一种注射用人体软组织填充剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种组织填充剂及其制备方法，更具体地说，是一种注 射用人体软组织填充剂及其制备方法。
背景技术
人体软组织填充的历史可追溯到十九世纪。最初注射用人体填充剂 采用的填充材料为异物材料，包括因副作用而弃用的石蜡和硅氧烷溶 液。随后又应用外源性蛋白作为填充材料，尤其是牛的胶原蛋白填充剂， 这种填充剂可以立刻得到治疗效果，但三到六个月内被组织消化吸收。 对应用过牛胶原蛋白的受试者调查表明，一个处理过程的效果一般只能 持续4-6月，且外源性蛋白材料会出现过敏反应。
美国市场上也出现过一种称为FIBREL的软组织填充剂，它是明胶 粉末和氨基乙酸以及受治者的血浆的混合物，它对部分受治者有效，但 易出现注射部位团块和疗效不持久等问题。
美国Q-Med Scandivavia公司商品名为Restyland的透明质酸 (Haluronic acid、HA)2003年12月12日获得了美国FDA的批准，作为 除皱注射剂。透明质酸是一种葡聚糖醛酸，广泛存在于胎盘、晶状体、关 节软骨、皮肤真皮层等组织，对组织和细胞起润滑和滋养作用，同时提供 组织代谢的体液环境。透明质酸的优点为天然成分，安全，无副作用，但 其维持时间一般只有6个月。
上述材料在使用中直接填充至所需部位，其具有迅速见效的特点， 但存在合成材料的安全性问题，以及生物提取材料逐渐被人体吸收而使 处理效果维持时间短的问题。
随着组织工程技术的发展，出现了自体组织活体材料填充剂。
中国专利03155833.X中公开了一种除皱祛疤的注射剂，应用了自 体皮肤，经体外分离、培养和扩增，制成于葡萄糖液中的一种注射剂， 治疗疤痕和祛除皱纹。由于该技术使用的生物材料取自患者自体，无排 斥反应，效果持久，但该技术的不足之处是，注射剂中能立即发挥人体 软组织的填充和修复功能的胶原蛋白含量较低，导致注射到疤痕和皱纹 处后见效较慢，一般要4-6个月；另外，使用动物血清作为培养液的成 分也可能存在安全性方面的问题。
自体组织活体材料填充剂由于含有能够产生自体胶原蛋白的细胞， 其效果较非活体材料更持久，一般可达到5-10年，但因为胶原蛋白是 由细胞逐渐分泌的，注射后不能立即见效。
迄今为止，现有技术中尚未发现快速见效且疗效持久的注射用人体 软组织填充剂。
发明内容
为了克服上述注射用人体软组织填充剂的不足，本发明的目的在于 提供一种快速见效、疗效持久、受术者满意度更高的注射用人体软组织填 充剂。
本发明的另一个目的是提供这种注射用填充剂的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种注射用人体软组织填充剂，其主要由细胞成分与透明质酸配 成，每毫升注射用填充剂中细胞成分的含量为1000-5000万个，透明质 酸的含量为2.0-30毫克；所述细胞成分是指采用治疗者自体的皮肤经 过体外低血清或无血清培养和扩增，收集得到的真皮成纤维干细胞、成 纤维前体细胞、成纤维细胞中的至少一种。
优选地，在本发明所述填充剂中，所述的经培养和扩增后收集到的 真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞的数量之比为10-20∶ 50-70∶20-30。
用于本发明的透明质酸可以是非动物源性材料，也可以是从动物组 织中提取的透明质酸的衍生物，无免疫原性，为医药级产品，一般为透 明质酸钠，但优选非动物源性透明质酸。
优选地，在本发明所述填充剂中，透明质酸的含量为3至25毫克/ 毫升注射用填充剂，进一步优选20毫克/毫升注射用填充剂。
本发明所述的填充剂除了细胞成分和透明质酸之外，还可以含有一 些辅助成分，所述辅助成分可以是本领域常见的能够加入到填充剂中的 任何一种或多种成分，如自体胶原蛋白、维生素、葡萄糖、等渗生理盐 水等等。
本发明使用的低血清培养基仅需添加3％～5％胎牛血清，而传统培 养基通常须加入约10％的胎牛血清，低血清培养基对于细胞生长、增殖、 形态、活性和功能没有不良影响，甚至有所改善。
此外，本发明还提供了一种所述注射用人体软组织填充剂的制备方 法，该方法包括下列步骤：
(1)采用治疗者自体的皮肤进行体外低血清或无血清培养和扩增， 对所得到的真皮成纤维干细胞、成纤维前体细胞、成纤维细胞进行收集；
(2)将收集到的细胞成分与透明质酸配成注射用人体软组织填充 剂。
本发明所采集的皮肤组织可以是从耳后、切眼袋、切眉或者其它部 位所得到的皮肤，同时包括表皮和真皮。
在本发明所提供的填充剂制备方法中，将来源于治疗者自体的少量 皮肤，例如，1-30平方毫米的皮肤，在加入了生长因子和活性材料的低 血清或无血清培养液中进行体外培养和扩增，得到真皮成纤维干细胞、 成纤维前体细胞、成纤维细胞。
所述体外低血清或无血清培养和扩增中，所述培养液的组成可以是 本领域常用的基础培养液。优选地，在体外低血清或无血清培养和扩增 过程中，使用的培养液中还包括生长因子和活性材料。所述生长因子为 上皮生长因子、成纤维生长因子；所述活性材料为氢化可的松、肝素。 所述上皮生长因子在培养液中的含量可以为1至5纳克/毫升，优选为3 纳克/毫升；所述成纤维生长因子在培养液中的含量可以为2至20纳克 /毫升，优选为10纳克/毫升；所述氢化可的松在培养液中的含量可以 为0.2至2微克/毫升，优选为1微克/毫升；所述肝素在培养液中的含 量可以为2至20微克/毫升，优选为10微克/毫升。上述的培养液和生 长因子及活性材料可以是选自一个公司或者多个公司(如美国的 Cascade公司、Sigma公司、Hyclne公司等)的市售产品。
在本发明所提供的填充剂制备方法中，所述体外培养和扩增可采用 本领域常见的任何用于为获得自体细胞的体外培养和扩增方法，如组织 消化培养法、组织块培养法等，优选采用组织块培养法。
下面进一步详细说明本发明所提供的填充剂制备方法，但本发明并 不因此而受到任何限制。
1、自体皮肤取材
用酒精消毒取材部位，进行局部表面麻醉。用取皮器或手术刀和手 术剪刀将1-30平方毫米的表皮和真皮组织取下，放入组织保存液中。 将创伤部位做一到三针缝合，创可贴覆盖。也可以采用面部整形手术时 切除的多余皮肤组织块，如手术切除眼袋或切眉所得到的皮肤。
2、皮肤组织培养前处理
将皮肤组织块放置于培养皿中清洗上皮部位，然后去除皮下组织和 脂肪，将皮肤组织剪碎为0.1-0.5平方毫米的皮肤碎片，最后将皮肤碎 片平铺于培养皿的底面。另外，对于通过做切眼袋、切眉手术或者其它 部位获得的大于4平方毫米的皮肤组织，可首先将皮肤组织块用胰酶液 消化一段时间，再将消化后的组织块剪碎平铺于培养皿的底面。
3、细胞体外培养
包括原代细胞培养和传代细胞培养两个步骤。
原代培养：在已平铺皮肤碎片的培养皿中加入DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)和低血清或无血清培养液进行培养，使细胞 扩增到50％-90％的培养皿底面即可进行传代培养。
传代培养：在原代培养的基础上加入生长因子(如上皮生长因子、 成纤维生长因子等)和活性材料(如氢化可的松、肝素等)，培养2-8周， 大约培养扩增至1500万-2亿个细胞。
上皮生长因子在培养液中的含量可以为1至5纳克/毫升，优选为 3纳克/毫升；所述成纤维生长因子在培养液中的含量可以为2至20纳 克/毫升，优选为10纳克/毫升；所述氢化可的松在培养液中的含量可 以为0.2至2微克/毫升，优选为1微克/毫升；所述肝素在培养液中的 含量可以为2至20微克/毫升，优选为10微克/毫升。
采用本领域常用的细胞培养条件即可，如可将从组织块培养出的真 皮细胞(含成纤维干细胞、成纤维前体细胞和成纤维细胞)用上述的低 血清或无血清培养液在温度为37℃，5％的CO2细胞培养箱中培养，每3-4 天换上述培养液一次，直至得到所需的细胞成分的含量。
4、填充剂配制
将培养数量达到要求的细胞首先使用胰蛋白酶进行消化处理，使其 脱离培养皿底面，在使用无外源性蛋白的DMEM清洗数次，去除外源性 生长因子和活性物质。再将收集到的细胞与少量胶原蛋白直接加入透明 质酸中，混匀，配成注射填充剂，或者将收集到的细胞与含有葡萄糖、 维生素等其它适用成分混和后再加入透明质酸，每毫升注射用填充剂中 细胞成分的总个数为1000-5000万个，透明质酸的含量为2.0-30mg/ml。 所述的配制过程可采用本领域常规方法，如在无菌的条件下，将透明质 酸溶解到细胞液中。
与现有技术相比，本发明的注射用人体软组织填充剂包含了大量的 透明质酸，在注射部位能快速产生填充除皱和修复效果；随后，注射填 充剂中含有的细胞成分能不断地分泌出胶原蛋白，保持填充和修复的效 果。该注射用人体软组织填充剂在注射后可快速出现明显的填充和修复效 果，且疗效持久。此外，本发明的注射用人体软组织填充剂在制备过程中 使用了低血清或无血清培养，外源性免疫原性物质含量极低，大大降低了 注射后感染动物源性疾病和发生过敏的危险。且由于透明质酸对细胞起润 滑和滋养作用，可诱导细胞生成胶原蛋白纤维并使组织再生，使除皱和修 复效果更加自然。
因此，本发明的注射用人体软组织填充剂可广泛用于美容、改善皮 肤弹性和光泽以及其它部位和类型的填充和修复中，包括处理由于真皮 缺损而导致的各种症状，例如面部皱纹、凹陷性疤痕、妊娠纹、手背皱 纹等，还可用于丰唇、增强真皮厚度和改善皮肤基质等。
附图说明
图1是培养成功的真皮细胞在100倍光学显微镜下形态学照片；
图2是本发明的一个具体实施例的注射用人体软组织填充剂在100 倍光学显微镜下形态学照片；
图3和图4是本发明的一个具体实施例治疗额头纹前后的对比照 片；
图5和图6是本发明的一个具体实施例治疗眼周纹前后的对比照 片；
图7和图8是本发明的一个具体实施例治疗眉间纹前后的对比照 片；
图9和图10是本发明的一个具体实施例治疗凹陷性疤痕前后的对 比照片；
图11和图12是本发明的一个具体实施例治疗鼻唇沟前后的对比照 片。
具体实施方式
下面进一步详细说明本发明所提供的注射用人体软组织填充剂及 其制备方法，但本发明并不因此而受到任何限制。
实施例1：人体软组织填充剂的制备
一.自体健康皮肤样品的提取
用70％的酒精消毒耳后，然后用10％的利多卡因和十万分之一的肾 上腺素进行局部表面麻醉。用取皮器或手术刀和手术剪刀将接受治疗者 耳后4平方毫米的表皮和真皮组织取下，放入组织保存液(DMEM细胞保 存液，购自美国Hyclone公司)中，将创伤部位做一针缝合，创可贴覆 盖。
二.细胞悬液的制备
1.皮肤组织培养前处理：将皮肤组织块放置于培养皿中清洗上皮 部位，然后去除皮下组织和脂肪，将皮肤组织剪碎为0.1-0.5平方毫米 的皮肤碎片，最后将皮肤碎片平铺于培养皿的底面。
2.原代细胞培养：在已平铺皮肤碎片的培养皿中加入DMEM和3％ 的胎牛血清，放入Forma CO2 3131型培养箱中，在37℃，5％CO2的条 件下进行培养，每隔2～3天换上述培养液一次，当原代细胞达到80％ 汇集后传代。
3.传代细胞培养：在原代培养的基础上加入上皮生长因子为3纳 克/毫升、成纤维生长因子10纳克/毫升、氢化可的松1微克/毫升、肝 素10微克/毫升，每3-4天换上述培养液一次，培养4周，大约培养扩 增至1500万个细胞。
4.配制注射剂：将培养数量达到要求的细胞首先使用胰蛋白酶进 行消化处理，使其脱离培养皿底面，再使用无外源性蛋白的DMEM清洗3 次。将收集到的细胞及少量胶原蛋白直接加入透明质酸中，混匀，配成 1ml注射填充剂，该注射用填充剂中细胞成分的总个数为1000万个，透 明质酸的含量为20mg/ml。透明质酸购自美国Q-Med Scandivavia公司， 商品名为Restyland。
病毒检测：皮肤组织培养4周后，取1ml含有细胞的培养液进行HIV 和肝炎病毒的检验，确定此为无病毒细胞。
免疫反应测试：第4周将0.1ml细胞悬浮液对受术者进行皮试(同 青霉素皮试方法)，无免疫反应。
成品检测：
1)外观：本品为淡白色混悬液。
2)本品中细胞分类检定和透明质酸的含量：
成纤维干细胞：采用Brdu抗体测定(黄晖，赖西南，王正国，王 丽丽，“创伤愈合中物质对表皮干细胞迁移及受体表达的作用”；《中 华创伤杂志》2004年；20(3)142-145。利用核标记物)，产品中有10％ 的成纤维干细胞。
成纤维前体细胞：采用细胞形态学方法观察(在100倍光学显微 镜下做形态学观察，其标准形态为细小长索状)，产品中有70％的成纤 维前体细胞。
成纤维细胞：采用细胞形态学方法观察(在100倍光学显微镜下 做形态学观察，其标准形态为呈多触突的长索形细胞)，产品中有20％ 的成纤维细胞。
透明质酸每毫升20毫克。
3)无菌试验：按《中国生物制品规程》(2000版)通则《生物制品无 菌试验规程》A/B项进行，结果符合无菌要求。
三.治疗
用于额头皱纹，眼角鱼尾纹，脖颈皱纹，妊娠纹等所有面部及其 它身体部位的皱纹和细小皱纹；治疗25例。
1.治疗者术前检查，各项指标均正常，包括：血尿便常规、心电图、 肝肾功能、HIV、HbsAg。
2.将注射部位用70％的酒精消毒，局部注射1％的利多卡因麻醉。
3.将1ml填充剂吸入1ml的注射器中备用。
4.取2.2cm长的4.5号针头，采用多点斜面(针头与皮肤的角度 20°～45°)，在注射部位注射时，将注射部位表皮拉紧注射细胞，使 其发白，注射时使注射部位留有弥散空间。。
疗程：注射部位共注射2次，间隔2周。
四、术后观察、调护：
1.手术后，用冰袋敷注射处2小时。
2.观察局部及全身的情况：一切正常。
3.每天二次口服维生素C(每次200mg，每天共400mg)，服用6 个月。
4.术后3天内防曝晒及慎用刺激性化妆品
五、效果描述
皱纹在注射后2周内基本消失或明显变浅，效果良好。注射前后的 效果对比见图3至图8。
实施例2：人体软组织填充剂的制备
一.自体健康皮肤样品的提取
用70％的酒精消毒耳后，然后用10％的利多卡因和十万分之一的肾 上腺素进行局部表面麻醉。用取皮器或手术刀和手术剪刀将接受治疗者 耳后4平方毫米的表皮和真皮组织取下，放入组织保存液(DMEM细胞保 存液，美国Hyclone公司)中，将创伤部位做两针缝合，创可贴覆盖。
二.细胞悬液的制备
1.皮肤组织培养前处理：将皮肤组织块放置于培养皿中清洗上皮 部位，然后去除皮下组织和脂肪，将皮肤组织剪碎为0.1-0.5平方毫米 的皮肤碎片，最后将皮肤碎片平铺于培养皿的底面。
2.原代细胞培养：在已平铺皮肤碎片的培养皿中加入DMEM和无血 清培养液，放入Forma CO2 3131型培养箱中，在37℃，5％CO2的条件 下进行培养，每隔2～3天换上述培养液一次，当原代细胞达到70％汇集 后传代。
3.传代细胞培养：在原代培养的基础上加入上皮生长因子4纳克/ 毫升、成纤维生长因子8纳克/毫升、氢化可的松0.8微克/毫升、肝素 8微克/毫升，培养扩增至9000万个细胞。
4.配制注射剂：将培养数量达到要求的细胞首先使用胰蛋白酶进 行消化处理，使其脱离培养皿底面，在使用无外源性蛋白的DMEM清洗4 次，去除外源性生长因子和活性物质。将纯化的细胞直接加入透明质酸 中，混匀，配成3ml注射填充剂，该注射用填充剂中细胞成分的总个数 为8500万个，透明质酸的含量为15mg/ml。
病毒检测：将皮肤组织进行培养4周后，取1ml含有细胞的培养液 进行HIV和肝炎病毒的检验，确定此为无病毒细胞。
免疫反应测试：第4周将0.1ml细胞悬浮液对受术者进行皮试(同 青霉素皮试方法)，无免疫反应。
成品检测
1)外观：本品为淡白色混悬液。
本品中细胞分类检定和透明质酸的含量：
成纤维干细胞：采用Brdu抗体测定表明，该收集的有效成分中有 15％的成纤维干细胞。
成纤维前体细胞：采用细胞形态学方法观察，该收集的有效成分中 有60％的成纤维前体细胞。
成纤维细胞：采用细胞形态学方法观察，该收集的有效成分中有25％ 的成纤维细胞。
透明质酸每毫升15毫克。
2)无菌试验：按《中国生物制品规程》(2000版)通则《生物制品无 菌试验规程》A/B项进行，结果符合无菌要求。
三、治疗
用于水痘、痤疮、创伤后凹陷性疤痕；治疗15例。
1.治疗者术前检查，各项指标均正常，包括：血尿便常规、心电图、 肝肾功能、HIV、HbsAg。
2.将注射部位用70％的酒精消毒，局部注射1％的利多卡因麻醉。
3.将3ml细胞悬液吸入3个1ml的注射器中备用。
4.注射时可选择4号半普通针头，沿疤痕长轴远端进针，在疤痕部 位真皮下进行剥离，可有少量出血，待出血停止后，把细胞液注射到真 皮内，注射量以能看到注射部位局限隆起发白为宜。
疗程：注射部位共注射2次，间隔2周。
四、术后观察、调护：
1.手术后，用冰袋敷注射处2小时。
2.观察局部及全身的情况：一切正常。
3.每天二次口服维生素C(每次200mg，每天共400mg)，服用6 个月。
4.术后一周内防曝晒及慎用刺激性化妆品。
五、效果描述
凹陷性疤痕在注射后1周内明显变浅，效果良好。注射前后的效果 对比见图9至图10。
虽然参照具体实施方案详细说明了本发明，但需要指出的是，这些 实施方案仅仅用来更好地理解本发明。本领域的技术人员清楚，在不偏 离本发明的精神和范围的情况下，可以在本发明的基础上做出一些变化 和修改。本发明意图包括了所有这些变化和修改。