本发明涉及碱性成纤维细胞生长因子（以下简称为bFGF）的突变蛋白，具有编码bFGF突变蛋白之碱基顺序的重组DNA及其应用。 bFGF是一种主要由脑垂体分泌的碱性多肽激素，分子量大约为17，000，它首先是作为对成纤维细胞（例如BALB/c3T3）具有很强的生长促进作用的因子而分离出来的（D.Gospodarowicz;Nature 249;123，1974）。但此后又证明，它几乎对所有产生于中胚层的细胞都具有生长促进作用（D.Gospodarowicz et al，National Cancer Institute Monograph 48：109，1978）。具体地说，bFGF的血管生成作用及其细胞生长促进作用加在一起，表明它能够作为治疗药物用于治疗外伤，以及作为预防和治疗药物用于血栓形成、动脉硬化等的预防和治疗。
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：6507（1985）中已首先对牛bFGF作了描述。在Science 233：545（1986）中公开了牛bFGF的氨基酸组成，该氨基酸顺序是由通过克隆人bFGF的cDNA所产生的克隆推测的。
Biochem.Biophys.Res.Communi.135：541（1986）报道了从人脑中提取人bFGF。
在Euro.Mol.Biol.Org.（EMBO）J.5：2523（1986）和PCT国际专利公开WO/01728中阐明，人bFGF的组成氨基酸，是用牛的bFGF作为探针，通过克隆人bFGF的cDNA所产生的克隆为基础进行推测并鉴定的。
此外，在FEBS Letters 213：189（1987）中，描述了通过培养经克隆人bFGF的cDNA所产生的转化子来生产人bFGF的方法。
将人bFGF与牛bFGF相比较，发现人bFGF在112位是Thr，而牛的是Ser;人bFGF在128位是Ser，而牛的是Pro（在此例中将N末端的Pro定为第一个氨基酸）。
本发明人设想通过修饰氨基酸顺序，能够改善bFGF在细胞中的稳定性、生产力及每个分子地细胞增殖活性，此外，还能加强未知的生物学活性。
再者，由DNA重组技术用微生物生产的生物活性蛋白含有半胱氨酸残基，它们对于活性并不重要，但其可能形成不需要的分子间或分子内桥键。
在由DNA重组技术生产bFGF的过程中，发现在含有高浓度bFGF的大肠杆菌提取物中有不同构象的分子。这些构象可能是由于分子内或分子间随机形成的二硫键而产生的，并因此使得回收时纯化和还原bFGF变得很困难。
鉴于这一事实，本发明人希望对微生物产生的生物活性蛋白（例如重组的bFGF）进行这样的修饰，即在对其活性不产生不利影响的情况下，降低或消除它们形成这种分子间桥键及分子内连接的能力，且不至于形成不期望的三级结构（如降低蛋白活性的构象）。
本发明人通过DNA重组和定位诱变方法构建了业经修饰的bFGF突变蛋白，进行了改善其稳定性、提高其胞内生产力和活性的研究，并描述了其生物活性的变化;其结果是，本发明人发现了符合这些目的的突变蛋白。本发明人在此基础上进行了进一步研究并完成了本发明。
本发明涉及：
（1）碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的一种突变蛋白，
（2）具有编码上述突变蛋白（1）之碱基顺序的重组DNA，
（3）一种携带含重组DNA之载体的转化体，该DNA具有编码上述突变蛋白（1）的碱基顺序，以及
（4）生产上述突变蛋白（1）的方法，其包括在培养基中培养携带含重组DNA之载体的转化体，该DNA具有编码所述突变蛋白的碱基顺序，以在培养基中生产和积聚该突变蛋白。
就bFGF来说，只要它是来自温血哺乳动物，任何bFGF都可包括在其中。
但作为其典型实例，可以提及的有人、牛和鼠的bFGF。
尤其是包括下式代表的氨基酸顺序的多肽：
Phe-Phe-Leu-Arg-Ile-His-Pro-Asp-Gly-Arg-Val-Asp-Gly-Val-Arg-Glu-Lys-Ser-Asp-Pro
更具体地说，优选由下式代表的多肽：
Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Phe-Pro-Pro-Gly-His-Phe-Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu-Tyr-Cys-Lys-Asn-Gly-Gly-Phe-Phe-Leu-Arg-Ile-His-Pro-Asp-Gly-Arg-Val-Asp-Gly-Val-Arg-Glu-Lys-Ser-Asp-Pro-His-Ile-Lys-Leu-Gln-Leu-Gln-Ala-Glu-Glu-Arg-Gly-Val-Val-Ser-Ile-Lys-Gly-Val-Cys-Ala-Asn-Arg-Tyr-Leu-Ala-Met-Lys-Glu-Asp-Gly-Arg-Leu-Leu-Ala-Ser-Lys-Cys-Val-Thr-Asp-Glu-Cys-Phe-Phe-Phe-Glu-Arg-Leu-Glu-Ser-Asn-Asn-Tyr-Asn-Thr-Tyr-Arg-Ser-Arg-Lys-Tyr-X-Ser-Trp-Tyr-Val-Ala-Leu-Lys-Arg-Thr-Gly-Gln-Tyr-Lys-Leu-Gly-Y-Lys-Thr-Gly-Pro-Gly-Gln-Lys-Ala-Ile-Leu-Phe-Leu-Pro-Met-Ser-Ala-Lys-Ser，[Ⅱ]
其中X代表Thr或Ser;如果X是Thr，则Y代表Ser，如果X是Ser，则y代表Pro。
更具体地说，优选含有下述氨基酸顺序的多肽：
Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly-Gly-Ala-Phe-Pro-Pro-Gly-His-Phe-Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu-Tyr-Cys-Lys-Asn-Gly-Gly-Phe-Phe-Leu-Arg-Ile-His-Pro-Asp-Gly-Arg-Val-Asp-Gly-Val-Arg-Glu-Lys-Ser-Asp-Pro-His-Val-Lys-Leu-Gln-Leu-Gln-Ala-Glu-Glu-Arg-Gly-Val-Val-Ser-Ile-Lys-Gly-Val-Cys-Ala-Asn-Arg-Tyr-Leu-Ala-Met-Lys-Glu-Asp-Gly-Arg-Leu-Leu-Ala-Ser-Lys-Cys-Val-Thr-Glu-Glu-Cys-Phe-Phe-Phe-Glu-Arg-Leu-Glu-Ser-Asn-Asn-Tyr-Asn-Thr-Tyr-Arg-Ser-Arg-Lys-Tyr-Ser-Ser-Trp-Tyr-Val-Ala-Leu-Lys-Arg-Thr-Gly-Gln-Tyr-Lys-Leu-Gly-Ser-Lys-Thr-Gly-Pro-Gly-Gln-Lys-Ala-Ile-Leu-Phe-Leu-Pro-Met-Ser-Ala-Lys-Ser
本发明的突变蛋白基本上具有原始肽或蛋白的氨基酸顺序;作为这类变异，可以提及的有氨基酸加入、组成氨基酸的缺失以及组成氨基酸被其他氨基酸的取代。
其中氨基酸加入包括至少一个氨基酸的加入。
所说的组成氨基酸的缺失包括至少一个bFGF组成氨基酸的缺失。
所说的组成氨基酸被其他氨基酸取代包括至少一个bFGF氨基酸由其他氨基酸所取代。
在bFGF中至少加入一个氨基酸所产生的突变蛋白中，至少一个氨基酸不包括由用于肽表达和信号肽的起始密码衍生的蛋氨酸。
所加入氨基酸的数目至少是1，但它可以是任意一个，只要不丧失bFGF的特性就行。优选的氨基酸应包括与bFGF具有同源性并与bFGF有相似活性之蛋白质的某些或所有氨基酸序列。
作为这些被加入氨基酸的实例，可以提及的可包括下述蛋白的部分或所有氨基酸顺序：如酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）、白细胞间素1-α（IL1-α）、白细胞间素1-β（IL1-β）以及由致癌基因中的int-2编码的蛋白质。
这些aFGF包括得自人和得自牛的aFGF。而这些IL1-α和IL1-β则包括得自人的。
这些牛aFGF的氨基酸顺序包括：
NH2-Phe-Asn-Leu-Pro-Leu-Gly-Asn-Tyr-Lys-Lys-Pro-Lys-Leu-Leu-Tyr-Cys-Ser-Asn-Gly-Gly-Tyr-Phe-Leu-Arg-Ile-Leu-Pro-Asp-Gly-Thr-Val-Asp-Gly-Thr-Lys-Asp-Arg-Ser-Asp-Gln-His-Ile-Gln-Leu-Gln-Leu-Cys-Ala-Glu-Ser-Ile-Gly-Glu-Val-Tyr-Ile-Lys-Ser-Thr-Glu-Thr-Gly-Gln-Phe-Leu-Ala-Met-Asp-Thr-Asp-Gly-Leu-Leu-Tyr-Gly-Ser-Gln-Thr-Pro-Asn-Glu-Glu-Cys-Leu-Phe-Leu-Glu-Arg-Leu-Glu-Glu-Asn-His-Tyr-Asn-Thr-Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-His-Ala-Glu-Lys-His-Trp-Phe-Val-Gly-Leu-Lys-Lys-Asn-Gly-Arg-Ser-Lys-Leu-Gly-Pro-Arg-Thr-His-Phe-Gly-Gln-Lys-Ala-Ile-Leu-Phe-Leu-Pro-Leu-Pro-Val-Ser-Ser-Asp-COOH
人IL1-α的氨基酸顺序包括：
NH2-Met-Ala-Lys-Val-Pro-Asp-Met-Phe-Glu-Asp-Leu-Lys-Asn-Cys-Tyr-Ser-Glu-Asn-Glu-Glu-Asp-Ser-Ser-Ser-Ile-Asp-His-Leu-Ser-Leu-Asn-Gln-Lys-Ser-Phe-Tyr-His-Val-Ser-Tyr-Gly-Pro-Leu-His-Glu-Gly-Cys-Met-Asp-Gln-Ser-Val-Ser-Leu-Ser-Ile-Ser-Glu-Thr-Ser-Lys-Thr-Ser-Lys-Leu-Thr-Phe-Lys-Glu-Ser-Met-Val-Val-Val-Ala-Thr-Asn-Gly-Lys-Val-Leu-Lys-Lys-Arg-Arg-Leu-Ser-Leu-Ser-Gln-Ser-Ile-Thr-Asp-Asp-Asp-Leu-Glu-Ala-Ile-Ala-Asn-Asp-Ser-Glu-Glu-Glu-Ile-Ile--
Pro-Arg-Ser-Ala-Pro-Phe-Ser-Phe-Leu-Ser-Asn-Val-Lys-Tyr-Asn-Phe-Met-Arg-Ile-Ile-Lys-Tyr-Glu-Phe-Ile-Leu-Asn-Asp-Ala-Leu-Asn-Gln-Ser-Ile-Ile-Arg-Ala-Asn-Asp-Gln-Tyr-Leu-Thr-Ala-Ala-Ala-Leu-His-Asn-Leu-Asp-Glu-Ala-Val-Lys-Phe-Asp-Met-Gly-Ala-Tyr-Lys-Ser-Ser-Lys-Asp-Asp-Ala-Lys-Ile-Thr-Val-Ile-Leu-Arg-Ile-Ser-Lys-Thr-Gln-Leu-Tyr-Val-Thr-Ala-Gln-Asp-Glu-Asp-Gln-Pro-Val-Leu-Leu-Lys-Glu-Met-Pro-Glu-Ile-Pro-Lys-Thr-Ile-Thr-Gly-Ser-Glu-Thr-Asn-Leu-Leu-Phe-Phe-Trp-Glu-Thr-His-Gly-Thr-Lys-Asn-Tyr-Phe-Thr-Ser-Val-Ala-His-Pro-Asn-Leu-Phe-Ile-Ala-Thr-Lys-Gln-Asp-Tyr-Trp-Val-Cys-Leu-Ala-Gly-Gly-Pro-Pro-Ser-Ile-Thr-Asp-Phe-Gln-Ile-Leu-Glu-Asn-Gln-Ala-COOH
人IL1-β的氨基酸顺序包括：
NH2-Met-Ala-Glu-Val-Pro-Glu-Leu-Ala-Ser-Glu-Met-Met-Ala-Tyr-Tyr-Ser-Gly-Asn-Glu-Asp-Asp-Leu-Phe-Phe-Glu-Ala-Asp-Gly-Pro-Lys-Gln-Met-Lys-Cys-Ser-Phe-Gln-Asp-Leu-Asp-Leu-Cys-Pro-Leu-Asp-Gly-Gly-Ile-Gln-Leu-Arg-Ile-Ser-Asp-His-His-Tyr-Ser-Lys-Gly-Phe-Arg-Gln-Ala-Ala-Ser-Val-Val-Val-Ala-Met-Asp-Lys-Leu-Arg-Lys-Met-Leu-Val-Pro-Cys-Pro-Gln-Thr-Phe-Gln-Glu-Asn-Asp-Leu-Ser-Thr-Phe-Phe-Pro-Phe-Ile-Phe-Glu-Glu-Glu-Pro-Ile-Phe-Phe-Asp-Thr-Trp-Asp-Asn-Glu-Ala-Tyr-Val-His-Asp-Ala-Pro-Val-Arg-Ser-Leu-Asn-Cys-Thr-Leu-Arg-Asp-Ser-Gln-Gln-Lys-Ser-Leu-Val-Met-Ser-Gly-Pro-Tyr-Glu-Leu-Lys-Ala-Leu-His-Leu-Gln-Gly-Gln-Asp-Met-Glu-Gln-Gln-Val-Val-Phe-Ser-Met-Ser-Phe-Val-Gln-Gly-Glu-Glu-Ser-Asn-Asp-Lys-Ile-Pro-Val-Ala-Leu-Gly-Leu-Lys-Glu-Lys-Asn-Leu-Tyr-Leu-Ser-Cys-Val-Leu-Lys-Asp-Asp-Lys-Pro-Thr-Leu-Gln-Leu-Glu-Ser-Val-Asp-Pro-Lys-Asn-Tyr-Pro-Lys-Lys-Lys-Met-Glu-Lys-Arg-Phe-Val-Phe-Asn-Lys-Ile-Glu-Ile-Asn-Asn-Lys-Leu-Glu-Phe-Glu-Ser-Ala-Gln-Phe-Pro-Asn-Trp-Tyr-
Ile-Ser-Thr-Ser-Gln-Ala-Glu-Asn-Met-Pro-Val-Phe-Leu-Gly-Gly-Thr-Lys-Gly-Gly-Gln-Asp-Ile-Thr-Asp-Phe-Thr-Met-Gln-Phe-Val-Ser-Ser-COOH
由int-2编码的氨基酸顺序包括：
NH2-Met-Gly-Leu-Ile-Trp-Leu-Leu-Leu-Leu-Ser-Leu-Leu-Glu-Pro-Ser-Trp-Pro-Thr-Thr-Gly-Pro-Gly-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Asp-Ala-Gly-Gly-Arg-Gly-Gly-Val-Tyr-Glu-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Pro-Arg-Arg-Arg-Lys-Leu-Tyr-Cys-Ala-Thr-Lys-Tyr-His-Leu-Gln-Leu-His-Pro-Ser-Gly-Arg-Val-Asn-Gly-Ser-Leu-Glu-Asn-Ser-Ala-Tyr-Ser-Ile-Leu-Glu-Ile-Thr-Ala-Val-Glu-Val-Gly-Val-Val-Ala-Ile-Lys-Gly-Leu-Phe-Ser-Gly-Arg-Tyr-Leu-Ala-Met-Asn-Lys-Arg-Gly-Arg-Leu-Tyr-Ala-Ser-Asp-His-Tyr-Asn-Ala-Glu-Cys-Glu-Phe-Val-Glu-Arg-Ile-His-Glu-Leu-Gly-Tyr-Asn-Thr-Tyr-Ala-Ser-Arg-Leu-Tyr-Arg-Thr-Gly-Ser-Ser-Gly-Pro-Gly-Ala-Gln-Arg-Gln-Pro-Gly-Ala-Gln-Arg-Pro-Trp-Tyr-Val-Ser-Val-Asn-Gly-Lys-Gly-Arg-Pro-Arg-Arg-Gly-Phe-Lys-Thr-Arg-Arg-Thr-Gln-Lys-Ser-Ser-Leu-Phe-Leu-Pro-Arg-Val-Leu-Gly-His-Lys-Asp-His-Glu-Met-Val-Arg-Leu-Leu-Gln-Ser-Ser-Gln-Pro-Arg-Ala-Pro-Gly-Glu-Gly-Ser-Gln-Pro-Arg-Gln-Arg-Arg-Gln-Lys-Lys-Gln-Ser-Pro-Gly-Asp-His-Gly-Lys-Met-Glu-Thr-Leu-Ser-Thr-Arg-Ala-Thr-Pro-Ser-Thr-Gln-Leu-His-Thr-Gly-Gly-Leu-Ala-Val-Ala-COOH
就至少缺失一个bFGF组成氨基酸的本发明之突变蛋白的缺失的bFGF结构氨基酸来说，所缺失的氨基酸数目可以是任何一个，条件是不至于丧失bFGF的任何特性。
作为这种缺失的组成氨基酸的实例，可以提及的有：
氨基末端或羧基末端氨基酸的缺失;
人bFGF氨基末端的10个残基：
Met-Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser
人bFGF氨基末端的14个残基：
Met-Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Phe-Pro
人bFGF氨基末端的41个残基：
1 2 3 4 41
Met-Pro-Ala-Leu-…-Val
或人bFGF羧基端的61个残基：
87 88 146 147
Lys-Cys-…-Lys-Ser
的缺失。
在至少一个bFGF的组成氨基酸由其他氨基酸置换的突变蛋白中，其置换前的至少一个bFGF组成氨基酸的数目可以是任意一个，只要不丧失bFGF的任何特性就行。
作为置换前的组成氨基酸的实例，可以提及的有半胱氨酸和半胱氨酸以外的氨基酸。优选半胱氨酸。至于置换前的半胱氨酸以外的组成氨基酸，可以提及的有门冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸等。
如果置换前的组成氨基酸是半胱氨酸，则置换氨基酸可优选（例如）中性氨基酸。作为这种中性氨基酸的具体实例，可以提及的有甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸和蛋氨酸。特别是优选丝氨酸和苏氨酸。
如果置换前的组成氨基酸是半胱氨酸以外的任何氨基酸，则其他的置换氨基酸是与置换前的氨基酸有不同性质（如亲水性、疏水性或电荷等）的选择的氨基酸。
如果置换前的组成氨基酸是门冬氨酸，则置换氨基酸包括门冬酰胺、苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和精氨酸;优选门冬酰胺和精氨酸。
如果置换前的组成氨基酸是精氨酸，则置换氨基酸包括谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和门冬氨酸;优选谷氨酰胺。
如果置换前的组成氨基酸是甘氨酸，则置换氨基酸包括苏氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、谷氨酸和精氨酸;优选苏氨酸。
如果置换前的组成氨基酸是丝氨酸，则置换氨基酸包括蛋氨酸、丙氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和门冬氨酸;优选蛋氨酸。
如果置换前的组成氨基酸是缬氨酸，则置换氨基酸包括丝氨酸、亮氨酸、脯氨酸、甘氨酸、赖氨酸和门冬氨酸;优选丝氨酸。
作为置换前的组成氨基酸，优选门冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸和缬氨酸。
作为置换氨基酸，优选门冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、丝氨酸和亮氨酸。
作为突变蛋白中置换的优选方案，最好是由丝氨酸置换半胱氨酸（即半胱氨酸被丝氨酸取代）。
在所述的置换中，可以发生不小于2个氨基酸的置换，最好有2-3个氨基酸的置换。
本发明的突变蛋白可以是2个或3个上述氨基酸加入、缺失和置换过程的结合。
除了常规的DNA重组技术外，还使用定位诱变来产生本发明的突变蛋白。所述技术是众所周知的，（参见Genetic Engineering，Lather，R.F.和Lecoq，J.P.，Academic Press，31-50，1983）。寡核苷酸定位诱变技术参见Genetic Engineering：Principles and Methods，Smith，M.和Gillam，S.，Plenum Press Vol.3：1-32，1981。
例如，可按下述步骤生产编码本发明突变蛋白的结构基因：
（a）用突变的寡核苷酸引物与含有bFGF结构基因之一条链的单链DNA杂交，
（b）使用DNA聚合酶延长引物，以形成突变的杂交双链，以及
（c）使此突变的杂交双链复制。
寡核苷酸引物的大小根据引物与将导入突变的基因区进行稳定杂交的基本条件而定，以及根据目前所用的寡核苷酸合成方法的限制而定。Smith，M.和Gillam，S.（见上述文献）描述了用寡核苷酸进行定位诱变时设计寡核苷酸所需考虑的因素（例如核苷酸的总大小及突变位点错配部分的大小）。一般说来，应将寡核苷酸的总长度调整到这样的长度，即它可在突变位点最佳地进行稳定和唯一的杂交，并使突变位点与5′-和3′-端之间的延伸达到足够的大小，以防止由于DNA聚合酶的核酸外切酶活性对突变造成删除。
本发明用于诱变的寡核苷酸一般含有大约12-44个碱基，优选14-20碱基，更好是14-18碱基。它们通常在有待改变的密码子的3′-端至少包含大约3个碱基。
例如，为了得到具有一个被加入之氨基酸的突变蛋白，可通过如下方法产生诱变的bFGF基因：合成编码待加入的氨基酸顺序的基因，直接地或在经限制性酶消化之后，使用DNA连接酶使之插入或加入bFGF基因的一个合适位点中。如果在bFGF基因中没有任何合适的限制性酶识别位点，则可通过上述定位诱变的方法产生限制性酶识别位点。
又如，为了得到缺失bFGF组成氨基酸的突变蛋白，可用3种不同方法产生诱变的bFGF基因。其中一种方法是使bFGF的氨基端缺失;另一方法是使bFGF的中央区缺失;再一种方法是使羧基末端缺失。
在氨基末端缺失的情况下，使基因中编码该将被删除的氨基酸顺序之羧基末端的密码子通过定位诱变改变为编码Met的密码子ATG，并且，在该密码子的5′-端产生一个合适的限制性酶识别位点，以有利于它与启动子连接。
在使氨基酸顺序的中央区缺失的情况下，在编码待缺失顺序之基因的5′-端和3′-端两侧通过定位诱变产生一个唯一的限制性酶识别位点，并通过酶促消化从该基因中切掉相关基因，然后使剩下的两个基因片段再连接，以构建成编码缺乏特定氨基酸的bFGF的预期基因。当然，不能由于限制性酶消化而使读码位移。
在产生羧基末端氨基酸顺序缺失的情况下，可使基因中编码该缺失顺序氨基末端氨基酸的密码通过定位诱变变成终止密码子。
为了得到其中已有组成氨基酸半胱氨酸被取代的突变蛋白，可通过下述方法产生诱变的bFGF基因，例如，去掉表达Cys的密码或用一个合成的核苷酸引物使表达Cys的密码TGC或TGT发生定位诱变，以使之变成一个编码不同氨基酸的密码子。例如，使一引物与FGF基因的有意义链杂交，以使人bFGF的半胱氨酸（26位）变成丝氨酸。作为一种合适的核苷酸引物，可以提及的例子有5′-CGTTCTTGCTGTAGAGCCGCT-3′，其中，横线标出的三联体代表改变了的密码子。
作为将半胱氨酸（70位）变为丝氨酸的合适引物，可以提及的有5′-AACGATTAGCGCTCACTC-3′，其中，横线标出的三联体代表改变了的密码子。
作为将半胱氨酸（88位）变为丝氨酸的合适引物，可以提及的有5′-GTAACAGACTTAGAAGCTAGT-3′，其中，横线标出的三联体代表改变了的密码子。
作为将半胱氨酸（93位）变为丝氨酸的合适引物，可以提及的有5′-TCGAAGAAGAAAGACTCATCC-3′，其中，横线标出的三联体代表改变了的密码子。
对于26位的Cys，通过第1碱基的T→A转位使Cys变为Ser;对于70位的Cys，通过第1碱基的T→A转位和第2碱基的T→C转位使Cys变为Ser;对于88位和93位的Cys，通过第2碱基的G→C转位使Cys变为Ser。
应当注意，在通过定位诱变产生bFGF突变蛋白时，在DNA顺序中诱导产生2个或更多处变异，就是说，相应于这些氨基酸的DNA密码子被简并化了。
为了得到半胱氨酸以外的组成氨基酸由其他氨基酸置换了的变异蛋白，可用与置换半胱氨酸相同的方法，通过用寡核苷酸引物改变密码子而产生诱变的bFGF基因。
当然，寡核苷酸引物的设计随着要改变的氨基酸而异。
使引物与通过克隆bFGF基因的单链而产生的单链噬菌体如M13（Yanish-Perror，C.Vieira and J.Messing，Gene 33：103-119，1985;Messing，J.，Methods in Enzymology 101：20-78，1983）、fd（R.herrman et al.，Mol.and Gene.Genet.177：231，1980）或φ×174（M.Smith and S.Gillam，Genetic Engineering，Plenum Press，Vol.3：1-32，1981）杂交。注意到噬菌体能够携带该基因的有意义链或反义链。如果噬菌体携带反义链，则除了与编码其他氨基酸的三联体相关密码子有所不同以外，由于密码子简并性，引物亦可能与含有将被诱导产生突变之密码子的有意义链区域有所差异。与此相似，如果噬菌体携带有意义链，引物可能不与有意义链中含有将被诱导突变的密码子的区域互补，而且与将被删除的密码子配对的三联体有适当差异。M.Smith和S.Gillam描述了杂交所用的条件（出处同上）。温度通常为0℃和37℃之间，大多是在10℃和50℃之间。杂交以后，用大肠杆菌DNA聚合酶1，T4DNA聚合酶，逆转录酶或其他合适的DNA聚合酶使噬菌体DNA上的引物延长。用DNA连接酶如T4DNA连接酶处理，使所产生的双链DNA变为闭合的环状双链DNA。DNA分子中含有单链的区域可被S1核酸内切酶分解。
用产生的突变杂交双链转化可感染的宿主微生物或细胞。由宿主复制杂交双链时，两条链均产生子代。复制以后，从突变链的子代中分离突变基因，插入合适的载体中，然后用它转化合适的宿主微生物或细胞。
然后分离携带突变基因的噬菌体DNA，将其掺入质粒中。
作为DNA掺入其中的质粒实例，可以提及的有来自大肠杆菌的质粒如pBR322（Gene 2：95，1977），pBR325（Gene 4：121，1978）、pUC12（Gene 19：259，1982）和pUC13（Gene 19：259，1982）;以及来自枯草杆菌的质粒如pUB110（Biochem，Biophys.Res.Communi.112：678，1983）;但也可使用任何其他质粒，只要它能在宿主中复制和保留即可使用。
关于掺入质粒的方法，可以提及的有例如T.Maniatis等人所述的方法（Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，P239，1982）等。
将克隆的基因连接在一个用于表达的合适的运载工具（载体）之启动子的下游，从而得到一个表达载体。
载体包括上述得自大肠杆菌的质粒（如pBR322、pBR325、pUC12和pUC13）、得自枯草杆菌的质粒（如pUB110、pTP5和pC194）、得自酵母的质粒（如pSH19和pSH15）、噬菌体如入噬菌体以及动物病毒如还原病毒和牛痘病毒。
所述基因的5′-端可以有ATG作为翻译起始密码，其3′-端也可以有TAA、TGA或TAG作为翻译终止密码。为了表达所述基因，将一个启动子连接在它的上游。任何启动子只要它与用于基因表达的宿主相适应，均可用于本发明。
如果转化宿主是埃希氏杆菌属（Escheriechia）的细菌，则适用的启动子有trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子等;如果宿主是芽孢杆菌属（Bacillus）的细菌，则适用的启动子有SP101启动子、SP02启动子、penP启动子等;如果宿主是酵母，则适用的启动子有PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等。具体地说，本发明所用宿主最好是埃希氏杆菌属，启动子则最好是trp启动子或λPL启动子。
如果宿主是动物细胞，合适的启动子则包括来自SV40的启动子和还原病毒启动子;特别是优选来自SV40的启动子。
使用如此构建的载体-其包含具有变异蛋白编码之碱基顺序的重组DNA-以产生转化体。
作为宿主，可以提及的有埃希氏杆菌属的细菌、芽孢杆菌属的细菌、酵母及动物细胞等。
作为埃希氏杆菌属细菌的实例，可以提及的有大肠杆菌K12 DH1（Proc.Natl.Acad.Sci.USA60：160，1968），JM103（Nucleic AcidsRes.9：309，1981），JA221（J.Mol Biol 120：517，1978），HB101（J.Mol Biol 41：459，1969），C600（Genetics 39：440，1954）和MM294（Proc.Natl.Acad.Sci.USA73：4174，1976）。
作为杆菌属细菌的实例，可以提及的有枯草杆菌MI114（Gene 24：255，1983）和207-21（J.Biochem.95：87，1984）。
作为所述酵母的实例，可以提及的有啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）AH22R-、NA87-11A和DKD-5D。
作为动物细胞的实例，可以提及的有猿猴细胞COS-7、Vero、中国仓鼠卵巢细胞CHO、小鼠L-细胞和人FL-细胞。
上述埃希氏杆菌属细菌的转化是根据例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：2110，1972;Gene 17：107，1982等中所述的方法进行的。
杆菌属细菌的转化是根据例如Molecular and General Genetics 168：111，1979等所述的方法进行的。
酵母的转化是根据例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：1929，1978中所述的方法进行的。
动物细胞的转化是根据例如Virology 52：456，1973中所述的方法进行的。
这样便得到一个携有载体的转化体，该载体包含具有突变蛋白编码顺序的重组DNA。
在培养基中培养所述转化体，使其生产突变蛋白。
在培养宿主为埃希氏杆菌或芽孢杆菌属细菌的转化体时，适于使用液体培养基，其中含有碳源、氮源、矿物质和其他对所述转化体生长攸关重要的物质。作为碳源，可以提及的有葡萄糖、糊精、可溶淀粉、蔗糖等;作为氮源，可以提及的有无机或有机物质，如铵盐、硝酸盐、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉糜、大豆饼和土豆浆等;作为矿物质，可以提及的有氯化钙、磷酸二氢钠和氯化镁等。还可加入酵母提取物、维生素、生长促进因子等。
培养基的pH最好是大约6至8。
作为培养埃希氏杆菌属细菌的合适培养基的实例，可以提及的有含有葡萄糖和酪蛋白氨基酸的M9培养基（Miller，J.Exp.Mol.Genet.，431-433，Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1972）。如果有必要提高启动子效率，还可以向其中加入化学物质如3β-吲哚丙烯酸。
如果宿主是埃希氏杆菌属的细菌，培养通常在大约15-43℃进行大约3-24小时，必要时可进行通气和/或搅拌。
如果宿主是杆菌属的细菌，培养通常在大约30-40℃下进行6-24小时，必要时可进行通气和/或搅拌。
作为培养宿主为酵母的转化体的培养基，可以提及的有例如Burkholder氏基本培养基（Bostian，K.L.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4505，1980）。培养基的pH最好调至大约5-8。培养过程通常在大约20-35℃进行24-72小时，必要时可进行通气和/或搅拌。
作为培养宿主为动物细胞的转化体的培养基，可以提及的有含有大约5-20%小牛血清的MEM培养基（Science 122：501，1952），DMEM培养基（Virology 8：396，1956），RPMI1640培养基（J.Amer.Med.Associ.199：519，1967）和199培养基（Proc.Soc.Biol.Med.73：1，1950）。pH最好是大约6-8。培养通常在大约30-40℃进行15-60小时，必要时可进行通气和/或搅拌。
例如可以通过下述方法，从上述培养基中分离和纯化突变蛋白。
从培养的细菌、真菌或动物细胞中提取突变蛋白时，可以使用的合适方法，如可在培养细菌、真菌或动物细胞后，通过已知方法进行收集，并悬浮在含有蛋白变性剂（例如盐酸胍）的缓冲液中，以从细胞中洗脱出所需蛋白，以及通过French挤压法超声处理、溶菌酶处理和/或冻融处理等方法使细菌、真菌或动物细胞解离，然后进行离心以得到突变蛋白。具体地说，最好选用将溶菌酶处理与超声处理结合使用的方法。
由如此得到的上清液中纯化突变蛋白，可通过结合使用众所周知的合适的分离纯化方法来完成。作为公知的分离纯化方法的实例，可以提及的有以溶解度为基础的方法如盐析和溶剂沉淀;主要以分子量差别为基础的方法如透析、超滤、凝胶过滤和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳;以电荷差异为基础的方法如离子交换层析;以专一亲和性为基础的方法例如亲和层析;以疏水性差异为基础的方法如逆向高效液相层析;以及以等电点差异为基础的方法如等电聚焦电泳等。
更具体地说，可使用DEAE纤维素等作为载体，对上述上清液进行离子交换层析以去掉核酸和酸性蛋白等杂质。例如，可以使上清液通过DEAE纤维素柱（该柱用近于中性的缓冲液如Tris平衡），并收集未被柱吸附的组分。用CM纤维素或其类似物作为载体，使收集到的组分进一步进行离子交换层析，有可能使突变蛋白吸附在载体上，并用盐溶液洗脱突变蛋白。洗脱物经透析后可以冰冻干燥。
肝素-Sepharose的亲和层析能够应用于纯化提取物中的bFGF突变蛋白。因此，bFGF突变蛋白可以按下述方法纯化：将上述洗脱物加到已用一种近于中性的缓冲液（如Tris或磷酸缓冲液）平衡过的肝素-Sepharose柱上，充分洗涤柱子，用NaCl或其类似物建立线性浓度梯度进行洗脱。
使用肝素柱（如Shodex AF-pak HR-894，可从日本Showa Denko公司得到）进行高效液相层析是特别有效的。
在此例中，与上述使用肝素-Sepharose柱的情况一样，能够以同样方式作为均一产品回收到bFGF突变蛋白，即将样品加到用近于中性的缓冲液平衡过的肝素柱上，充分洗涤柱子，然后用例如NaCl线性浓度梯度进行洗脱。
这样得到的产品能够通过透析和冷冻干燥制成干粉。保存此产品时最好加入一种载体（如血清白蛋白），这样可防止产品吸附在容器壁上。
再者，在纯化或保存的过程中，最好加入少量还原剂，以防止产品的氧化。
作为还原剂的实例，有β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、谷胱甘肽等。
通过这种方法，能够得到基本上纯的bFGF突变蛋白。本发明的基本上纯的bFGF突变蛋白包括这样的产品：其bFGF突变蛋白的含量不少于95%（W/W），更好是其bFGF突变蛋白的含量不少于98%（W/W）。
这样得到的突变蛋白具有成纤维细胞生长促进活性、毛细血管内皮细胞生长促进活性和血管生成活性，具有很高的稳定性和很低的毒性;因此，它可作为痊愈促进因子用于灼伤、创伤、术后组织等，或根据其血管形成作用作为治疗药物用于血栓形成、动脉硬化等。它还可作为加速细胞培养过程的试剂使用。
特别优选的是其中至少有一个组成半胱氨酸被丝氨酸取代的突变蛋白，因为该突变蛋白非常稳定。
本发明的突变蛋白作为药物使用时，可以直接以粉剂形式或与其他医药上可接受的载体、赋形剂或稀释剂等制备成药物组合物（如注射液、片剂、胶囊、溶液和膏剂）后，安全地经肠胃外给药或口服给予温血动物（如人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔子、狗和猫等）。
可依据常规方法制备注射液，例如，可使用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅助剂的水溶液。片剂和胶囊等药物组合物也能按照常规方法制备。
本发明的突变蛋白以上述任一种药物形式使用时，考虑到给药途径及症状等以后，对上述温血动物的合适的给药剂量范围可在每天大约1ng/Kg-100μg/Kg之间。
本发明的突变蛋白作为加速细胞培养过程的试剂使用时，最好是加入培养基中以使其中的含量为大约0.01-10μg/L培养基，更好是大约0.1-10μg/L培养基。
本说明书和附图所用碱基、氨基酸等的缩写，是以IUPAC-IUB生化命名委员会指定的缩写或相关领域内的常用缩写为根据，其例子列举如下。如果在氨基酸中有可能存在光学异构体，则除非特别指出，该异构体是指L-型。
DNA：脱氧核糖核酸
cDNA：互补脱氧核糖核酸
A：腺嘌呤
T：胸腺嘧啶
G：鸟嘌呤
C：胞嘧啶
RNA：核糖核酸
dATP：脱氧腺苷三磷酸
dTTP：脱氧胸苷三磷酸
dGTP：脱氧鸟苷三磷酸
dCTP：脱氧胞苷三磷酸
ATP：腺苷三磷酸
Tdr：胸苷
EDTA：乙二胺四乙酸
SDS：十二烷基磺酸钠
Gly：甘氨酸
Ala：丙氨酸
Val：缬氨酸
Leu：亮氨酸
Ile：异亮氨酸
Ser：丝氨酸
Thr：苏氨酸
Cys：半胱氨酸
Met：蛋氨酸
Glu：谷氨酸
Asp：门冬氨酸
Lys：赖氨酸
Arg：精氨酸
His：组氨酸
Phe：苯丙氨酸
Tyr：酪氨酸
Trp：色氨酸
Pro：脯氨酸
Asn：门冬酰胺
Gln：谷氨酰胺
本发明的说明书和附图中，对人bFGF的组成氨基酸进行序列编号时，除非特别指出，总是将产生于翻译起始密码子的Met确定为第一个氨基酸。
在下述参考实施例或实施例中产生的下列转化体，以表1所示的寄存号和寄存日期（寄存日期在括号中标明）寄存于日本大阪发酵研究所（IFO）及日本国际工商部工业科技署的发酵研究所（FRI）。在FRI的寄存号中，FERM BP号是指根据布达佩斯条约的寄存号;在FERM P号和FERM BP号都有的情况下，是表明FERM P号下的寄存品已改为根据布达佩斯条约的寄存，且这些转化体已按FERM BP号保存在FRI。
按下述实施例35（3）（d）的方法产生的下列杂交瘤已于1987年8月17日以下面指出的寄存号寄存于IFO。
小鼠HbF52细胞：IFO50143
小鼠HbF78细胞：IFO50144
对附图的简要说明
图1显示编码人bFGF的碱基顺序及推测的氨基酸顺序。
图2显示用于使Cys密码子突变为Ser密码子的合成的寡聚引物。
图3显示由实施例2所得质粒pTB739携带的编码人bFGF突变蛋白CS1的碱基顺序，及由其编码的人bFGF突变蛋白CS1的氨基酸顺序。突变碱基用短线标出，含有已转化之氨基酸的区域用方框标出。
图4显示由实施例3所得质粒pTB742携带的编码人bFGF突变蛋白CS2的碱基顺序，及由其编码的人bFGF突变蛋白CS2的氨基酸顺序。突变碱基用短线标出，含有转化氨基酸的区域用方框标出。
图5显示由实施例4所得质粒pTB743携带的编码人bFGF突变蛋白CS3的碱基顺序，及由其编码的人bFGF突变蛋白CS3的氨基酸顺序。突变碱基用短线标出，含有转化氨基酸的区域用方框标出。
图6显示由实施例5所得质粒pTB744携带的编码人bFGF突变蛋白CS4的碱基顺序，及由其编码的人bFGF突变蛋白CS4的氨基酸顺序。突变碱基用短线标出，含有转化氨基酸的区域用方框标出。
图7显示实施例2（1）中质粒pTB739的构建方案。
图8显示实施例3（1）中质粒pTB742的构建方案。
图9显示实施例4（1）中质粒pTB743的构建方案。
图10显示实施例5（1）中质粒pTB744的构建方案。
图11显示由实例7所得质粒pTB762携带的编码人bFGF突变蛋白CS23的碱基顺序，及由其编码的人bFGF突变蛋白CS23的氨基酸顺序。突变碱基用短线标出，含有任一个转化氨基酸的区域用方框标出。
图12显示实施例7（1）中质粒pTB762的构建方案。
图13显示由实施例9所得质粒pTB764携带的编码人bFGF突变蛋白CS123的碱基顺序，及由其编码的人bFGF突变蛋白CS123的氨基酸顺序。突变碱基用短线标出，含有所有转化氨基酸的区域用方框标出。
图14显示实施例9（1）中的质粒pTB764的构建方案。
图15显示由实施例11所得质粒pTB765携带的编码人bFGF突变蛋白CS1234的碱基顺序，及由其编码的人bFGF突变蛋白CS1234的氨基酸顺序。突变碱基用短线标出，含有所有转化氨基酸的区域用方框标出。
图16显示实施例11（1）中质粒pTB765的构建方案。
图17显示由实施例15所得质粒pTB776携带的编码人bFGF突变蛋白CS12的碱基顺序，及由其编码的人bFGF突变蛋白CS12的氨基酸顺序。突变碱基用短线标出，含有任一个转化氨基酸的区域用方框标出。
图18显示实施例15（1）中质粒pTB776的构建方案。
图19显示由实施例16所得质粒pTB778携带的编码人bFGF突变蛋白CS24的碱基顺序，及由其编码的人bFGF突变蛋白CS24的氨基酸顺序。突变碱基用短线标出，含有任一转化氨基酸的区域用方框标出。
图20显示实施例16（1）中质粒pTB778的构建方案。
图21显示由实施例17所得质粒pTB779携带的编码人bFGF突变蛋白CS13的碱基顺序，及由其编码的人bFGF突变蛋白CS13的氨基酸顺序。突变碱基用短线标出，含有任一个转化氨基酸的区域用方框标出。
图22显示实施例17（1）中质粒pTB779的构建方案。
图23显示由实施例18所得质粒pTB763携带的编码人bFGF突变蛋白CS14的碱基顺序，及由其编码的人bFGF突变蛋白CS14的氨基酸顺序。突变碱基用短线标出，含有任一个转化氨基酸的区域用方框标出。
图24显示实施例18（1）中质粒pTB763的构建方案。
图25显示由实施例19所得质粒pTB777携带的编码人bFGF突变蛋白CS34的碱基顺序，及由其编码的人bFGF突变蛋白CS34的氨基酸顺序。突变碱基用短线标出，含有任一个转化氨基酸的区域用方框标出。
图26显示实施例19（1）中质粒pTB777的构建方案。
图27显示由实施例20所得质粒pTB782携带的编码人bFGF突变蛋白CS234的碱基顺序，及由其编码的人bFGF突变蛋白CS234的氨基酸顺序。突变碱基用短线标出，含有所有转化氨基酸的区域用方框标出。
图28显示实施例16（1）中质粒pTB782的构建方案。
图29显示由实施例21所得质粒pTB780携带的编码人bFGF突变蛋白CS124的碱基顺序，及由其编码的人bFGF突变蛋白CS124的氨基酸顺序。突变碱基用短线标出，含有所有转化氨基酸的区域用方框标出。
图30显示实施例21（1）中质粒pTB780的构建方案。
图31显示由实施例22所得质粒pTB781携带的编码人bFGF突变蛋白CS134的碱基顺序，及由其编码的人bFGF突变蛋白CS134的氨基酸顺序。突变碱基用短线标出，含有所有转化氨基酸的区域用方框标出。
图32显示实施例22（1）中质粒pTB781的构建方案。
图33-35显示实施例24所得突变蛋白的高效液相层析洗脱曲线。
图36显示实施例25所得突变蛋白氧化物的高效液相层析洗脱曲线。
图37显示实施例26所得突变蛋白还原产物的高效液相层析洗脱曲线。
图38显示作为制备编码突变蛋白之DNA引物使用的合成寡聚体。
图39显示实施例27所得噬菌体M13-PN10的碱基顺序，及由其编码的突变蛋白TM910的氨基酸顺序，突变蛋白TM910得自实施例32。
图40显示实施例27所得噬菌体M13-PN14的碱基顺序，及由其编码的突变蛋白N14的氨基酸顺序，突变蛋白N14得自实施例34。
图41显示实施例27所得噬菌体M13-PC86的碱基顺序，及由其编码的突变蛋白C86的氨基酸顺序，突变蛋白C86得自实施例35。
图42显示实施例27所得噬菌体M13-PDN42的碱基顺序，及由其编码的突变蛋白DN42的氨基酸顺序，突变蛋白DN42得自实施例36。
图43显示实施例27所得噬菌体M13-PRQ45的碱基顺序，及由其编码的突变蛋白RQ45的氨基酸顺序，突变蛋白RQ45得自实施例37。
图44显示实施例28所得噬菌体M13-PNR42的碱基顺序，及由其编码的突变蛋白NR42的氨基酸顺序，突变蛋白NR42得自实施例38。
图45显示实施例29所得人bFGF突变蛋白CS2、CS3和CS23的稳定性。
图46显示实施例32中质粒pTB854的构建方案。
图47显示实施例33中质粒pTB852的构建方案。
图48显示由实施例33所得质粒pTB852携带的编码人bFGF突变蛋白N10的碱基顺序，及由其编码的人bFGF突变蛋白N10的氨基酸顺序，突变蛋白N10得自实施例33。突变碱基用短线标出。
图49显示实施例34中质粒pTB795的构建方案。
图50显示实施例35中质粒pTB796的构建方案。
图51显示实施例36中质粒pTB797的构建方案。
图52显示实施例37中质粒pTB799的构建方案。
图53显示实施例38中质粒pTB798的构建方案。
图54显示由实施例39所得质粒pTB853携带的编码人bFGF突变蛋白FINT的碱基顺序，及由其编码的人bFGF突变蛋白FINT的氨基酸顺序，突变蛋白FINT得自实施例39。突变碱基用短线示出。
图55显示实施例39中质粒pTB853的构建方案。
图56显示实施例40中质粒pTB855的构建方案。
图57显示由实施例40所得质粒pTB855携带的编码人bFGF突变蛋白N41的碱基顺序，及由其编码的人bFGF突变蛋白N41的氨基酸顺序，突变蛋白N41得自实施例40。突变碱基用短线标出。
图58显示实施例41中质粒pTB856的构建方案。
图59显示由实施例41所得质粒pTB856携带的编码人bFGF突变蛋白C129的碱基顺序，及由其编码的人bFGF突变蛋白C129的氨基酸顺序，突变蛋白C129得自实施例41。突变碱基用短线标出。
图60显示实施例42中质粒pTB831的构建方案。
参考实施例1 构建含有编码人bFGF基因的质粒
（1）含有cDNA质粒的分离：
宿主为大肠杆菌X1776的cDNA由Okayam博士（National Institute of Child Health and Human Developmemt，Bethesda，USA）提供，它是通过将得自人包皮原初培养细胞的mRNA掺入pCD载体中制备的（参见Okayama et al，Mol.Cell Biol.3：280，1983）。通过碱法（Birnboim，H.C.and Doly，J，Nucleic Acids Res.1：1513，1979）从此DNA中提取质粒DNA，并用该DNA感染大肠杆菌DH1，以产生其宿主是大肠杆菌DH1的大约2×106个克隆的cDNA文库。
利用大肠杆菌DH1，将所述cDNA文库铺在10个硝化纤维素滤膜上（Millipore Inc，USA，HATF滤膜），数量为大约5×104克隆/滤膜，然后，利用上述10个滤膜作为“主滤膜”，制备总共20个成对的复制滤膜。用0.5N NaOH溶液溶解复制滤膜上的大肠杆菌细胞，使暴露出来的变性质粒DNA固定在滤膜上（Grunstein，M.and Hogness，D.S.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72：3961，1975）。
另外，以13-20号氨基酸（Pro-Pro-Gly-His-Phe-Lys-Asp-Pro）和89-96号氨基酸（Thr-Asp-Glu-Cys-Phe-Phe-Phe-Glu）（根据F.Esch等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：6507，1985中所报道的牛碱性成纤维细胞生长因子的氨基酸顺序）为基础，化学合成相应于这些氨基酸顺序的碱基顺序（对于某些密码子，第3个字母可任意确定。分别为S′GGA/GTCT/CTTA/GAAA/GTGGCCAGGAGG和S′TCA/GAAA/GAAA/GAAA/GCAT/CTCGTCGGT。线条标出的字母代表确定的碱基）。对于这两种寡核苷酸，使之在5 50μl反应液中用T4多核苷酸激酶（日本Takara Schuzo Co.，Ltd.生产）于37℃下反应1小时（寡核苷酸1.1μg，50mM Tris-HCl pH8.0，0.10mM MgCl2，10mM巯基乙醇，50μCν-32PATP（＞5000Ci/mmole），3单位T4多核苷酸激酶），以用32P标记寡核苷酸的5′-端。
用以上述方法标记的2个寡核苷酸作为探针，使其分别与已固定了DNA的复制滤膜结合。结合反应在5×SSPE（180mM NaCl，10mM NaH2PO4，1mM EDTA pH7.4），5×Denharolt氏溶液，0.1%SDS和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA的溶液中于35℃下进行16小时，其中含有10μCi的探针。反应以后，滤膜用5×SSC（0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠）的0.1%SDS溶液于室温下洗涤3次，每次30分钟，然后于45℃洗涤2次，每次30分钟（T.Maniatis et al.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，P.309，1982）。
对洗过的滤膜进行放射性自显影，使每一个复制滤膜对的2个放射自显影圈重迭，找出与两种探针均有反应的菌株。通过这种方法，从5×105个克隆中得到一个与两种探针反应的菌株（大肠杆菌K12DH1/PTB627，IFO14494，FERM BP-1280）。
（2）使用碱法（Nucleic Acids Res.1：1513，1979），从上述（1）得到的菌株中（大肠杆菌K12DH1/pTB627，IFO14494，FERM BP-1280）提取并纯化质粒DNA。
参考实施例2 编码人bFGF的基因在大肠杆菌中的表达
（1）为进行人bFGF的表达，构建质粒pTB669：
用限制性酶AvaⅠ和BalⅠ切割上述参考实施例1（2）中得到的含有人bFGF cDNA的质粒pB627得到含有人bFGF编码区的0.44Kb DNA片段。利用T4 DNA连接酶，在此DNA片段的BalⅠ切点（平头）连上BglⅡ连接子pCAGATCTG并分离出0.44Kb AvaⅠ-BglⅡ DNA片段。用T4 DNA连接酶与此0.44Kb的AvaⅠ-BglⅡDNA片段反应，使BglⅡ切点连接起来，然后在dXTP存在下通过DNA聚合酶（Klenow片段）反应使AvaⅠ切点成为平端。在磷酸化作用以后，用T4 DNA连接酶使此DNA片段与合成的寡核苷酸5′AATTCTATGCCAGCATTGC3′和5′GCAATGCTGGCATAG3′相连接，然后用EcoRⅠ-BglⅡ酶切以制备大约0.46Kb的DNA片段。另外，用PstⅠ切割质粒ptrp 781（Kurokawa，T.et al.，Nucleic Acids Res.11：3077-3085，1983）的DNA，该质粒具有trp启动子，然后经T4 DNA聚合酶反应使其末端成为平头。通过T4 DNA连接酶反应将BglⅡ连接子pCAGATCTG与平头连接，然后用EcoRⅠ-BglⅡ切割以分离出长约3.2Kb、含有trp启动子、四环素抗性基因和质粒复制起始位点的DNA片段。通过T4 DNA连接酶反应，使上述含有编码人bFGF之基因区的0.46Kb EcoRⅠ-BglⅡ DNA片段，与该3.2Kb DNA片段连接在一起，以构建用于表达人bFGF的质粒pTB669。
用此质粒pTB669转化大肠杆菌DH1，从而得到携带质粒pTB669的大肠杆菌DH1/pTB669。
另外，使用pTB669以上述同样方法转化大肠杆菌K12MM294或C600，从而分别得到大肠杆菌K12MM294/pTB669（IFO14532，FERM BP-1281）和大肠杆菌C600/pTB669。
（2）细菌细胞提取物的制备：
将上述每种转化体培养在含有1%葡萄糖，0.4%酪蛋白氨基酸和8μg/ml四环素的M9培养基中，Klett值达到大约200以后，加入浓度为25μg/ml的3β-吲哚丙烯酸，然后再培养4小时。培养以后，收集细菌细胞，悬浮在含有1/20数量20mM Tris-HCl（pH7.6）的10%蔗糖溶液中。向此悬浮液中加入1mM苯基甲基磺酰氟（PMSF），10mM EDTA，0.1M NaCl，10mM盐酸亚精胺和100μg/ml溶菌酶（都是指加入后达到的终浓度），此混合物于0℃下放置45分钟，然后用超声处理30秒。使此溶液以18000rpm离心30分钟（Sorval离心机，SS34转子）以得到上清液，将它作为细菌细胞提取物使用。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
人bFGF活性用纯化的牛脑FGF标准样品（Takara Shuzo Co.，Ltd.生产）的重量表示，即在对BALB/c3T3小鼠细胞表现生长促进活性上，细菌细胞提取物相当于FGF标准样品的量。
在Nunc96孔微量滴定板（平底）的每个孔中加入0.2ml含有5%小牛血清的MEM培养基，用小鼠BALB/c3T3细胞以每孔2×103细胞的量接种后培养。第二天，换用含有0.5%小牛血清的DMEM培养基。培养3天以后，每孔中加入10μl细菌细胞提取物，此提取物已预先用含有0.5%BSA的DME培养基以5倍进行系列稀释，然后进行培养。20小时以后，每孔中加入2μl3H-Tdr（5Ci/mmol，0.5mCi/ml RCC Amersham，UK）。6小时以后，用含有0.2%胰蛋白酶及0.02% EDTA的磷酸缓冲液（PBS）处理以使细胞脱离，用Titertech细胞收集器将细胞收集到玻璃滤膜上，然后，用闪烁计数器测定摄入细胞内的3H-Tdr量。使用同样的方法，测定已知重量的牛脑FGF样品（Takara Shuzo产品）的活性。这样可得到一条工作曲线，并由此计算细菌细胞提取物样品中人bFGF的量。结果显示于表2中。
作为对照，测定用质粒ptrp781转化大肠杆菌DH1得到的转化体大肠杆菌DH1/ptrp 781的人bFGF生产率。
表2 人bFGF生产率
转化体 人bFGF生产率（每升培养基）
大肠杆菌DH1/pTB669 2.95mg
大肠杆菌MM294/pTB669 23.15
大肠杆菌C600/pTB669 8.15
大肠杆菌DH1/ptrp781 ＜0.0005
实施例1 含有编码突变蛋白之碱基顺序的重组DNA的生成
（1）人bFGF基因之M13载体的克隆：
用限制性酶EcoRⅠ和BamHⅠ消化参考实施例2中得到的质粒pTB669。用限制性酶EcoRⅠ和BamHⅠ消化噬菌体载体M13mp8（J.Messing，Methods，in Enzymology，101：20-76，1983）的复制型（RF）DNA，与通过消化pTB669而得到的人bFGF DNA片段混合。然后，借助T4 DNA连接酶将混合物连接在一起;用连接的DNA转化到可感染的大肠杆菌JM105的细胞内;将产生的转化子接种到用Xgal1作为指示剂的平板上，（J.Messing et al.，Nucleic Acids Res.9：309-321，1981）;挑出含有重组噬菌体的空斑（白色空斑）;通过双脱氧核苷酸合成链终止法（J.Messing et al.，Nucleic Acids Res.9：309，1981）测定重组区的碱基顺序，由此证实人bFGF DNA已被准确地插入其中。
从这一M13-PO克隆中纯化出一条单链噬菌体DNA，然后用它作为模板，利用合成的寡核苷酸进行定位诱变。
（2）位点专一性的诱变：
在0.1mM腺苷三磷酸（ATP），50mM Tris-HCl pH8.0，10mM MgCl2，5mM二硫苏糖醇（DTT）和9单位T4激酶的存在下，以50μl的总体积，于37℃用T4激酶将40微微摩尔（Picomole）合成的寡核苷酸：
5′＞CGTTCTTGCTGTAGAGCCGCT＜3′〔使Cys26变为Ser的引物（限制性酶RsaⅠ的识别顺序被去掉）（参见图2）〕处理1小时。使此激酶处理过的引物（12微微摩尔）在50μl含有50mM NaCl，1.0mM Tris-HCl pH8.0，10mM MgCl2和10mMβ-巯基乙醇的混合物中加热至67℃保持5分钟，然后于42℃保持25分钟，从而使引物与5μg单链（SS）M13-PO DNA杂交。然后在冰上冷却退火的混合物，并将其加至50μl，含有0.5mM脱氧核苷三磷酸（dNTP），80mM Tris-HCl pH7.4，8mM MgCl2，100mM NaCl，9单位DNA聚合酶I Klenow片段，0.5mM ATP和2单位T4 DNA连接酶的反应混合物中，于37℃反应3小时，并于25℃反应2小时，然后加入2μl0.2mM EDTA以终止反应。用反应产物转化可感染的JM105细胞;使这样得到的转化体细胞生长过夜，然后从培养基上清液中分离ssDNA。用此ssDNA作为模板使引物进行第2周期的延长，用凝胶纯化的RF型DNA转化可感染的JM105细胞;将得到的转化体细胞铺在琼脂平板上，培养过夜以得到噬菌体空斑。
（3）定位诱变
重复上述（2）中的程序，但所用的合成的寡核苷酸引物为：
5′＞AACGATTAGCGCTCACTCC＜3′
它使编码70位半胱氨酸的密码子变为丝氨酸的密码子（产生了限制性酶HaeⅡ的识别顺序）（参见图2）。
（4）定位诱变
重复上述（2）中的程序，但所用的合成的寡核苷酸引物为：
5′＞GTA ACA GAC TTA GAA GCT AGT＜3′它使编码88位半脱氨酸的密码子变为丝氨酸的密码子（产生了限制性酶AluⅠ的识别顺序）（见图2）。
（5）定位诱变：
重复上述（2）中的程序，但所用的合成的寡核苷酸引物为：
5′＞TCG AAG AAG AAA GAC TCA TCC＜3′它使编码93位半脱氨酸的密码子变为丝酸的密码子（产生了限制性酶HinfⅠ的识别顺序）（见图2）。
（6）诱变空斑的筛选和鉴别：
将含有突变的M13-PO空斑的平板（上述（1））和2个含有突变的M13-PO噬菌体空斑的平板冷却至4℃，将每个平板上的空斑转移至两个圆形硝化纤维素滤膜上，转移方法是使干的滤膜置于琼脂平板上，第1滤膜保持5分钟，第2滤膜保持15分钟。然后，将滤膜在浸于0.2N NaOH，1.5M NaCl和0.2% Triton X-100中的厚滤纸上放置5分钟，再将它们在浸于0.5M Tris-HCl pH7.5和1.5M NaCl中的滤纸上再放置5分钟而使之中性化。将滤膜以同样方式置于浸在2XSSC（标准柠檬酸钠）中的滤膜上洗涤两次，使之干燥，然后在真空烘箱中以80℃干燥2小时。用10ml/滤膜pH为7.0的DNA杂交缓冲液（5×SSC）使重迭的滤膜55℃下预杂交4小时，该杂交缓冲液含有4×Denhardt氏溶液（聚乙烯吡咯烷酮、Ficoll和牛血清白蛋白，1X＝0.02%）、0.1%SDS、50mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA。杂交于42℃下进行24小时，使用105cpm/ml的寡核苷酸引物。每片滤膜均用洗涤缓冲液于50℃洗涤30分钟，该缓冲液含有0.1%SDS和渐减量的SSC。然后，先用含有2×SSC的缓冲液洗涤滤膜;含有未突变M13-PO空斑的对照滤膜则用盖革氏计数器检测其放射活性。同时用SSC浓度逐步降低的缓冲液洗涤对照滤膜，直至滤膜上检测不到放射性时为止。所用SSC的最小浓度为0.1×SSC。在空气中干燥滤膜，并在-70℃下曝光2-3天进行放射自显影。用激酶处理过的寡核苷酸作为探针，筛选10，000个突变的M13-PO空斑和100个未突变的对照空斑。没有一个对照空斑与探针杂交，而有3-10个突变的M13-PO空斑与探针杂交。
选取一个突变的M13-PO空斑，接种于M105培养基上。从上清液中制备ssDNA，从细菌细胞沉淀中制备双链（ds）DNA。利用合适的寡核苷酸引物和ssDNA进行碱基顺序的分析。
其结果是，分别证实了TGC（Cys-26）密码子已变成了TCT（Ser）密码子;TGT（Cys-70）密码子变成了AGC（Ser）密码子;TGT（Cys-88）密码子变为TCT（Ser）密码子;以及TGT（Cys-93）密码子变为TCT（Ser）密码子。
在突变的M13-PO噬菌体中，将密码子Cys-26变为Ser密码子的噬菌体定名为M13-P1;将密码子Cys-70变为Ser密码子的噬菌体称为M13-P2;将密码子Cys-88变为Ser的噬菌体称为M13-P3;将密码子Cys-93变为Ser密码子的噬菌体称为M13-P4。
实施例2 编码人bFGF突变蛋白的基因在大肠杆菌中的表达
（1）构建用于人bFGF突变蛋白表达的质粒pTB739：
上述实例1得到的复制型（RF）M13-P1用限制性酶EcoRⅠ和PstⅠ切割，得到长约0.5Kb的含有人bFGF突变蛋白编码区的DNA片段。
另外，用EcoRⅠ-PstⅠ切割含有trp启动子的质粒ptrp 781（Kurokawa，T.et al.，Nucleic Acids Res.11：3077-3085，1983）DNA，分离出长约3.2Kb的含有trp启动子、四环素抗性基因和质粒复制起始位点的DNA片段。通过T4 DNA连接酶反应，将上述含有人bFGF突变蛋白基因编码区的0.5Kb EcoRⅠ-PstⅠ DNA片段与此3.2Kb DNA片段连接在一起，以构建用于bFGF突变蛋白表达的质粒pTB739（图7）。
用此质粒pTB739转化大肠杆菌DH1，从而得到大肠杆菌DH1/pTB739（IFO14575，FERM BP-1641），在它携带的质粒pTB739中含有示于图3的编码突变蛋白的基因。
（2）细菌细胞提取物的制备：
将上述转化体培养在M9培养基中，其中含有1%葡萄糖、0.4%酪蛋白氨基酸和8μg/ml四环素，当Klett值达到大约200时，向其中加入浓度为25μg/ml的3β-吲哚丙烯酸，然后再培养4小时。培养以后，收集细菌细胞并悬浮在含有1/20量之20mM Tris-HCl（pH7.6）的10%蔗糖溶液中。在此悬浮液中加入1mM苯基甲基磺酰氟（PMSF）、10mM EDTA、0.1M NaCl、10mM盐酸亚精胺和100μg/ml溶菌酶（都是指加入后达到的终浓度），将混合物于0℃下放置45分钟，然后超声处理30秒钟。将该溶液以18，000rpm离心30分钟（Sorval离心机，SS34转子）以得到上清液，将其用作细菌细胞提取物。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
Nunc96孔微量滴定板（平底）每孔中加有0.2ml含5%小牛血清的DMEM培养基，以每孔2×103细胞的数量接种小鼠BALB/c3T3细胞，然后培养。第二天，换成含有0.5%小牛血清的DMEM培养基。培养3天以后，每孔中加入10μl细菌细胞提取物（此提取物已预先用含有0.5%BSA的DMEM培养基以每次5倍进行了系列稀释过），并培养之。20小时后，每孔中加入2μl3H-Tdr（5Ci/mmole，0.5mCi/ml RCC Amersham）。6小时后，用含有0.2%胰蛋白酶和0.02%EDTA的磷酸缓冲液（PBS）处理使细胞脱离孔壁，用Titertech细胞收集器将细胞收集到玻璃滤膜上，然后用闪烁计数器测定细胞所摄入的3H-Tdr量。
其结果是，来自大肠杆菌DH1/pTB739的细菌细胞提取物表现有FGF活性。
这样便得到了突变蛋白CS1，其中，人bFGF26位的Cys已由Ser取代。
实施例3 编码人bFGF突变蛋白的基因在大肠杆菌中的表达
（1）构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB742：
用限制性酶EcoRⅠ和PstⅠ切割上述实施例1得到的复制型（RF）M13-P2，以得到含有人bFGF突变蛋白编码区之长约0.5Kb的DNA片段。
另外，用EcoRⅠ-PstⅠ切割含有trp启动子的质粒ptrp781 DNA，分离出长约3.2Kb的含有trp启动子、四环素抗性基因和质粒复制起始位点的DNA片段。通过T4 DNA连接酶反应，使此3.2Kb DNA片段与上述含有人bFGF突变蛋白基因编码区之0.5Kb EcoRⅠ-PstⅠ DNA片段连接在一起，以构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB742（图8）。
用此质粒pTB742转化大肠杆菌DH1，从而得到大肠杆菌DH1/pTB742（IFO14584，FERM BP-1642），该菌株携带的质粒pTB742中，含有图4所示的编码突变蛋白的基因。
（2）细菌细胞提取物的制备：
根据实例2（2）所述方法培养上述转化体以得到上清液，然后将上清液用作细菌细胞提取物。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
按照实例2（3）所述方法，测定以上述（2）的方法制得的细菌细胞提取物的人bFGF活性。
其结果是，大肠杆菌DH1/pTB742的细菌细胞提取物表现有FGF活性。
这样便得到了突变蛋白CS2，其中，人bFGF70位的Cys已由Ser所取代。
实施例4 编码人bFGF突变蛋白的基因在大肠杆菌中的表达
（1）构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB743：
用限制性酶EcoRⅠ和PstⅠ切割上述实施例1得到的复制型（RF）M13-P3，得到长约0.5Kb、含有人bFGF突变蛋白编码区的DNA片段。
另外，用EcoRⅠ-PstⅠ切割含有trp启动子的质粒ptrp781 DNA，分离出长约3.2Kb、含有trp启动子、四环素抗性基因和质粒复制起始位点的DNA片段。通过T4 DNA连接酶反应，使此3.2Kb DNA片段与上述含有人bFGF突变蛋白基因编码区的0.5Kb EcoRⅠ-PstⅠ DNA片段连接在一起，以构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒bTB 743（图9）。
用此质粒pTB743转化大肠杆菌DH1，从而得到大肠杆菌DH1/pTR743（IFO14585，FERM BP-1643），它所携带的质粒pTB743中含有图5所示的编码突变蛋白的基因。
（2）细菌细胞提取物的制备：
依实施例2（2）所述方法培养上述转化体以得到上清液，以此上清液作为细菌细胞提取物。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
按照实施例2（3）所述方法，测定上述（2）得到的细菌细胞提取物的人bFGF活性。
其结果是，大肠杆菌DH1/bTB743的细菌细胞提取物表现有FGF活性。
这样便得到了突变蛋白CS3，其中，人bFGF88位上的Cys已由Ser所取代。
实施例5 编码人bFGF突变蛋白的基因在大肠杆菌中的表达
（1）构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB744：
用限制性酶EcoRⅠ和PstⅠ切割实施例1中得到的复制型（RF）M13-P4，得到长约0.5Kb的含有人bFGF突变蛋白编码区的DNA片段。
另外，用EcoRⅠ-PstⅠ切割含有trp启动子的质粒ptrp781 DNA，分离出大约3.2Kb的含有trp启动子、四环素抗性基因和质粒复制起始位点的DNA片段。通过T4 DNA连接酶反应，使此3.2KbDNA片段与上述长0.5Kb的含有人bFGF突变蛋白基因编码区的EcoRⅠ-PstⅠ DNA片段连接在一起，以构建用于人bFGF突变蛋白表达的质粒pTB744（图10）。
用该质粒pTB744转化大肠杆菌DH1，从而得到大肠杆菌DH1/pTB744（IFO14586，FERM BP-1644），它所携带的质粒pTB744中含有如图6所示的编码突变蛋白的基因。
（2）细菌细胞提取物的制备：
依照实施例2（2）所述方法培养上述转化体以得到上清液，然后以此上清液作为细菌细胞提取物。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
依照实施例2（3）所述的方法，检测上述（2）得到的细菌细胞提取物的人bFGF活性。
其结果是，大肠杆菌DH1/pTB＞44的细菌细胞提取物表现出FGF活性。
这样便得到了突变蛋白CS4，其中，人bFGF93位上的Cys已由Ser所取代。
实施例6 诱变空斑的筛选和鉴别
将含有实施例1得到的突变的M13-P2噬菌体空斑的平板和2个含有实施例1得到的未突变M13-P2噬菌体空斑的平板冷却至4℃，将得自各平板上的空斑转移至两个圆形硝化纤维素滤膜上，转移方法是使干的滤膜置于琼脂平板上，第1滤膜保留5分钟，第2滤膜保留15分钟。然后，使滤膜在浸于0.2N NaOH，1.5M NaCl和0.2%Triton X-100中的厚滤纸上放置5分钟，此后，使其在浸于0.5M Tris-HCl pH7.5和1.5M NaCl中的滤纸上再放置5分钟使之中性化。将滤膜以同样方式置于浸在2×SSC（标准柠檬酸钠）中的滤膜上洗涤两次，使之干燥，然后在真空烘箱中以80℃干燥2小时。用10ml/滤膜pH为7.0的DNA杂交缓冲液（5×SSC）使重迭的滤膜于55℃下预杂交4小时，上述杂交缓冲液含有4×Denhardt氏溶液（聚乙烯吡咯烷酮、Ficoll和牛血清白蛋白，1X＝0.02%）、0.1%SDS、50mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA。与105cpm/ml的寡核苷酸引物于42℃下杂交24小时。各滤膜用洗涤缓冲液于50℃洗涤30分钟（该缓冲液含有0.1%SDS和其量渐为减少的SSC）。然后，先用含有2×SSC的缓冲液洗涤滤膜;而含有未突变M13-P2空斑的对照滤膜则用盖革计数器检测其放射性。用SSC浓度逐步降低的缓冲液洗涤对照滤膜，直至滤膜上检测不到放射性时为止。所用SSC的最小浓度为0.1×SSC。在空气中干燥滤膜，于-70℃下曝光2-3天进行放射性自显影。用激酶处理过的寡核苷酸作为探针，筛选10，000个突变的M13-P2空斑和100个未突变的对照空斑。任何对照空斑均未与探针杂交，而有3-10个突变的M13-P2空斑与探针杂交。
选取一个突变的M13-P2空斑，接种于JM105培养基上。由所得上清液中制备ssDNA，并由细菌细胞沉淀物制备双链（ds）DNA。利用合适的寡核苷酸引物和ssDNA进行碱基顺序分析。
其结果是，分别证实了TGC（Cys-26）密码子已变为TCT（Ser）密码子;TGT（Cys-88）密码子已变为TCT（Ser）密码子;以及TGT（Cys-93）密码子已变为TCT（Ser）密码子。
在突变的M13-P2噬菌体中，密码子Cys-26和-70已变为Ser密码子的噬菌体称为M13-P12;密码Cys-70和-88已变为Ser密码子的噬菌体称为M13-P23;密码子Cys-70和-93已变为Ser密码子的噬菌体称为M13-P24。
实施例7 编码人bFGF突变蛋白的基因在大肠杆菌中的表达
（1）构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB762：
用实例2（1）所述方式处理上述实施例6得到的复制型（RF）M13-P23，以构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB762（图12）。
用此质粒pTB762转化大肠杆菌MM294，从而得到大肠杆菌MM294/pTB762（IFO14613，FERM BP-1645），该菌株所携带的质粒pTB762中含有如图11所示的编码突变蛋白的基因。
（2）细菌细胞提取物的制备：
依照实施例2（2）所述方法培养上述转化体以得到上清液，并将此上清液用作细菌细胞提取物。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
依照实施例2（3）中所述的方法，检测上述（2）所得细菌细胞提取物的人bFGF活性。
其结果是，大肠杆菌MM294/pTB762的细菌细胞提取物表现有FGF活性。
这样便得到了突变蛋白C23，其中，70位和88位的Cys已由Ser所取代。
实施例8 诱变空斑的筛选和鉴别
将含有实施例7得到的突变的M13-P23噬菌体空斑的平板和2个含有实施例7得到的未突变的M13-P23噬菌体空斑的平板冷却至4℃，将各平板上的空斑转移至两个圆形硝化纤维素滤膜上，转移方法是将干的滤膜置于琼脂平板上，第1滤膜保留5分钟，第2滤膜保留15分钟。然后，使滤膜在浸于0.2N NaOH，1.5M NaCl和0.2%Triton X-100中的厚滤纸上放置5分钟，此后，使它们在浸于0.5M Tris-HCl pH7.5和1.5M NaCl中的滤纸上再放置5分钟而使其中性化。将滤膜以同样方法置于浸于2×SSC（标准柠檬酸钠）中的滤器上洗涤两次，使之干燥，然后在真空烘箱内以80℃干燥2小时。用100ml/滤膜pH为7.0的DNA杂交缓冲液（5×SSC）使重迭的滤膜于55℃预杂交4小时，该预杂交缓冲液含有4×Denhardt氏溶液（聚乙烯吡咯烷酮、Ficoll和牛血清白蛋白，1X＝0.02%）、0.1%SDS、50mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA。与105cpm/ml的寡核苷酸引物于42℃下杂交24小时。各滤膜均用洗涤缓冲液于50℃洗涤30分钟，该洗涤缓冲液含有0.1%SDS和数量减少了的SSC。然后，将滤膜先用含有2×SSC的缓冲液洗涤;而含未突变M13-P23空斑的对照滤膜则用盖革计数器检测其放射活性。用逐步降低了SSC浓度的洗涤缓冲液洗涤含有未突变M13-P23空斑的对照滤膜，直至滤膜上检测不到放射性时为止。所用SSC的最小浓度为0.1×SSC。使滤膜在空气中干燥，在-70℃下曝光2-3天进行放射性自显影。用激酶处理过的寡核苷酸作为探针，筛选10，000个突变的M13-P23空斑和100个未突变的对照空斑。所有对照空斑均未与探针杂交，而有3-10个突变的M13-P23空斑与探针杂交。
选取一个突变的M13-P23空斑，接种于JM105培养基上。由所得的上清液中制备ssDNA，并由细菌细胞沉淀中制备双链（ds）DNA。利用合适的寡核苷酸引物和ssDNA进行碱基顺序分析。
其结果是，分别证实了TGC（Cys-26）密码子已变为TCT（Ser）密码子;且TGT（Cys-93）密码子已变为TCT（Ser）密码子。
在突变的M13-P23噬菌体中，密码子Cys-26，-70和-88已变为Ser密码子的噬菌体称为M13-P123;密码子Cys-70，-88和-93已变为Ser密码子的噬菌体称为M13-P234。
实施例9 编码人bFGF突变蛋白的基因在大肠杆菌中的表达
（1）构建用于人bFGF突变蛋白表达的质粒pTB764：
以实例2（1）中所述的方式处理实例8得到的复制型（RF）M13-P123，以构建用于人表达bFGF突变蛋白的质粒pTB764（图14）。
用此质粒pTB764转化大肠杆菌MM294，从而得到大肠杆菌MM294/pTB764（IFO14614，FERM BP-1646），该菌株所携带的质粒pTB764中含有图13所示的编码突变蛋白的基因。
（2）细菌细胞提取物的制备：
依照实例2（2）中所述方法培养上述转化体以得到上清液，然后将此上清液用作细菌细胞提取物。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
依照实例2（3）中所述的方法，检测上述（2）得到的细菌细胞提取物的人bFGF活性。
其结果是，大肠杆菌MM294/pTB764的细菌细胞提取物表现有FGF活性。
这样便得到了突变蛋白C123，其中，人bFGF之26-，70-和88-位的Cys已由Ser所取代。
实施例10 诱变空斑的筛选和鉴别
将含有实施例8得到的突变的M13-P123噬菌体空斑的平板和2个含有实例8得到的未突变的M13-P123噬菌体空斑的平板冷却至4℃，将得自各平板上的空斑转移至两个圆形硝化纤维素滤膜上，转移方法是将干的滤膜置于琼脂平板上，第1滤膜保留5分钟，第2滤膜保留15分钟。然后，使滤膜在浸于0.2N NaOH，1.5M NaCl和0.2%Triton X-100中的厚滤纸上放置5分钟，此后，使之在浸于0.5M Tris-HCl pH7.5和1.5M NaCl中的滤纸上再放置5分钟而使其中性化。将滤膜以同样方式置于浸在2×SSC（标准柠檬酸钠）中的滤膜上洗涤两次，使之干燥，然后在真空烘箱中以80℃干燥2小时。用100ml/滤膜pH为7.0的DNA杂交缓冲液（5×SSC）使重迭的滤膜于55℃下预杂交4小时，该预杂交缓冲液含有4×Denhardt氏溶液（聚乙烯吡咯烷酮、Ficoll和牛血清白蛋白，1×＝0.02%），0.1%SDS，50mM磷酸钠缓冲液pH7.0和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA。与105cpm/ml的寡核苷酸引物42℃下杂交24小时。每种滤膜均用洗涤缓冲液于50℃洗涤30分钟，该洗涤缓冲液含有0.1%SDS和数量减少了的SSC。然后，先用含有2×SSC的缓冲液洗涤滤膜，而含有未突变M13-P123空斑的对照滤膜则用盖革计数器检测其放射活性。用SSC浓度逐步降低的缓冲液洗涤含有未突变M13-P123空斑的对照滤膜，直至滤膜上检测不到放射性时为止。所用SSC的最小浓度为0.1×SSC。使滤膜在空气中干燥，在-70℃下曝光2-3天进行放射性自显影。用激酶处理的寡核苷酸作为探针，筛选10，000个突变的M13-P123空斑和100个未突变的对照空斑。所有对照空斑均未与探针杂交，而有3-10个突变的M13-P123空斑与探针杂交。
选取一个突变的M13-P123空斑，接种于3M105培养基上。由所得上清液中制备ssDNA，并由细菌细胞沉淀中制备双链（ds）DNA。利用合适的寡核苷酸引物和ssDNA进行碱基顺序分析。
结果证实TGT（Cys-93）密码子已变为TCT（Ser）密码子。
在突变的M13-P123噬菌体中，密码子Cys-26，-70，-88和-93已变为Ser密码子的噬菌体称为M13-P1234。
实施例11 编码人bFGF突变蛋白的基因在大肠杆菌中的表达
（1）构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB765：
以实施例2（1）中所述的方式处理实施例10得到的复制型（RF）M13-P1234，以构建用于人bFGF突变蛋白表达的质粒pTB765（图16）。
用此质粒pTB765转化大肠杆菌MM294，从而得到大肠杆菌MM294/pTB765（IFO14615，FERM BP-1647），该菌株所携带的质粒pTB765中含有如图15所示的编码突变蛋白的基因。
（2）细菌细胞提取物的制备：
依照实例2（2）所述方法培养上述转化体以得到上清液，并以此上清液作为细菌细胞提取物。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
用实例2（3）所述方法，测定上述（2）得到的细菌细胞提取物的人bFGF活性。
其结果是，大肠杆菌MM294/bTB765的细菌细胞提取物表现有FGF活性。
这样便得到了突变蛋白CS1234，其中，人bFGF中26、70、80和93位的Cys都已由Ser所取代。
实施例12 诱变空斑的筛选和鉴别
将含有依据实例1的方法用合成的寡聚物〔图2（3）或（4）〕使之突变的M13-P1噬菌体的平板和2个含有实例1得到的未突变M13-P1噬菌体空斑的平板冷却至4℃，将得自各平板上的空斑转移至两个圆形硝化纤维素滤膜上，转移方法是将干的滤膜置于琼脂平板上，第1滤膜保留5分钟，第2滤膜保留15分钟。然后，使滤膜在浸于0.2N NaOH，1.5M NaCl和0.2%Triton×-100中的厚滤纸上放置5分钟，此后，使它们在浸于0.5M Tris-HCl（pH7.5）和1.5M NaCl中的滤纸上再放置5分钟而使其中性化。将滤膜以同样方式置于浸在2×SSC（标准柠檬酸钠）中的滤膜上洗涤两次，使之干燥，然后在真空烘箱中以80℃干燥2小时。用100ml/滤膜pH为7.0的DNA杂交缓冲液（5×SSC）使重迭的滤膜于55℃下预杂交4小时，该预杂交缓冲液含有4×Denhardt氏溶液（聚乙烯吡咯烷酮、Ficoll和牛血清白蛋白，1×＝0.02%）、0.1%SDS、50mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA。与105cpm/ml的寡核苷酸引物在42℃下杂交24小时，每种滤膜均用洗涤缓冲液于50℃洗涤30分钟，该洗涤缓冲液含有0.1%SDS和数量减少了的SSC。然后，先用含有2×SSC的缓冲液洗涤滤膜;而含有未突变M13-P1空斑的对照滤膜则用盖革计数器检测其放射活性。用逐步降低了的SSC浓度的缓冲液洗涤含有未突变M13-P1空斑的对照滤膜，直至滤膜上检测不到放射性时为止。所用SSC的最小浓度为0.1×SSC。使滤膜在空气中干燥，在-70℃下曝光2-3天进行放射自显影。使用在ν-32P-ATP存在下用激酶处理过的寡核苷酸作为探针，筛选10，000个突变的M13-P1空斑和100个未突变的对照空斑。没有一个对照空斑与探针杂交，而有3-10个突变的M13-P1空斑与探针杂交。
选取一个突变的M13-P1空斑接种于JM105培养基上。从所得上清液中制备ssDNA，并从细菌细胞沉淀中制备双链（ds）DNA。利用合适的寡核苷酸引物和ssDNA进行碱基顺序分析。
其结果是，分别证实TGT（Cys-88）密码子已变为TCT（Ser）密码子;TGT（Cys-93）密码子已变为TCT（Ser）密码子。
在突变的M13-P1噬菌体中，将密码子Cys-26和-88已变为Ser密码子的噬菌体称为M13-P13;将密码子Cys-26和-93已变为Ser密码子的噬菌体称为M13-P14。
实施例13 诱变空斑的筛选和鉴别
将含有依据实例1的方法用合成的寡聚物〔图2（2）或（3）〕使之突变的M13-P14噬菌体空斑的平板和2个含有未突变的M13-P14噬菌体空斑的平板冷却至4℃，将得自各平板的空斑转移至两个圆形硝化纤维素滤膜上，转移方法是将干的滤膜置于琼脂平板上，使第1滤膜保留5分钟，第2滤膜保留15分钟。然后，使滤膜在浸于0.2N NaOH，1.5M NaCl和0.2% Triton ×-100中的厚滤纸上放置5分钟，此后，使它们在浸于0.5M Tris-HCl pH7.5和1.5M NaCl中的滤纸上再放置5分钟而使其中性化。将滤膜以同样方式置于浸在2×SSC（标准柠檬酸钠）中的滤膜上洗涤两次，使之干燥，然后在真空烘箱中以80℃干燥2小时。在100ml/滤膜pH为7.0的DNA杂交缓冲液中（5×SSC）使重迭的滤膜于55℃下预杂交4小时，该预杂交缓冲液含有4×Denhardt氏溶液（聚乙烯吡咯烷酮、Ficoll和牛血清白蛋白，1×＝0.02%）、0.1%SDS、50mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA。与105cpm/ml的寡核苷酸引物42℃下杂交24小时，每种滤膜均用洗涤缓冲液于50℃洗涤30分钟，该洗涤缓冲液含有0.1%SDS和数量减少了的SSC。然后，先用含有2×SSC的缓冲液洗涤滤膜;而含有未突变M13-P14空斑的对照滤膜则用盖革计数器检测其放射活性。用逐步降低SSC浓度的洗涤缓冲液洗涤含有未突变M13-P14空斑的对照滤膜，直至滤膜上检测不到放射活性时为止。所用SSC的最小浓度为0.1×SSC。使滤膜在空气中干燥，在-70℃下曝光2-3天进行放射自显影。使用在ν-32P-ATP存在下用激酶处理过的寡核苷酸作为探针，筛选10，000个突变的M13-P14空斑和100个未突变的对照空斑。没有一个对照空斑与探针杂交，而有3-10个突变的M13-P14空斑与探针杂交。
选取一个突变的M13-P14空斑，接种于JM105培养基上。由所得上清液中制备ssDNA，并由细菌细胞沉淀中制备双链（ds）DNA。利用合适的寡核苷酸引物和ssDNA进行碱基顺序分析。
其结果是，分别证实了TGT（Cys-70）密码子已变为TCTCT（Ser）密码子;TGT（Cys-93）密码子已变为TCT（Ser）密码子。
在突变的M13-P14噬菌体中，将密码子Cys-26、-70和-93已变为Ser密码子的噬菌体称为M13-P124;将密码子Cys-26、-88和-93已变为Ser密码子的噬菌体称为M13-P134。
实施例14 诱变空斑的筛选和鉴别
将含有根据实施例1的方法用合成的寡聚物〔图2（2）〕使之突变了的M13-P3噬菌体空斑的平板和2个含有实例1所得未突变M13-P3噬菌体空斑的平板冷却至4℃，将得自各平板的空斑转移至两个圆形硝化纤维素滤膜上，转移方法是将干的滤膜置于琼脂平板上，使第1滤膜保留5分钟，第2滤膜保留15分钟。然后，使滤膜在浸于0.2N NaOH，1.5M NaCl和0.2% Triton ×-100中的厚滤纸上放置5分钟，此后，使它们在浸于0.5M Tris-HCl pH7.5和1.5M NaCl中的滤纸上再放置5分钟而使之中性化。将滤膜以同样方式置于浸在2×SSC（标准柠檬酸钠）中的滤膜上洗涤两次，使之干燥，然后在真空烘箱中以80℃干燥2小时。用100ml/滤膜pH为7.0的DNA杂交缓冲液（5×SSC）使重迭的滤膜于55℃下预杂交4小时，该预杂交缓冲液含有4×Denhardt氏溶液（聚乙烯吡咯烷酮、Ficoll和牛血清白蛋白、1×＝0.02%）、0.1%SDS、50mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA。与105cpm/ml的寡核苷酸引物42℃下杂交24小时。每种滤膜均用洗涤缓冲液于50℃洗涤30分钟，该洗涤缓冲液含有0.1%SDS和数量减少了的SSC。然后，先用含有2×SSC的缓冲液洗涤滤膜;而含有未突变M13-P3空斑的对照滤膜则用盖革计数器检测其放射活性。用逐步降低SSC浓度的缓冲液洗涤含有未突变M13-P3空斑的对照滤膜，直至滤膜上检测不到放射活性时为止。所用SSC的最小浓度为0.1×SSC。使滤膜在空气中干燥，并在-70℃下曝光2-3天进行放射自显影。使用在ν-32P-ATP存在下用激酶处理过的寡核苷酸作为探针，筛选10，000个突变的M13-P3空斑和100个未突变的对照空斑。没有一个对照空斑与探针杂交，而有3-10个突变的M13-P3空斑与探针杂交。
选取一个突变的M13-P3空斑，接种于JM105培养基上。由所得上清液中制备ssDNA，并由细菌细胞沉淀中制备双链（ds）DNA。利用合适的寡核苷酸引物和ssDNA进行碱基顺序分析。
结果证实了TGT（Cys-93）密码子已变为TCT（Ser）密码子。
在突变的M13-P3噬菌体中，将密码子Cys-88和-93已变为Ser密码子的噬菌体称为M13-P34。
实施例15 编码人bFGF突变蛋白的基因在大肠杆菌中的表达
（1）构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB776：
依实施例2（1）所述方法处理上述实施例6得到的复制型（RF）M13-P12，以构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒bTB776（图18）。
用此质粒pTB776转化大肠杆菌MM294，从而得到大肠杆菌MM294/pTB776，其中，该菌株所携带的质粒pTB776含有图17所示的编码变异蛋白的基因。
（2）细菌细胞提取物的制备：
依据实施例2（2）所述方法培养上述转化体以得到上清液，并将此上清液用作细菌细胞提取物。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
依据实施例2（3）所述的方法，测定上述（2）得到的细菌细胞提取物的人bFGF活性。
其结果是，大肠杆菌MM294/pTB776的细菌细胞提取物表现有FGF活性。
这样便得到了突变蛋白CS12，其中，人bFGF26和70位的Cys已由Ser所取代。
实施例16 编码人bFGF突变蛋白的基因在大肠杆菌中的表达
（1）构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB778：
依实施例2（1）所述方法处理上述实例6得到的复制型（RF）M13-P24，以构建用于人bFGF突变蛋白表达的质粒pTB778（图20）。
用此质粒pTB778转化大肠杆菌MM294，从而得到大肠杆菌MM294/pTB778，它所携带的质粒pTB778含有图19所示的编码突变蛋白的基因。
（2）细菌细胞提取物的制备：
依据实施例2（2）所述方法培养上述转化体以得到上清液，并以此上清液作为细菌细胞提取物。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
依据实例2（3）所述的方法，检测上述（2）得到的细菌细胞提取物的人bFGF活性。
其结果是，大肠杆菌MM294/pTB778的细菌细胞提取物表现有FGF活性。
这样便得到了变异蛋白CS24，其中，人bFGF的70和93位Cys已被Ser取代。
实施例17 编码人bFGF突变蛋白的基因在大肠杆菌中的表达
（1）构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB779：
以实施例2（1）所述方法处理上述实施例12得到的复制型（RF）M13-P13，以构建用于人bFGF突变蛋白表达的质粒pTB779（图22）。
用此质粒pTB779转化大肠杆菌MM294，从而得到大肠杆菌MM294/pTB779，该菌株携带的质粒pTB779中含有如图21所示的编码突变蛋白的基因。
（2）细菌细胞提取物的制备：
依据实施例2（2）所述方法培养上述转化体以得到上清液，并用以作为细菌细胞提取物。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
依据实施例2（3）所述的方法，检测上述（2）得到的细菌细胞提取物的人bFGF活性。
其结果是，大肠杆菌MM294/pTB779的细菌细胞提取物表现出FGF活性。
这样便得到了突变蛋白CS13，其中人bFGF26和88位的Cys已被Ser所取代。
实施例18 编码人bFGF突变蛋白的基因在大肠杆菌中的表达
（1）构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB763：
依实施例2（1）所述方法处理上述实施例12得到的复制型（RF）M13-P14，以构建用于人bFGF突变蛋白表达的质粒pTB763（图24）。
用此质粒pTB763转化大肠杆菌MM294，从而得到大肠杆菌MM294/pTB763，该菌株所携带的质粒pTB763含有图23所示的编码突变蛋白的基因。
（2）细菌细胞提取物的制备：
依据实施例2（2）所述方法培养上述转化体以得到上清液，然后将其用作细菌细胞提取物。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
依据实例2（3）所述的方法，检测上述（2）得到的细菌细胞提取物的人bFGF活性。
其结果是，大肠杆菌MM294/pTB763的细菌细胞提取物表现有FGF活性。
这样便得到了突变蛋白CS14，其中人bFGF的26和93位Cys已被Ser所取代。
实施例19 编码人bFGF突变蛋白的基因在大肠杆菌中的表达
（1）构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB777：
依实施例2（1）所述方法处理上述实施例14得到的复制型（RF）M13-P34，以构建用于人bFGF突变蛋白表达的质粒pTB777（图26）。
用此质粒pTB777转化大肠杆菌MM294，从而得到大肠杆菌MM294/pTB777，该菌株所携带的质粒pTB777含有如图25中所示的编码突变蛋白的基因。
（2）细菌细胞提取物的制备：
依据实施例2（2）所述方法培养上述转化体以得到上清液，并将其用作细菌细胞提取液。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
依据实施例2（3）所述的方法，检测上述（2）得到的细菌细胞提取物的人bFGF活性。
其结果是，大肠杆菌MM294/pTB777的细菌细胞提取物表现有FGF活性。
这样便得到了突变蛋白CS34，其中人bFGF中的88和93位Cys已被Ser所取代。
实施例20 编码人bFGF突变蛋白的基因在大肠杆菌中的表达
（1）构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB782：
依实施例2（1）所述的方法处理上述实施例8得到的复制型（RF）M13-P234，以构建用于人bFGF突变蛋白表达的质粒pTB782（图28）。
用此质粒pTB782转化大肠杆菌MM294，从而得到大肠杆菌MM294/pTB782，该菌株所携带的质粒pTB782含有如图27中所示的编码突变蛋白的基因。
（2）细菌细胞提取物的制备：
依据实例2（2）所述方法培养上述转化体以得到上清液，并将其用作细菌细胞提取物。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
依据实例2（3）所述的方法，检测上述（2）得到的细菌细胞提取物的人bFGF活性。
其结果是，大肠杆菌MM294/pTB782的细菌细胞提取物表现有FGF活性。
这样得到了突变蛋白CS234，其中人bFGF中的70、88和93位Cys已被Ser所取代。
实施例21 编码人bFGF突变蛋白的基因在大肠杆菌中的表达。
（1）构建用于人bFGF突变蛋白表达的质粒pTB780：
依实施例2（1）所述的方法处理上述实施例13得到的复制型（RF）M13-P124，，以构建用于人bFGF突变蛋白表达的质粒pTB780（图30）。
用此质粒pTB780转化大肠杆菌MM294，从而得到大肠杆菌MM294/pTB780，该菌株所携带的质粒pTB780含有如图29中所示的编码突变蛋白的基因。
（2）细菌细胞提取物的制备：
依据实施例2（2）所述方法培养上述转化体以得到上清液，并用以作为细菌细胞提取物。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
依据实施例2（3）所述的方法，检测上述（2）得到的细菌细胞提取物的人bFGF活性。
其结果是，大肠杆菌MM294/pTB780的细菌细胞提取物表现有FGF活性。
这样便得到了突变蛋白CS124，其中人bFGF中的26、70和93位Cys已被Ser所取代。
实施例22 编码人bFGF的基因在大肠杆菌中的表达
（1）构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB781：
依实施例2（1）所述方法处理上述实例13得到的复制型（RF）M13-P134，以构建用于人bFGF突变蛋白表达的质粒pTB781（图31）。
用此质粒pTB781转化大肠杆菌MM294，从而得到大肠杆菌MM294/pTB781，该菌株所携带的质粒pTB781含有如图32中所示的编码突变蛋白的基因。
（2）细菌细胞提取物的制备：
依据实施例2（2）所述方法培养上述转化体以得到上清液并用以作为细菌细胞提取物。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
依据实施例2（3）所述的方法，检测上述（2）得到的细菌细胞提取物的人bFGF活性。
其结果是，大肠杆菌MM294/pTB781的细菌细胞提取物表现有FGF活性。
这样便得到了突变蛋白CS134，其中人bFGF中的26、88和93位Cys已被Ser所取代。
实施例23 突变蛋白生产率
依据参考实施例2（2）的方法，测定含有不同突变蛋白之细菌细胞提取物的FGF活性，进而计算出不同转化体的突变蛋白生产率。所得结果示于表3中。
表3
质粒 突变蛋白 生产率（mg-pt FGF/1份培养物）
pTB739 CS1 0.3
pTB742 CS2 10.6
pTB743 CS3 13.3
pTB744 CS4 0.8
pTB776 CS12 0.2
pTB779 CS13 0.1
pTB763 CS14 0.5
pTB762 CS23 25.8
pTB778 CS24 0.3
pTB777 CS34 0.5
pTB764 CS123 0.3
pTB780 CS124 0.4
pTB781 CS134 0.2
pTB782 CS234 1.4
pTB765 CS1234 0.1
pTB669 rhbFGF 6.0
ptrp781 - 0.0
实施例24 hbFGF突变蛋白的纯化
依据参考实例2所述方法培养产生不同突变蛋白的转化体，进而制备细菌细胞提取物。每种提取物（由500ml培养基制得）各取25ml通过已用含有20mM Tris-HCl（pH7.4）和0.2M NaCl的溶液平衡的DEAE纤维素柱（φ2×10cm）（DE52，Wattman，Inc.，UK），从而去掉提取物中的核酸组分。合并并收集柱流出液和用含有20mM Tris-HCl pH7.4和0.2M NaCl（DEAE流出液组分，60ml）的溶液洗柱所得到的洗出液。
对此组分进行高效液相层析，用以Shodex AF-Pak HR-894肝素装填的柱（8mmID×5cm，日本Showa Denko公司生产）。用pH值为7.4的20mM Tris-HCl溶液洗柱，然后再用含有20mM Tris-HCl（pH7.4）和0.5M NaCl的溶液洗，洗涤以后，用含有20mM Tris-HCl缓冲液（pH7.4）和0.5M-2M NaCl以线性梯度（60ml体积，1.0ml/min流速）进行洗脱。
图33-35给出了不同突变蛋白的洗脱曲线。在这些图中，纵坐标代表OD280吸光率和梯度中的NaCl浓度。横坐标代表时间，梯度洗脱在时间0点开始。收集峰组分，测定它们的FGF活性。表4给出了纯化后的比活性。
表4
突变蛋白 比活性（mg-ptFGF/mg蛋白）
CS1 0.4
CS2 0.9
CS3 1.0
CS4 1.0
CS12 0.5
CS13 0.5
CS14 0.3
CS23 1.1
CS24 0.8
CS34 0.5
CS123 0.4
CS124 0.1
CS134 0.5
CS234 0.9
CS1234 0.1
rhbFGF 1.0
在表4中，比活性是以牛脑FGF（纯度不小于95%，由Takara Shuzo Co，Ltd生产）的FGF活性为基础表示的。
在所有的突变蛋白中，相应于bFGF峰I的峰都是15-25分钟之间的洗脱时间内洗脱的。其可用17.25%SDS聚丙烯酰胺凝胶法，在分子量约为17，000处作为单一带被检测到。
实施例25 FGF突变蛋白的氧化
将由肝素HPLC柱上洗脱的每种突变蛋白及bFGF分别在1000倍体积的蒸馏水中于4℃透析2次，每次3小时，然后进行冷冻干燥。取每种干的标准样品各200ug（以蛋白为基础）溶于200μl氧化反应液中（50mMTris-HCl（pH8.5），/0.2MNaCl/1mg/ml BSA/20mM H2O2），氧化于37℃进行30分钟。
然后使溶液通过肝素HPLC柱，用0.6M至2M的盐梯度洗脱以检查洗脱曲线。所得洗脱曲线示于图36中。在图中，bFGF的峰一般较低;而CS2、CS3和CS23相应于峰I的峰则较高;在CS3和CS23中可明显观察到峰的上升。
这表明CS3和CS23对氧化作用稳定。此外，在所有CS2、CS3和CS23的例子中，洗脱的蛋白峰都表现有FGF活性。
实施例26 FGF突变蛋白的还原
将依照实施例25的同样方式获得的冷冻干燥的标准样品各200μg（基于蛋白重量）溶于200μl还原反应液中（50mM Tris-HCl（pH8.5）/0.2MNaCl，/1mg/ml BSA/20mM二硫苏糖醇），还原反应于37℃下进行30分钟。
然后使溶液通过肝素HPLC柱，用0.6M和2M的盐梯度进行洗脱以检查洗脱曲线。所得洗脱曲线示于图37中。在bFGF和CS2中，相应于峰I的峰明显可见，并表明其他峰（峰Ⅱ至Ⅳ）是由于氧化作用产生的。洗脱曲线还提示，CS3和CS23的峰没有受到氧化作用的影响。这就是说，这一图形支持实例25中提及的稳定性。发现以这些峰洗脱的bFGF和突变蛋白具有FGF活性。
实施例27 具有编码突变蛋白碱基顺序的重组DNA的生成（1）克隆用于人bFGF基因的M13载体：
用限制性酶EcoRⅠ和BamHⅠ消化参考实施例2得到的质粒pTB669。使复制型（RF）噬菌体载体M13mp8（J.Messing，Methods in Enzymology，101：20-78，1983）DNA与来自pTB669的人bFGF DNA片段混合（它们预先用EcoRⅠ和BalnHⅠ消化）。然后用T4DNA连接酶使混合物连接。用所得已接好的DNA转化大肠杆菌JM105菌株的可感染细胞;将转化体细胞涂布在平板上，并用Xgal作为指示剂（J.Messing et al，Nucleic Acids Res 9：309-321，1981）;挑出含有重组噬菌体的空斑（白色空斑）;依双脱氧核苷酸合成链终止法（J.Messing et al，Nucleic Acids Res 9：309，1981）分析重组区的碱基顺序，从而证实了人bFGF DNA已准确地插入其中。
由此M13-PO克隆纯化单链的噬菌体DNA，用它作为用合成寡核苷酸进行定位诱变的模板。
（2）定位诱变：
在0.1mMATP，50mMTris-HCl（pH8.0），10mM MgCl2，5mM DTT和9单位T4激酶的存在下，以50μl的总体积，于37℃用T4激酶将40微微摩尔合成的寡核苷酸：5′-CGGGCATGAATTCGCCGCT-3′（在碱基顺序中产生限制性酶EcoRⅠ识别位点并进而使Pro-14变为Met的引物，参见图38（2））处理1小时。将此激酶处理过的引物（12微微摩尔）在50μl含有50mM NaCl，1.0mM Tris-HCl（PH8.0），10mMMgCl2和10mM β-巯基乙醇的混合物中加热至67℃保持55分钟，然后于42℃保持25分钟，从而使引物与5μg单链（ss）M13-PO DNA杂交。然后在冰上冷却退火的混合物，并加至50μl含有0.5mM脱氧核苷三磷酸（dNTP），80mM Tris-HCl（pH7.4）、8mM MgCl2、100mM NaCl、9单位DNA聚合酶I Klenow片段，0.5mM ATP和2单位T4DNA连接酶的反应混合物中，于37℃下反应3小时，再于25℃反应2小时，然后加入2μl 0.2mM EDTA以终止反应。用反应产物转化可感染的JM105细胞;使这样得到的转化体细胞生长过夜，然后从培养基上清液中分离ssDNA。用此ssDNA作为模板使引物进行第2周期的延长，用经过凝胶纯化的RF型DNA转化可感染的JM105细胞;将所得转化体细胞铺敷在琼脂平板上，培养过夜以得到噬菌体空斑。
（3）定位诱变：
重复上述（2）中的程序，但所用的合成寡核苷酸引物为：
5′-CGCCCATGGTGCCATCCTC-3′，它在碱基顺序中产生一个限制性酶Ncol的识别位点，并同时将Gly-9变为Thr，将Ser-10变为Met（见图38（1））。
（4）定位诱变：
重复上述（2）中的程序，但所用的合成寡核苷酸引物为：
5′-TAACACCTTAAGAAGCCAG-3′，它在碱基顺序中产生一个限制性酶AflⅡ的识别位点，并同时将密码子Lys-87变为终止密码（参见图38（3））。
（5）定位诱变：
重复上述（2）中的程序，但所用的合成寡核苷酸引物为：5′-CCGGACTCCGTTAACTCGG-3′，它在碱基顺序中产生一个限制性酶HpaⅠ的识别位点，并同时将Asp-42变为Asn（见图38（4））。
（6）定位诱变：
重复上述（2）中的程序，但所用的合成寡核苷酸引物为：
5′-CTTCTCCTGGACTCCGTCAAC-3′，它去掉了碱基顺序中的限制性酶HpaⅡ的识别位点，并同时将Arg-45变为Gln（见图38（5））。
（7）诱变空斑的筛选和鉴别：
使含有突变的M13-PO空斑〔上述（1）〕的平板和2个含有未突变的M13-PO噬菌体空斑的平板冷却至4℃，将得自各平板的空斑转移至两个圆形硝化纤维素滤膜上，转移方法是将干的滤膜置于琼脂平板上，使第1滤膜保留5分钟，第2滤膜保留15分钟。然后，将滤膜在浸于0.2N NaOH，1.5M NaCl和0.2% Triton X-100中的厚滤纸上放置5分钟，此后，使它们在浸于0.5M Tris-HCl（pH7.5）和1.5M NaCl中的滤纸上再放置5分钟而使其中性化。将滤膜置于以同样方式浸在2XSSC（标准柠檬酸钠）中的滤膜上洗涤两次，使之干燥，然后在真空烘箱中于80℃干燥2小时。用10ml/滤膜pH为7.0的DNA杂交缓冲液（5XSSC）使重选的滤膜于55℃预杂交4小时，该预杂交缓冲液含有4×Denhardt氏溶液（聚乙烯吡咯烷酮、Ficoll和牛血清白蛋白，1×＝0.02%）、0.1%SDS、50mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA。与105cpm/ml的寡核苷酸引物在42℃下杂交24小时。每种滤膜均用洗涤缓冲液于50℃洗涤30分钟，该洗涤缓冲液含有0.1%SDS和数量减少了的SSC。然后，先用含有2×SSC的缓冲液洗涤滤膜;而含有未突变M13-PO空斑的对照滤膜则用盖革计数器检测其放射活性。用逐步降低了SSC浓度的缓冲液洗涤含有未突变M13-PO空斑的对照滤膜，直至滤膜上检测不到放射活性时为止。所用SSC的最小浓度为0.1×SSC。使滤膜在空气中干燥，并在-70℃下曝光2-3天进行放射自显影。使用在γ-32P-ATP存在下用激酶处理过的寡核苷酸作为探针，筛选10，000个突变的M13-PO空斑和100个未突变的对照空斑。没有一个对照空斑与探针杂交，而有3-10个突变的M13-PO空斑与探针杂交。
选取一个突变的M13-PO空斑，接种于JM105培养基上。由所得上清液中制备ssDNA，并由细菌细胞沉淀中制备双链（ds）DNA。利用合适的寡核苷酸引物和ssDNA进行碱基顺序分析。
其结果是，分别证实了GGC（Gly-9）密码子已变为ACC（Thr）密码子;AGC（Ser-10）密码子已变为ATG（Met）密码子;CCG（Pro-14）密码子变为ATG（Met）密码子;AAA（Lys-87）密码子变为TAA（终止）密码子;GAC（Asp-42）密码子变为AAC（Asn-42）密码子;CGG（Arg-45）密码子变为CAG（Gln-45）密码子。
在突变的M13-PO噬菌体中，将Gly-9密码子变为Thr密码子及Ser-10密码子变为Met密码子的噬菌体称为M13-PN10（图39给出了其碱基顺序及由其编码的氨基酸顺序）;将Pro-14密码子已变为Met密码子的噬菌体称为M13-PN14（其碱基顺序和由其编码的氨基酸顺序示于图40中）;将Lys-87密码子变为终止密码的噬菌体称为M13-PC86（其碱基顺序和由其编码的氨基酸顺序示于图41中）;将Asp-42密码子变为Asn密码子的噬菌体称为M13-PDN42（其碱基顺序和由其编码的氨基酸顺序示于图42中）;Arg-45密码子变为Gln密码子的噬菌体称为M13-PRQ45（其碱基顺序和由其编码的氨基酸顺序示于图43中）。
实施例28产生具有编码突变蛋白之碱基顺序的重组DNA
（1）定位诱变：
在0.1mM ATP，50mM Tris-HCl（pH8.0），10mM MgCl2，5mMDTT和9单位T4激酶的存在下，以50μl的总体积，用T4激酶将40徽徽摩尔合成的寡核苷酸：5′-CGGACTCCTCTAACTCGGC-3′（去掉碱基顺序中限制性酶HpaⅠ之识别位点并继而Asn-42变为Arg的引物，见图38（6））于37℃处理1小时。将此激酶处理过的引物在50μl含有50mM NaCl，1.0mM Tris-HCl（pH8.0），10mM MgCl2和10mM β-巯基乙醇的混合物中加热至67℃保持5分钟，然后42℃保持25分钟，从而使引物与5μg单链（ss）M3-PDN42DNA杂交。然后在冰上冷却退火的混合物，并加至50μl含有0.5mM脱氧核苷三磷酸（dNTP），80mM Tris-HCl（pH7.4），8mM MgCl2，100mM NaCl，9单位DNA聚合酶I Klenow片段，0.5mM ATP和2单位T4 DNA连接酶的反应混合物中，于37℃下反应3小时，再于25℃反应下2小时，然后加入2μl 0.2mM EDTA以终止反应。用反应产物转化可感染的JM105细胞;使这样得到的转化体细胞生长过夜，然后从培养基上清液中分离ssDNA。用此ssDNA作为模板使引物进行第2周期的延长，用经过凝胶纯化的RF型DNA转化可感染的JM105细胞;将得到的转化体细胞涂布在琼脂平板上，培养过夜以得到噬菌体空斑。
（2）诱变空斑的筛选和鉴别：
将含有依据实施例26的方法用合成的寡聚物（图38（6））使之突变了的M13-PDN42噬菌体空斑的平板和2个含有实例26得到的未突变M13-PDN42噬菌体空斑的平板冷却至4℃，并将得自各平板的空斑转移至两个圆形硝化纤维素滤膜上，转移方法是将干的滤膜置于琼脂平板上，使第1滤膜保留5分钟，第2滤膜保留15分钟。然后，使滤膜在浸于0.2N NaOH，1.5M NaCl和0.2%Triton X-100中的厚滤纸上放置5分钟，此后再使之在浸于0.5M Tris-HCl（pH7.5）和1.5M NaCl中的滤纸上放置5分钟而使其中性化。将滤膜置于以同样方式浸于2×SSC（标准柠檬酸钠）中的滤膜上洗涤两次，使之干燥，然后在真空烘箱中以80℃干燥2小时。用100ml/滤膜pH为7.0的DNA杂交缓冲液（5×SSC）使重迭的滤膜于55℃下预杂交4小时，该预杂交缓冲液含有4×Denhardt氏溶液（聚乙烯吡咯烷酮、Ficoll和牛血清白蛋白，1×＝0.02%）、0.1%SDS、50mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA。与105cpm/ml的寡核苷酸引物于42℃下杂交24小时。将各滤膜用洗涤缓冲液于50℃洗涤30分钟，该洗涤缓冲液含有0.1%SDS和数量减少的SSC。然后，先用含有2×SSC的缓冲液洗涤滤膜;而含有未突变M13-PDN42空斑的对照滤膜则用盖革计数器检测其放射活性。用逐步降低了SSC浓度的缓冲液洗涤含有未突变M13-PDN42空斑的对照滤膜，直至滤膜上检测不到放射活性时为止。所用SSC的最小浓度为0.1×SSC。使滤膜在空气中干燥，并在-70℃下曝光2-3天进行放射自显影。使用在γ-32P-ATP存在下用激酶处理过的寡核苷酸作为探针，筛选10，000个突变的M13-PDN42空斑和100个未突变的对照空斑。没有一个对照空斑与探针杂交，而有3-10个突变的M13-PDN42空斑与探针杂交。
选取一个突变的M13-P14空斑，接种于JM105培养基上。由所得上清液中制备ssDNA，并由细菌细胞沉淀中制备双链（ds）DNA。利用合适的寡核苷酸引物和ssDNA进行碱基顺序分析。
结果证实AAC（Asn-42）密码子已变为AGA（Arg）密码子。
在突变的M13-PDN42噬菌体中，将Asn-42密码子变为Arg密码子的噬菌体称为M13-PNR42。其碱基顺序和由其编码的氨基酸顺序示于图44中。
实施例29 突变蛋白CS2，CS3和CS23的稳定性
依下述方法测定通过肝素HPLC纯化的人bFGF和突变蛋白CS2、CS3和CS23（得自实例24）在酸性条件下的稳定性：将突变蛋白和人bFGF加入50mM乙酸钠（pH4.0）溶液中，浓度调到1μg/ml，分别在37℃下保温。保温时间以10分钟为间距，0-1小时之间不等，在不同的保温时间后用小鼠BALB/C3T3细胞系统（见上述）测定活性。计算不同保温时间的活性并用百分比表示之，以未保温的标准样品的活性作为100%，作图后得到如图45所示的曲线。在图45中，-●-，-▲-，-■-和-○-分别代表人bFGF、突变蛋白CS2、突变蛋白CS3和突变蛋白CS23的结果。人bFGF在10分钟内几乎完全失活，而突变蛋白保持活性的时间较长，CS2、CS3和CS23依次延长。突变蛋白甚至在20分钟以后还保留有大约50%的活性。结果证实这些突变蛋白比人bFGF有更大的稳定性。
实施例30 突变蛋白促进人脐带血管内皮细胞增殖的活性
测定通过肝素HPLC纯化的人bFGF和突变蛋白CS2、CS3和CS23（得自实例24）的促血管内皮细胞增殖活性。测定程序如下：经输注胰蛋白酶溶液从人脐带静脉中得到人血管内皮细胞，细胞通过传代培养维持，所用液体培养基是经向GIT培养基（由日本Daigo Eiyo KagaKu K、K、生产）中加入2.5%胎儿牛血清和2.0ng/ml人bFGF而制备的。在96孔培养平板（Nunc，1-67008）中各孔加入100μl含2×103个人血管内皮细胞的悬浮液，然后在充满二氧化碳的恒温室中培养。第二天，加入终浓度为2ng/ml的FGF和100μl含有不同浓度样品的培养基。培养3天以后，吸出含有样品的培养基，加入100μl浓度为1mg/ml的MTT溶液（该溶液是将3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5-二苯基-2H-四唑鎓溴化物溶于培养基中而制备的），保温4小时后再加入100μl浓度为10%的SDS溶液（十二烷基磺酸钠的水溶液），然后保温5-6小时以溶解细胞和MTT色素，之后，用分光光度计测定OD590。以百分比计算不同浓度样品的细胞增殖速率，以使用8.0ng/ml人bFGF获得的最大增殖速率为100%，将导致50%增殖速率的浓度和标准FGF样品的浓度相比较而确定比活性。这样测定的比活性示于表5中。
基于这些结果，发现突变蛋白的比活性高于人bFGF的比活性。
表5
FGF 比活性
C32 1.6
CS3 3.0
CS23 2.5
人bFGF 1.0
实施例31 用CAM法检测突变蛋白的血管形成能力
研究了由肝素HPLC纯化的人bFGF和突变蛋白CS2、CS3和CS23（得自实例24）在活体条件下的血管形成能力。用CAM（绒毛膜尿囊膜）法进行这一试验。在CAM检测中使用了稍加改动的Auerbach法（Developmental Biology 41∶391 1974）。将受精的鸡蛋在孵化箱中于37℃下保温3天后除去鸡蛋壳，用Napco二氧化碳孵箱6300（CO2：0%，H2O：饱和）于37℃下进一步保温一周。将每种蛋白的水溶液点在直径6mm的聚丙烯圆盘上，使每种蛋白的量分别为6.25，12.5，25.0和50.0ng。置于干净的干燥罐中使之空气干燥后，将圆盘置于鸡绒毛膜尿囊膜上于37℃下再保温3天，并借助体视显微镜观察血管形成状态。所得结果示于表6中。NB：每个样品使用了总共18个鸡蛋，表中数据是以观察到血管形成的鸡蛋数的百分率给出的。
表6
血管形成能力（％）
FGF 50.0 25.0 12.5 6.25ng
CS2 77.8 44.4 22.2 0.0
CS3 72.2 61.1 16.7 0.0
CS23 72.2 55.6 22.2 0.0
人bFGF 94.4 50.0 33.3 0.0
载体 11.1 5.6 11.1 0.0
从表6中明显可见，bFGF突变蛋白几乎具有和人bFGF对照组相等的血管形成能力。
实施例32编码人bFGF突变蛋白的基因在大肠杆菌中的表达
（1）构建用于人bFGF突变蛋白表达的质粒pTB854：
依实施例2（1）所述的方法处理上述实施例27得到的复制型（RF）M13－PN10，以构建用于人bFGF突变蛋白表达的质粒pTB854（图46）。
用此质粒pTB854转化大肠杆菌MM294，从而得到大肠杆菌MM294／pTB854,该菌株所携带的质粒pTB854含有如图39所示的编码突变蛋白的基因。
（2）细菌细胞提取物的制备：
依据实施例2（2）所述方法培养上述转化体以得到上清液，然后将其用作细菌细胞提取物。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
依据实施例2（3）所述方法，检测上述（2）得到细菌细胞提取物的人bFGF活性。
其结果是，大肠杆菌MM294／pTB854的细菌细胞提取物表现有FGF活性。
这样便得到了突变蛋白TM910，其中，人bFGF9位的Gly和10位的Ser已分别被Thr和Met所取代。
实施例33 编码人bFGF突变蛋白的基因在大肠杆菌中的表达
（1）构建用于人bFGF突变蛋白表达的质粒pTB852：
用限制性酶EcoRI和NcoI切割上述实施例32得到的质粒pTB854 DNA以去掉编码人bFGF N末端10个氨基酸线基的DNA片段，在dATP、dCTP、dGTP\dTTP存在下利用大肠杆菌DNA聚合酶I，使剩余的DNA片段的单链部分封闭成平头并通过T4 DNA连接酶反应使之连接，以构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB852(图47）。
用此质粒852转化大肠杆菌MM294,从而得到大肠杆菌MM294／pTB852, 该菌株所携带的质粒pTB852含有如图48所示的编码突变蛋白的基因。
（2）细菌细胞提取物的制备：
依据实施例2（2）所述方法培养上述转化体以得到上清液，然后以其作为细菌胞提取物使用。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
依据实施例2（3）所述方法，检测上述（2）得到的细菌细胞提取物的人bFGF活性。
其结果是，大肠杆菌MM294／pTB852的细菌细胞提取物表现有FGF活性。这样便得到了突变蛋白N10，其中，人bFGF中从2位Pro至10位Ser的氨基酸顺序已经缺失。
实施例34 编码人bFGF突变蛋白的基因在大肠杆菌中的表达（1）构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB795：
依实施例2（1）所述的方法处理上述实施例27得到的复制型（RF）M13-PN14，以构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB795（图49）。
用此质粒pTB795转化大肠杆菌MM294，从而得到大肠杆菌MM294/PTB795（IFO14700，FERM BP-1660），该菌株所携带的质粒PTB795含有图40所示的编码突变蛋白的基因。（2）细菌细胞提取物的制备;
依据实施例2（2）所述方法培养上述转化体以得到上清液，用以作为细菌细胞提取物。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
依据实施例2（3）所述的方法，检测上述（2）得到的细菌细胞提取物的人bFGF活性。
其结果是，大肠杆菌MM294/pTB795的细菌细胞提取物表现有FGF活性。这样便得到了突变蛋白N14，其中，人bFGF中从2位Pro至14位Pro的氨基酸顺序已经缺失。
实施例35 编码人bFGF突变蛋白的基因在大肠杆菌中的表达
（1）构建用于人bFGF突变蛋白表达的质粒pTB796：
依实施例2（1）所述的方法处理上述实施例27得到的复制型（RF）M13-PC86，以构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB796（图50）。
用此质粒pTB796转化大肠杆菌MM294，从而得到大肠杆菌MM294/pTB796（IFO 14701，FERM BP-1661），该菌株携带的质粒pTB796中含有如图41所示的编码突变蛋白的基因。
（2）细菌细胞提取物的制备：
依据实施例2（2）所述的方法培养上述转化体以得到上清液，用此作为细菌细胞提取物。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
利用单克隆抗体通过夹心法对上述（2）得到的细胞提取物进行酶免疫检测（EIA），具体步骤如下列（a）至（j）所述。
其结果是，证实了细胞提取物中含有bFGF突变蛋白C86。这样便得到了突变蛋白C86，其中，从87位Lys至147位Ser的氨基酸顺序已经缺失。
按下述方法使用单克隆抗体进行上述EIA分析：
（a）免疫：
向BALB/c小鼠（雄性，4周龄）腹腔内注射0.4ml加有人bFGF抗原（如参考实例2中得到的）Freund氏完全佐剂（Difco Laboratories，USA）溶液。再隔三周以后，再次进行同样的免疫注射，两周以后，腹腔内接种10μg溶于生理盐水的人bFGF溶液。
（b）细胞融合：
最后一次用抗原攻击后4天，切除上述经免疫的小鼠的脾脏以得到用于细胞融合的细胞。将这些细胞悬浮在培养基中，该培养基是通过将Isokov培养基和Ham F-12培养基以1∶1的比例混合而制备的（下文简称IH培养基）。
小鼠骨髓瘤细胞P3-X63-Ag 8UI在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中于5%二氧化碳和95%空气条件下进行传代培养。
依据Kohler和Milstein建立的方法（Kohler，Gand Milstein，C，Nature 256：495，1975）进行细胞融合。将2.9×107个上述骨髓瘤细胞系的细胞与通过上述方法得到的1.5×108个免疫的淋巴细胞混合并离心，逐滴加入在0.3ml IH培养基中含45%聚乙二醇6000（下文称PEG6000）的溶液。将PEG6000溶液预加热到37℃并逐步加入。5分钟以后，以0.5ml/分的速率加入37℃预热的IH培养基至10ml。然后将溶液于室温下以600rpm离心15分钟，去掉上清液。将此细胞沉淀悬浮于含有20%小牛血清的200ml IH培养基中，此悬浮液以每孔2ml移入24孔微量滴定板（Linbro）各孔中。一天以后，以每孔1ml的量在微量滴定板各孔中加入添加了HAT（1×10-4次黄嘌呤4×10-7M氨基蝶呤，1.6×10-5M胸苷）（下文称HAT培养基）的IH培养基（含有20%小牛血清），再过三天以后，将其中半量的培养基换成HAT培养基。这样培养的细胞是杂交细胞。
（c）寻找产生抗体的细胞：
首先将杂交细胞培养物上清液以每孔100μl的量加入聚苯乙烯制成的96孔微量滴定板各孔内，（各孔内先已固定了人bFGF）并于室温下保温2小时。去掉保温上清液，洗涤之后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠IgG抗体（Miles Laboratories）作为第二抗体并于室温下保温2小时。去掉第二抗体，充分洗涤小孔之后加入反应底物以进行显色反应（EIA法）。通过这种方法，观察到在3个孔中有高效价的抗原抗体反应。
（d）杂交细胞的克隆：
先在96孔微量滴定板的各孔内以每孔接种104个小鼠胸腺细胞作为营养细胞，然后以每孔各0.5个细胞接种这三种细胞，并进行克隆。其结果是，得到了三个克隆，即小鼠杂交瘤HbF52（IFO50143）和小鼠杂交瘤HbF78（IFO 50144）。
（e）杂交细胞的腹水化
小鼠杂交瘤HbF52或小鼠杂交瘤HbF78各2×106个细胞接种于预先腹腔注射了矿质油的小鼠腹腔内。10天以后，从每只小鼠的腹腔内各收集2ml腹水，从而分别得到单克隆抗体MoAb52和单克隆抗体MoAb78。
（f）根据Stachelin等人的方法（J.Biol.Chem 256：9750，1981），从腹水中纯化所得到的单克隆抗体MoAb78。将这样得到的抗体浓缩至2mg/ml以上，并使之在0.2M磷酸缓冲液（pH7.0）中透析。在这样得到的1.4ml MoAb78溶液中（浓度为2.8mg/ml），加入溶于N，N′-二甲基甲酰胺中的50μl S-乙酰巯基琥珀酸酐（Aldrich Co，USA）使之浓度为11.5mg/ml。用氮气取代反应容器中的空气。密封容器并搅动容器以产生引入SH基的反应。用130μl 0.2M Tris-HCl（pH7.0）、13μl 0.2M EDTA和130μl 2M羟胺（pH7.0）处理10分钟，使未反应的S-乙酰巯基琥珀酸酐失活。使用Sephadex G-25装填的柱（直径1cm×80cm，Farmacia，Sweden），通过凝胶过滤回收MoAb78（流速：20ml/小时）。
（g）将10mg辣根过氧化物酶（HRP，Behringer Manheim，Grade I，West Germany）溶于1.4ml 0.1M磷酸缓冲液中（pH6.8）。另一方面，将14mg N-（4-羧基环己基甲基）马来酰胺的N-羟基琥珀酰胺酯溶于335μl DMF中，100μl这样得到的溶液加入上述HRP溶液中。用氮气取代反应容器中的空气，密封容器。室温下反应1小时后，利用Sephadex G25装填的柱，依上述（f）所述经凝胶过滤回收已引入SH基的单克隆MoAb78部分的蛋白。
（h）使上述（f）得到的6ml引入了SH基的单克隆抗体MoAb78与上述（g）得到的2ml引入了马来酰胺基团的HRP混合，使用火棉胶袋（Sartorius，West Germany）于4℃下经20小时将混合物减压浓缩至1ml。反应以后，使用Ultrogel AcA44（LKB Co.，直径1cm×80cm，Sweden）柱除去引入了巯基而未反应的HRP（流速：10ml/小时）。在洗脱物中，含有2.4HRP/抗体的组分中每个抗体分子带有最高的HRP数。将这样得到的产物用于下述（i）中的EIA中。
（i）根据上述（f）所述方法纯化上述（e）得到的单克隆抗体MoAb52。单克隆抗体MoAb52用PBS稀释至10μg/ml或20μg/ml，将抗体稀释液以100μl/孔加至免疫平板中（Nunc.Denmark）。将平板置于4℃过夜以使单克隆抗体MoAb52吸附在平板上。去掉未吸附的抗体后，用PBS洗涤平板三次，向平板中以200μl/孔加入含有0.01%硫柳汞和1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS并将平板置于4℃过夜。
（j）用含有0.1% BSA的PBS稀释上述（2）得到的含有bFGF突变蛋白C86的细胞提取物。从上述（i）得到的平板上去掉BSA溶液，平板用PBS洗涤4次，将稀释的bFGF突变蛋白C86以100μl/孔加在平板上，于4℃过夜使之吸附在平板上。去掉未反应的突变蛋白C86，平板用PBS洗涤4次。用含有0.1%BSA的PBS将上述（h）得到的连接有HRP的单克隆抗体稀释至1/300，将稀释液以100μl/孔加在平板上。于室温下反应4小时。去掉抗体以后，平板用PBS洗涤6次，每孔加入100μl氧化酶底物（Bio.Rad Co，USA）。检测415nm处吸光率以完成定量测定，进一步证实产生了小量的突变蛋白C86。
实施例36 编码人bFGF突变蛋白的基因在大肠杆菌中的表达
（1）构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB797：
依实施例2（1）所述的方法处理上述实施例27得到的复制型（RF）M13-PDN42，以构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB797（图51）。
用此质粒pTB797转化大肠杆菌MM294，从而得到大肠杆菌MM294/pTB797（IFO 14702，FERM BP-1662），该菌株所携带的质粒pTB797含有如图42所示的编码突变蛋白的基因。
（2）细菌细胞提取物的制备：
依据实施例2（2）所述的方法培养上述转化体以得到上清液，用其作为细菌细胞提取物使用。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
依据实施例2（3）所述的方法，检测上述（2）得到的细菌细胞提取物的人bFGF活性。
其结果是，大肠杆菌MM294/pTB797的细菌细胞提取物表现有FGF活性。这样便得到了突变蛋白DN42，其中，人bFGF中的42位Asp已被Asn所取代。
实施例37 编码人bFGF突变蛋白的基因在大肠杆菌中的表达
（1）构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB799：
依实施例2（1）所述的方法处理上述实施例27得到的复制型（RF）M13-PRQ45，以构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB799（图52）。
用此质粒pTB799转化大肠杆菌MM294，从而得到大肠杆菌MM294/pTB799，该菌株所携带的质粒pTB799含有如图43所示的编码突变蛋白的基因。
（2）细菌细胞提取物的制备：
依据实施例2（2）所述的方法培养上述转化体以得到上清液，然后用其作为细菌细胞提取物使用。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
依据实施例2（3）所述方法，检测上述（2）得到的细菌细胞提取物的人bFGF活性。
其结果是，大肠杆菌MM294/pTB799的细菌细胞提取物表现出FGF活性。这样便得到了突变蛋白RQ45，其中，人bFGF的45位Arg已由Gln所取代。
实施例38 编码人bFGF突变蛋白的基因在大肠杆菌中的表达
（1）构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB798：
依实施例2（1）所述的方法处理上述实施例28得到的复制型（RF）M13-PNR42，以构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB798（图53）。
用此质粒pTB798转化大肠杆菌MM294，从而得到大肠杆菌MM294/pTB798，该菌株所携带的质粒pTB798含有如图44如示的编码突变蛋白的基因。
（2）细菌细胞提取物的制备：
依据实施例2（2）所述的方法培养上述转化体以得到上清液，并用以作为细菌细胞提取物使用。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
依据实施例2（3）所述的方法，检测上述（2）得到的细菌细胞提取物的人bFGF活性。
其结果是，大肠杆菌MM294/pTB798的细菌细胞提取物表现出FGF活性。这样便得到了突变蛋白NR42，其中，人bFGF中42位Asp已被Arg所取代。
实施例39 产生具有编码突变蛋白碱基顺序的重组DNA
（1）定位诱变：
在0.1mM ATP，50mM Tris-HCl（pH8.0），10mM MgCl2，5mM DTT和9单位T4激酶的存在下，以50μl的总体积，用T4激酶于37℃将40微微摩尔的合成寡核苷酸：5′TCTTCTCCAGGGATCCGTT-3′（在碱基顺序中加入限制性酶BamHI之识别位点，并继而使Val-44变为Ser、Arg45变为Leu的引物，参见图38（7））处理1小时。将此激酶处理过的引物在50μl含有50mM NaCl，1.0mM Tris-HCl（pH8.0），10mM MgCl2和10mM β-巯基乙醇的混合物中加热至67℃保持5分钟，然后42℃保持15分钟，从而使引物与5μg单链（ss）M3-PDN42 DNA杂交。然后在冰上冷却退火的混合物，并加至50μl含有0.5mM脱氧核苷三磷酸（dNTP），80mM Tris-HCl（pH7.4），8mM MgCl2，100mM NaCl，9单位DNA聚合酶I Klenow片段，0.5mM ATP和2单位T4 DNA连接酶的反应混合物中，于37℃下反应3小时，再于25℃反应2小时，然后加入2μl 0.2mM EDTA以终止反应。用反应产物转化可感染的JM105细胞;使这样得到的转化体细胞生长过夜，然后从培养基上清液中分离ssDNA。用此ssDNA作为模板使引物进行第2周期的延长，用经过凝胶纯化的RF型DNA转化可感染的JM105细胞，将所得转化体细胞涂布在琼脂平板上，培养过夜以得到噬菌体空斑。
（2）诱变空斑的筛选和鉴别：
将含有依据实例27的方法用合成的寡聚物（寡核苷酸）〔图38（7）〕使之突变了的M13-PDN42噬菌体空斑的平板和2块含有实例26得到的未突变的M13-PDN42噬菌体空斑的平板冷却至4℃，将得自各平板的空斑转移至两个圆形硝化纤维素滤膜上，转移方法是将干的滤膜置于琼脂平板上，第1滤膜保留5分钟，第2滤膜保留15分钟。然后，使滤膜在浸于0.2N NaOH，1.5M NaCl和0.2%Triton X-100中的厚滤纸上放置5分钟，此后，使它们在浸于0.5M Tris-HCl（pH7.5）和1.5M NaCl中的滤纸上再放置5分钟而使其中性化。将滤膜置于以同样方式浸在2×SSC（标准柠檬酸钠）中的滤膜上洗涤两次，使之干燥，然后在真空烘箱中以80℃干燥2小时。用100ml/滤膜pH为7.0的DNA杂交缓冲液（5×SSC）使重迭的滤膜于55℃下预杂交4小时，该预杂交缓冲液含有4×Denhardt氏溶液（聚乙烯吡咯烷酮、Ficoll和牛血清白蛋白，1X＝0.02%）、0.1% SDS、50mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA。42℃与105cpm/ml的寡核苷酸引物杂交24小时，各滤膜均用洗涤缓冲液于50℃洗涤30分钟，该洗涤缓冲液含有0.1% SDS和数量减少了的SSC。然后，先用含有2×SSC的缓冲液洗涤滤膜，而含有未突变M13-PDN42空斑的对照滤膜则用盖革计数器检测其放射活性。用逐步降低的SSC浓度的洗涤缓冲液洗涤含有未突变M13-PDN42空斑的对照滤膜，直至滤膜上检测不到放射性时为止。所用SSC的最小浓度为0.1×SSC。使滤膜在空气中干燥，在-70℃下曝光2-3天进行放射自显影。使用在γ-32P-ATP存在下用激酶处理的寡核苷酸作为探针，筛选10，000个突变的M13-PDN42空斑和100个未突变的对照空斑。没有一个对照空斑与探针杂交，而有3-10个突变的M13-PDN42空斑与探针杂交。
选取一个突变的M13-PDN42空斑，接种于JM105培养基上。由所得上清液中制备ssDNA，从细菌细胞沉淀中制备双链（ds）DNA。利用合适的寡核苷酸引物和ssDNA进行碱基顺序分析。
其结果是，证实了GTC（Val-44）密码子和CGG（Arg-45）密码子已分别变为TCC（Ser）密码子和CTG（Leu）密码子。
在突变的M13-PDN42噬菌体中，将Val-44密码子和Arg-45密码子已分别变为Ser密码子和Leu密码子的噬菌体称为M13-PINT。其碱基顺序和由其编码的氨基酸顺序示于图54中。
（3）构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB853：
依实施例2（1）所述的方法处理上述（2）得到的复制型（RF）M13-PINT，以构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB853（图55）。
用此质粒pTB853转化大肠杆菌MM294，从而得到大肠杆菌MM294/pTB853，它所携带的质粒pTB853含有图54中所示的编码突变蛋白的基因。
（4）细菌细胞提取物的制备：
依据实施例2（2）所述的方法培养上述转化体以得到上清液，并将其用作细菌细胞提取物使用。
（5）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
依据实例2（3）所述的方法，检测上述（4）得到的细菌细胞提取物的人bFGF活性。
其结果是，大肠杆菌MM294/pTB853的细菌细胞提取物表现有FGF活性。这样便得到了突变蛋白FINT，其中，人bFGF的42位Asp、44位Val和45位Arg已分别被Asn、Ser和Leu所取代。
实施例40 编码人bFGF突变蛋白的基因在大肠杆菌中的表达
（1）构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB855：
用限制性酶HincⅡ切割上述参考实施例2得到的质粒pTB669 DNA，并通过T4 DNA连接酶反应使之与EcoRⅠ连接子p（5′CATGAATTCATG3′）连接。将这样得到的DNA进一步用限制性酶EcoRⅠ和PstⅠ切割以回收长约0.35kb的DNA片段。使此DNA片段与实施例2（1）得到的大约3.2kb的DNA片段连接，（此片段是用EcoRⅠ-PstⅠ切割质粒ptrp781而得到的），从而构建得到了用于人bFGF突变蛋白表达的质粒pTB855（图56）。
用此质粒855转化大肠杆菌MM294，从而得到大肠杆菌MM294/pTB855，它所携带的质粒含有如图57中所示的编码突变蛋白的基因。
（2）细菌细胞提取物的制备：
依据实施例2（2）所述方法培养上述转化体以得到上清液，然而用其作为细菌细胞提取物使用。
（3）细菌细胞提取物的人bFGF活性：
依据实施例2（3）所述的方法，检测上述（2）得到的细菌细胞提取物的人bFGF活性。
其结果是，大肠杆菌MM294/pTB855的细菌细胞提取物表现有FGF活性。这样便得到了突变蛋白N41，其中，人bFGF的从2位Pro至41位Val的氨基酸顺序已经缺失。
实施例41 编码人bFGF突变蛋白的基因在大肠杆菌中的表达
（1）构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB856：
用限制性酶BamHⅠ部分切割上述参考实施例2得到的质粒pTB669 DNA，以在bFGF基因中产生BamHⅠ识别位点。在dATP、dCTP、dGTP、dTTP的存在下，进一步用大肠杆菌DNA聚合酶I将该位点切成平头。通过T4 DNA连接酶反应使此DNA与NheⅠ连接子p（5′CTAGCTAGCTAG3′）连接。用限制性酶NheⅠ处理并通过T4 DNA连接酶反应使两切点相连接，以构建成用于人bFGF突变蛋白表达的质粒pTB856（图58）。
用此质粒pTB856转化大肠杆菌MM294，从而得到大肠杆菌MM294/pTB856，它所携带的质粒pTB856具有如图59所示的编码突变蛋白的基因。
（2）细菌细胞提取物的制备：
依据实施例2（2）的方法培养上述转化体以得到上清液，并将其作为细菌细胞提取物使用。
（3）依据实施例35（3）所述方法，用夹心法对上述（2）得到的细胞提取物进行酶免疫检测（EIA）。其结果是，证实了细胞提取物中存在有bFGF突变蛋白。这样便得到了突变蛋白C129，其中，从130位Lys至147位Ser的氨基酸顺序已经缺失。
实施例42 编码人bFGF突变蛋白的基因在动物细胞中的表达
（1）构建用于表达人bFGF突变蛋白的质粒pTB831、pTB833和pTB835：
用限制性酶EcoRⅠ-BamHⅠ切割上述实施例7得到的质粒pTB762，得到一含有编码人bFGF突变蛋白CS23之编码区的0.38kb DNA片段，此突变蛋白中的70位和88位Cys已被Ser所取代。
另一方面，用限制性酶ClaⅠ-EcoRⅠ切割质粒pTB504〔日本62-175182号待批专利的实例1（ⅱ），此申请相当于欧洲专利公开225，701号〕，得到1.7kb DNA片段，它含有鼠白血病病毒（MuLV）的LTR区、SV40早期启动子、拼接接点和人白细胞间素-2（IL-2）前导顺序。
进一步用限制性酶ClaⅠ-EcoRⅠ切割参考实施例1得到的质粒pTB627，得到2kb的DNA片段：用限制性酶ClaⅠ-EcoRⅠ切割质粒pTB389，得到2.6kb的DNA片段。使这样得到的2kb DNA片段与2.6kb DNA片段连接而产生编码人bFGF的质粒pTB675。上述质粒pTB389依下述方法得到：将质粒pTB106（公开于日本待批专利61-63282号中，它相应于欧洲专利公开172，619号）中白细胞间素-2基因区之5′-端的各PstⅠ切点和3′-端的BamHI切点转化成EcoRⅠ切点，以去掉白细胞间素-2基因区。然后，用限制性酶ClaⅠ-BamHⅠ切割质粒pTB675，产生一含有人bFGF C末端氨基酸的编码区、一个非编码区、来自质粒pBRE322的氨苄青霉素抗性基因和大肠杆菌之复制起点的3.4kbDNA片段。
利用T4 DNA连接酶连接上述3个DNA片段（即0.38kb DNA片段、1.7kb DNA片段和3.4kb DNA片段），以得到质粒pTB831（图60）。
同样，用实施例18得到的编码人bFGF突变蛋白CS14（其中，人bFGF26和93位的Cys被Ser所取代）的质粒pTB763，或实例11得到的编码人bFGF突变蛋白CS1234（其中，人bFGF的26、70、88和93位Cys已被Ser所取代）的质粒pTB765代替上述程序中的质粒pTB762，从而分别构建成质粒pTB833和质粒pTB835。
（2）在动物细胞中表达：
将猿猴COS7细胞接种于其中加有10%胎儿牛血清之DMEM培养基的直径为6cm的组织培养皿中，并于24小时以后换新的培养基。4小时以后，按照磷酸钙法（Graham et al，Virology 52：456，1973）将质粒pTB831、pTB833或pTB835的10μg DNA转染到COS7细胞中。第二天，用含有1%胎儿牛血清的DMEM培养基培养48小时以后，收集含有细胞的培养液并回收细胞。细胞用PBS洗涤2次，然后悬浮于PBS中。对悬浮液作短时间超声处理，然后以15，000rpm离心15分钟得到上清液。
依据实例2（3）所述的方法，检测用质粒感染的COS7细胞的培养液及细胞提取物的人bFGF活性。所得结果示于表7中。
表7
FGF活性（ng/平皿）
质粒 突变蛋白 培养液 细胞提取物
pTB831 CS23 115 420
pTB833 CS14 0.2 35
pTB835 CS1234 1.1 20
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