变体是通过把转座子9（Tng）插入到B基因而得到的。（参见贝克Baker，T·A·等人的文章“Mudx，一种在高温下使lacZ稳定融合的Mudl（lacAPr）衍生体”，刊载在细菌学杂志156期，970-974页（1983年）。）
CU1008△lac菌株用在高温下稳定与lacZ融合的噬菌体Mudx转导为抗氯霉素和抗氨苄青霉素菌体。转导了的菌株被称作MEW191，它是被分离出的抗氨苄青霉素和氯霉素菌株，不能在SGL一平板上生长。这个菌株在1984年1月12日已贮存在美国样品培养收集中心，登记号为35575。
2、酶方法：
在例1中用的同样方法被用在例2。
3、MEW191菌株的特征记述：
生长需要：MEW191菌株是抗氯霉素和抗氨苄青霉素的，它不能在含丝氨酸，甘氨酸和亮氨酸培养基上生长，而且与MEW128菌株表现型一样：需要硫胺素，在葡萄糖基本培养基上几乎没有L-丝氨酸脱氨酶活性，改变了的对诱导物的反应（见表Ⅱ），MEW191菌株的L-丝氨酸脱氨酶活性实际上是与MEW128相似的。这个菌株也是在缺乏硫胺素时分泌丙酮酸。
表Ⅱ
MEW191及有关菌株的L-丝氨酸脱氨酶的活性
恒温培养 MEW191 回复体
1 1 3
葡萄糖基本培养基 5 23 15 12
加甘氨酸和亮氨酸 5 101 50 46
紫外线照射 5 103 nd nd
42℃ 5 37 nd nd
LB培养基 12 173 nd nd
＊nd＝没有测定
4、不依赖硫胺素的MEW191回复体：
分离出了能够在具有丝氨酸、甘氨酸和亮氨酸的培养基上生长的MEW 191回复体。它们当中一些是抗氯霉素的和抗氨苄青霉素的，另一些则不具抗性。进一步测定了四个对抗生素敏感的菌落，证实它们是不依赖硫胺素的，而其L-丝氨酸脱氨酶活性水平与亲本菌株相似。在有甘氨酸和亮氨酸的培养基上的培养物诱导出较高的L-丝氨酸脱氨酸活性，但不如CU1008菌株那么高。
例Ⅲ
1、一个缺失L-丝氨酸脱氨酶，不需要硫胺素的IK15-5菌株的分离：
采用与例Ⅱ同样的方法和相同的亲本菌株CU1008△lac来分离例Ⅲ的，不能在SGL-平板培养基上生长的IK15菌株。应用常规的噬菌体转导方法（见米勒Miller），用生长在IK15菌株中的噬体P1把CU 1008△lac菌株转导为抗氨苄青霉素和抗氯霉素的菌株。IK15-5菌株作为CU1008△lac的转导体被分离出来。它几乎没有L-丝氨酸脱氨酶的活性，抗氨苄青霉素和氯霉素，不能在SGL平板上生长。这个菌株1984年1月12日已被贮存在美国样品培养收集中心，登记号为39576。
2、酶方法：
例Ⅲ用和例Ⅰ同样的方法。
3、IK15-5菌株的特征记述：
①生长要求：
菌株IK15-5是抗氯霉素和抗氨苄青霉素的，不能在SGL-平板上生长。更有意义的是，IK 15-5不需要硫胺素。
②L-丝氨酸脱氨酶活性：
IK15-5在葡萄糖基本培养基上是没有L-丝氨酸脱氨酶活性的。在表Ⅲ所示的诱导条件下改变该酶的活性。IK15-5菌株中L-丝氨酸脱氨酶活性实际上与在MEW128菌株很相似。生长和测定条件都与例Ⅰ，表Ⅰ相同。
表Ⅲ
培养条件 L-丝氨酸脱氨酶在IK15-5菌株中活性
（毫单位）
葡萄糖基本培养基 2
加甘氨酸和亮氨酸 9
紫外光照射 3
42℃ 4
LB培养基 75
例Ⅳ
各菌株中显示降低L-丝氨酸脱氨酶活性的遗传缺陷的特征记述1、L-丝氨酸脱氨酶结构基因缺陷：
如米勒（Miller）描述的方法，用插入到IK15-5菌株中突变基因来研究β-半乳糖苷酶的转录表明插入是发生在L-丝氨酸脱氨酶的结构基因。如表Ⅳ所示，这种菌株在已知的诱导条件下与亲本菌株比较，虽然L-丝氨酸脱氨酶活性没有有意义的增加，但β-半乳糖苷酶的转录却增加了。生长与试验条件与例Ⅲ相同。
表Ⅳ
L-丝氨酸脱氨酶 β-半乳糖苷酶 L-丝氨酸脱氨酶
条件 活性（单位/毫克蛋白质） 活性（毫单位）
葡萄糖基本培养基 60 2
加甘氨酸和亮氨酸 122 9
紫外光照射 99 3
42℃ 57 4
LB培养基 225 75
来自IK15-5菌株突变基因的插入，β-半乳糖苷酶的转录，由于一个已知增加了L-丝氨酸脱氨酶活性的突变而增加了。
野生型大肠杆菌K12菌株中的ssd突变是一个多效性的基因突变。它的最明显的效应是L-丝氨酸脱氨酶活性表达的增加和如莫里斯（Mo-rris，J·F）和纽曼（Newman，E·B·）所述的不能利用琥珀酸盐作为碳源。参见“大肠杆菌K12中ssd突变的定位图”刊在细菌学杂志，143期，1504-1505页（1980年）。分离ssd突变的方法在纽曼（Newman，E·B·）等人的文章“大肠杆菌K12中L-丝氨酸的降解：直接分离ssd突变体和它们的基因内回复子”中已叙述（刊在细菌学杂志150期710-715页（1982年））。
CU1008菌株中的ssd突变体通过它们能在含L-丝氨酸2毫克/毫升的培养基中生长被分离出来。用常规技术通过P1噬菌体把ssd突变体转导到CU1008met B-受体，选择不依赖蛋氨酸的转导菌株，再筛选出能利用L-丝氨酸生长的那些菌落。把其中一个称作CU1008 ssd的菌株用生长在IK15-5菌株上的P1噬菌体转导。不能在丝氨酸、甘氨酸、亮氨酸上生长及不依赖蛋氨酸的抗氯霉素和氨苄青霉素的菌落已被分离出来了。具有这种表现型又不能利用琥珀酸盐为碳源的菌株被命名为IK/ssd菌株。
按前述方法测定IK/ssd菌株中β-半乳糖酶的活性，其活性比ssd/IK菌株高3倍，但L-丝氨酸脱氨酶活性没有有效的增加。在IK/ssd和IK15-菌株中，L-丝氨酸脱氨酶和β-半乳糖酶活性的比较结果见表Ⅴ。其结果表明了ssd影响位于IK15衍生体的L-丝氨酸脱氨酶结构基因中的β-半乳糖酶顺序转录的增加。
表Ⅴ
IK/ssd菌株 IK15-5菌株
L-丝氨酸脱酶 β-半乳糖甘 L-丝氨酸 β-半乳糖 L-丝氨
诱导条件 酶活性（单位/ 脱氨酶活性 酶活性（单 酸脱氨
毫克蛋白质） （毫单位） 位/毫克蛋 酶活性
白） （毫单
位）
葡萄糖基本培养基 179 1 60 2
加甘氨酸和亮氨酸 225 4 122 9
LB培养基 645 53 225 75
2、影响L-丝氨酸脱氨酶结构基因转录的MEW128菌株调节基因的缺陷：
在MEW128发现的含有几种突变的双突变体和在IK15菌株发现的某种突变的双突变体被用下列方法分离出来：按常规技术，用生长在IK-15菌株的噬菌体P1把CU1008菌株的Mu噬菌体溶源性菌体转导为抗氯霉素和氨苄青霉素的菌株。一株对上述抗生素有抗性的，通过不能在SGL一平板上生长而确定其缺乏L-丝氨酸脱氨酶活性的Mu噬菌体溶源菌株被分离出来，命名为IK15-3。按常规的技术，用生长在IK15-3的噬菌体P1转导MEW128。一株被命名为128/IK15-3的菌株已分离出，它具有抗生素抗性，通过不能在SGL一平板上生长鉴定其缺乏L-丝氨酸脱氨酶活性，它生长时需要硫胺素。
用上述方法在L-丝氨酸脱氨酶诱导条件下测定了128/IK15-3菌株中β-半乳糖苷酶和L-丝氨酸脱氨酶的活性。同样条件下也测定了IK15-3。表Ⅳ中的结果表明来自IK15-3的启动的β-半乳糖酶的转录在携带MEW 128突变的菌株中被抑制，MEW128突变的菌株中被抑制，MEW128突变是发生在调节基因中，因此阻止了L-丝氨酸脱氨酶结构基因的转录。
表Ⅳ
β-半乳糖苷酶 L-丝氨酸脱氨酶活性
L-丝氨酸脱氨酶 活性（单位/毫克蛋白质） （毫单位）
培养条件 IK15-3 128/IK15-3 128/IK15-3
葡萄糖基本培养基 44 不能察觉 2 1
加甘氨酸和亮氨酸 150 不能察觉 13 4
LB培养基 225 不能察觉 75 50
例Ⅴ
用缺乏L-丝氨酸脱氨酶活性的大肠杆菌减少丝氨酸的降解1、缺乏L-丝氨酸脱氨酶活性的丝氨酸和（或）甘氨酸营养缺陷型限制生长时利用丝氨酸的效应：
三个在葡萄糖基本培养基上生长时需要丝氨酸或甘氨酸的营养缺陷型已从CU1008△lac菌株分离出来。其中两个是如例Ⅱ中描述的，用Mudx插入突变方法分离的。营养缺陷型是通过对丝氨酸的需要来筛选。两个被命名为181-34的营养缺陷型是用大肠杆菌的Mal103菌株的溶菌物作为给体从CU1008△lac制造的，它的主要基因是F-，Mudl（APrlac）ara B∶∶MuCts，araD139，△（lac IPOZYA）U169，StrA。这个菌株是从美国纽约州纽约市纽约大学医学院的麦克福尔处得到的。（E·McFall，New York Uni-versity，Schod of Medicine，New York，New York，U·S·A·）181-34菌株是通过对氨苄青霉素有抗性来选择，再通过对丝氨酸需要进一步筛选的。
按常规技术，用生长在DR1，DR4和181-34菌株上的噬菌体P1把MEW 128菌株转导为抗生素抗性的菌株。具有抗性的不能以甘氨酸和亮氨酸为碳源生长的丝氨酸和（或）甘氨酸营养缺陷型的双突变体已被鉴定并命名为128/DR1，128/DR4和128/181-34。
三个营养缺陷型菌株DR1，DR4和181-34以及三个双突变体128/DR1 128/DR4和128/181-34在添加了L-丝氨酸300微克/毫升的葡萄糖含（2毫克/毫升）基本培养基上培养。（这个丝氨酸量予先测定是不能满足丝氨酸营养缺陷型生长的需要的。）少量地接种这六个菌株的培养物在这个培养基上，37℃培养到静止期，摇匀后用比色计测定，每个菌株最后产量用毫克蛋白质/毫升培养液为单位来测量，（劳里法测定Lowrydetermination）。每个菌株也按前述方法测定L-丝氨酸脱氨酶活性。如表Ⅶ所示，在所有情况下丝氨酸（或甘氨酸）缺陷和缺乏L-丝氨酸脱氨酶活性的双突变都比相应的丝氨酸（或甘氨酸）营养缺陷型中产量。
表Ⅶ
菌株 L-丝氨酸脱氨酶活性（毫单位） 产量（微克蛋白质/
毫升培养液）
DR1 90 30
128/DR1 6 38
DR4 未测 31
128/DR4 6 40
181-34 96 27
128/181-34 5 46
2、有限的丝氨酸的利用对在L-丝氨酸脱氨酶诱导条件下大肠杆菌丝氨酸（或甘氨酸）营养缺陷型菌株生长的影响：
丝氨酸（或甘氨酸）营养缺陷型但不缺乏L-丝氨酸脱氨酶活性的181-34菌株在予先测定的该酶诱导条件下用有限的丝氨酸（300微克/毫升培养液）培养，在静止期测量181-34菌株，其产量（以微克蛋白质/毫升培养液）表示在表Ⅶ中。
表Ⅶ
生长条件 产量（微克蛋白质/毫升培养液）
葡萄糖基本培养基+丝氨酸 37
（300微克/毫升），37℃下
葡萄糖基本培养基+丝氨酸
300微克/毫升）+亮氨酸
（50微克/
毫升），37℃ 16
下
葡萄糖基本培养基+丝氨酸（300
微克/毫升） 19
42℃
3、外源丝氨酸浓度的增加对丝氨酸（或甘氨酸）营养缺陷型大肠杆菌产量的影响：
把181-34菌株分几份少量地接种地葡萄糖基本培养基，并在37℃下培养。在培养基中增加外源丝氨酸的浓度，并如前述在静止期测定其产量。为了比较，同样菌株在同样条件下培养，只是有一组增加甘氨酸浓度。其结果在表Ⅸ及图Ⅰ中所示。其菌株最后生长量不是与丝氨酸或甘氨酸的起始浓度成线性关系。然而，在大约高于甘氨酸200微克/毫升时，产量达到平稳状态。但实验用丝氨酸时任何浓度其产量都没达到相应的平稳状态。丝氨酸没有产量平稳状态表明起始丝氨酸即使在高浓度下，依然是限制生长的。说明在产生L-丝氨酸脱氨酶的大肠杆菌生长时，丝氨酸被消耗于限制生长的浓度。
表Ⅸ
181-34菌株
氨基酸的浓度 产量（毫克蛋白质/毫升含 产量（毫克蛋白质/毫
（微克/毫升） 丝氨酸的培养基） 升含甘氨酸培养基）
0 0 0
50 40 140
100 70 192
200 135 250
250 166 260
300 179 280
400 211 250
500 230 260
600 245 260
900 300 280
1000 300 没测
例Ⅷ
利用L-丝氨酸脱氨酶活性缺乏型大肠杆菌建立色氨酸高产菌株1、C534菌株的建立：
B1238菌株是一种大肠杆菌菌株（从美国加利福尼亚州帕洛阿尔托斯坦福大学，坎贝尔实验得到的。）它需要乳糖，生物素和色氨酸（Cal-Bio，TrP。）B1238GB菌株是B1238的转导体，能制造乳糖和生物素的P1噬菌体（Gal+，Bio+，P1）把给体菌株W3110转导到B1238构成的。而菌株A103是一个甲基磺酸乙酯（EMS）突变后选择的B1238GB的抗邻氨基苯甲酸的衍生菌株。菌株C534是用生长在给体C537菌株上的P1噬菌体转导Sal+Tna-（色氨酸阴性）基因到A103菌株而得到的。
2、C534SD菌株的建立
生长在L-丝氨酸脱氨酶阴性的菌株MEW191上面的P1噬菌体可以用来转导C534菌株成为抗氨苄青霉素和抗氯霉素（APr，Cmr）其中一个转导体被称为C534SD。不象C534菌株，C534SD菌株在葡萄糖基本培养基上生长没有L-丝氨酸脱氨酶活性，而且它需要硫胺素。
3、C534和534SD携带质粒的衍生菌株的建立：
质粒PD2643是大肠杆菌中携带与色氨酸合成有关的trpA，trpB trPC，和trPD基因及抗四环素的质粒PBR322的衍生质粒。（见图Ⅱ）这个质粒如前所述可以被引进C534菌株，也可以被引进C534SD菌株。使它们转化为抗四环素（Tcr）菌株。C534（PD2643）和C534SD PD2643）都是具有代表的转化体。
4、通过C534（PD2643）和C534SD（PD2643）菌株把邻氨基苯甲酸发酵成色氨酸：
把这些菌株培养在含20毫升的添加了葡萄糖2.0%，酪蛋白水解产物0.4%（NZ-amine），硫胺素1微克/毫升，四环素20微克/毫升和邻氨基苯甲酸1000微克/毫升的瓦格尔一包纳基本培养基（Vogel-Bonner），置于250毫升的摇瓶中。再放在旋转式摇床上，以280转/分的速度在30℃下震荡培养。
从摇瓶中定时取样，用标定了标准液测定色氨酸和的浓度。C534SD PD2643）中色氨酸产量始终超过C534（PD2643）的产量。