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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201521037004.3 (22)申请日 2015.12.14 A61L 27/54(2006.01) A61L 27/24(2006.01) A61L 27/50(2006.01) (73)专利权人 宁波大学 地址 315211 浙江省宁波市江北区风华路 818 号 (72)发明人 赵基源 李梅 陈梦洁 谷俏俏 陈松娣 罗钫妙 张迟 (74)专利代理机构 宁波奥圣专利代理事务所 ( 普通合伙 ) 33226 代理人 谢潇 (54) 实用新型名称 淫羊藿苷 - 小肠黏膜下层补片 (57) 摘要 本实用新型公开的淫羊藿苷 - 小肠黏膜下。
2、层 补片的微观结构包括 SIS 胶原纤维骨架和加载于 SIS 胶原纤维骨架上的淫羊藿苷， SIS 胶原纤维骨 架为网状纤维结构， 淫羊藿苷为颗粒状， 淫羊藿苷 附着于 SIS 胶原纤维骨架上 ； 本实用新型淫羊藿 苷 - 小肠黏膜下层补片， 在 SIS 胶原纤维骨架上 附着颗粒状的淫羊藿苷， 建立稳定的药物释放体 系， 将 SIS 胶原纤维骨架和淫羊藿苷这两个极具 潜力的骨组织工程元素结合起来， 形成的淫羊藿 苷 - 小肠黏膜下层补片复合材料可靠、 稳定， 对淫 羊藿苷安全、 经济、 化学性质稳定及优异的促骨再 生能力和促血管再生能力等特性加以充分利用， 该淫羊藿苷 - 小肠黏膜下层补片是一种。
3、载药补 片， 具有极强的促骨再生能力， 在骨再生领域具有 广泛的应用前景。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)实用新型专利 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 205235020 U 2016.05.18 CN 205235020 U 1.淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片， 其特征在于该补片的微观结构包括SIS胶原纤维骨架 和加载于SIS胶原纤维骨架上的淫羊藿苷， 所述的SIS胶原纤维骨架为网状纤维结构， 所述 的淫羊藿苷为颗粒状， 所述的淫羊藿苷附着于所述的SIS胶原纤维骨架上。 2.根据权利要求1所述的淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片， 其特征在于所述的淫羊。
4、藿苷的 颗粒度为0.35 m。 3.根据权利要求2所述的淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片， 其特征在于所述的淫羊藿苷的 颗粒度为0.30.6 m。 4.根据权利要求2所述的淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片， 其特征在于所述的淫羊藿苷的 附着量为2080 g/cm2。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 205235020 U 2 淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片 技术领域 0001 本实用新型属于生物医学工程中药物释放系统技术领域， 具体涉及一种淫羊藿 苷-小肠黏膜下层补片， 该补片是一种载药补片， 在骨再生领域具有广泛的应用前景。 背景技术 0002 我国每年约有350万人因不同原因出现骨缺损， 骨手术。
5、移植约为150万例， 对替代 骨的需求量非常大， 尤其是大骨骼损伤的替代骨。 随着组织工程技术的快速发展， 在体外构 建具有成骨传导性和成骨诱导性的人造替代骨是解决这一需求的重要途径。 骨架材料在组 织工程骨构建中起着至关重要的作用。 相比于其他合成材料， 天然细胞外基质(ECM)材料由 于其以下特点： 1.优异的生物相容性； 2.最接近于体内细胞生长微环境的三维结构； 3.为细 胞生命活动提供了各种活性分子， 一直被认为是理想的组织工程材料。 猪小肠黏膜下层 (SIS)是目前研究最多的天然细胞外基质材料， 已通过美国FDA批准， 被广泛用来构建人造 膀胱、 人造尿道、 人造食道、 人造血管和。
6、人造皮肤等软组织。 SIS材料骨架成分胶原蛋白 (collagen)已经被广泛用来作为骨架材料和药物载体用于骨组织工程。 SIS相比于胶原有 两大优点： 1.SIS是个天然的药物库， 它保留了许多有利于骨再生的生物活性分子； 2.SIS在 取材上更加便利， 成本也要远低于胶原。 国内外用SIS材料作为骨组织工程骨架材料报道已 有一些， 但是有一个问题使之无法进一步推广使用： 成骨诱导性的不足。 通过在SIS上载入 具有促进骨再生的药物， 并使之能够实现缓慢释放， 将可以弥补这一缺陷。 如果能解决这个 难题， SIS材料将成为理想的骨组织工程材料。 0003 骨组织工程中所需要的促进骨再生的药物。
7、一直是一个研究热点， BMP-2蛋白虽然 是目前广泛被认可和采用的最有效的成骨诱导因子， 但是由于其非常昂贵， 而采用BMP基因 导入方法又存在一定的安全问题， 因此它的临床使用还是受到成本和安全性的制约。 此外， BMP-2和其他蛋白药物都存在稳定性差、 在体内半衰期短的问题， 相应对于药物释放体系的 要求非常高。 因此寻找低成本、 稳定又可以高效诱导骨再生的小分子化合物来替代BMP是非 常有意义的。 目前治疗骨质疏松的药物主要通过抑制骨吸收来实现骨代谢的平衡， 但是通 过促进成 骨细胞分化和骨再生的化合物非常少， 非常有限的报道包括： 他汀类药物、 异黄 酮衍生物、 TAK-778和赛菊芋。
8、黄素衍生物等。 随着现代分离技术的发展， 从天然产物中提取 各种化合物， 难度和成本都要远远低于传统的化学合成。 中药作为中华名族的瑰宝， 记载了 大量中草药对于各种疾病的治疗， 其有效性也越来越得到世界范围内的认可。 植物药淫羊 藿一直以来被认为具有强筋键骨的作用， 其主要活性成分淫羊藿苷在骨代谢中的功能和机 制直到最近几年才开始被逐渐研究。 Chen Ke-Ming等人首次发现大鼠骨髓间充质干细胞经 过淫羊藿苷处理之后， 细胞增殖加速， 分化标志物ALP、 OCN和矿物化都有增加， 表明淫羊藿 苷可能具有促进骨代谢的作用。 我们的研究发现淫羊藿苷可以通过上调Runx2表达和激活 BMP信号。
9、通路来促进成骨细胞的分化； Hsieh等人也发现淫羊藿苷通过激活BMP和NO信号通 路来促进成骨细胞分化， 同时BMP-2、 Smad4、 Runx2和OPG等基因表达上调。 Chung等的研究发 现淫羊藿苷可以激活内皮细胞中的MEK/ERK和PI3K/Akt/eNOS信号通路来加速血管生成； 在 说 明 书 1/4 页 3 CN 205235020 U 3 小鼠临界骨损伤模型研究中， 我们发现淫羊藿苷-磷酸钙水泥复合材料能够在6周之后诱导 小鼠体内头盖骨损伤处形成具有血管的新生骨。 淫羊藿苷由于安全、 经济， 化学性质稳定、 促骨再生能力和促血管再生能力， 是一种非常具有潜力的可以用于骨组织。
10、工程的药物。 但 是目前尚未有在SIS上载入淫羊藿苷作为促进骨再生的缓释药物的相关报道。 发明内容 0004 本实用新型所要解决的技术问题是， 针对现有技术的不足， 提供一种具有极强的 促骨再生能力的淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片。 0005 本实用新型解决上述技术问题所采用的技术方案为： 淫羊藿苷-小肠黏膜下层补 片， 该补片的微观结构包括SIS胶原纤维骨架和加载于SIS胶原纤维骨架上的淫羊藿苷， 所 述的SIS胶原纤维骨架为网状纤维结构， 所述的淫羊藿苷为颗粒状， 所述的淫羊藿苷附着于 所述的SIS胶原纤维骨架上。 0006 本实用新型淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片， 在SIS胶原纤维骨架上附着颗。
11、粒状的淫 羊藿苷， 建立稳定的药物释放体系， 将SIS胶原纤维骨架和淫羊藿苷这两个极具潜力的骨组 织工程元素结合起来， 形成的淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片复合材料可靠、 稳定， 对淫羊藿 苷安全、 经济、 化学性质稳定及优异的促骨再生能力和促血管再生能力等特性加以充分利 用， 该淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片是一种载药补片， 具有极强的促骨再生能力， 在骨再生 领域具有广泛的应用前景。 0007 作为优选， 所述的淫羊藿苷的颗粒度为0.35 m； 作为进一步优选， 所述的淫羊藿 苷的 颗粒度为0.30.6 m， 以确保淫羊藿苷的均匀释放效果。 0008 作为优选， 所述的淫羊藿苷的附着量为2080 。
12、g/cm2， 以确保淫羊藿苷药效的充 分发挥。 0009 与现有技术相比， 本实用新型的优点在于： 本实用新型淫羊藿苷-小肠黏膜下层补 片， 在SIS胶原纤维骨架上附着颗粒状的淫羊藿苷， 建立稳定的药物释放体系， 将SIS胶原纤 维骨架和淫羊藿苷这两个极具潜力的骨组织工程元素结合起来， 形成的淫羊藿苷-小肠黏 膜下层补片复合材料可靠、 稳定， 对淫羊藿苷安全、 经济、 化学性质稳定及优异的促骨再生 能力和促血管再生能力等特性加以充分利用， 该淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片是一种载药 补片， 具有极强的促骨再生能力， 在骨再生领域具有广泛的应用前景。 附图说明 0010 图1为本实用新型淫羊藿苷-小。
13、肠黏膜下层补片的结构示意图； 0011 图2为实施例一的淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片的淫羊藿苷释放曲线； 0012 图3为实施例一的淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片体外生物学活性验证结果。 具体实施方式 0013 以下结合实施例对本实用新型作进一步详细描述。 0014 实施例一： 淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片， 如图1所示， 其微观结构包括SIS胶原纤 维骨架1和加载于SIS胶原纤维骨架1上的淫羊藿苷2， SIS胶原纤维骨架1为网状纤维结构， 淫羊藿苷2为颗粒状， 颗粒度为0.30.6 m， 淫羊藿苷2附着于SIS胶原纤维骨架1上， 淫羊藿 说 明 书 2/4 页 4 CN 205235020 U 4 。
14、苷2的附着量为33.25.6 g/cm2。 0015 实施例二： 淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片， 如图1所示， 其微观结构包括SIS胶原纤 维骨架1和加载于SIS胶原纤维骨架1上的淫羊藿苷2， SIS胶原纤维骨架1为网状纤维结构， 淫羊藿苷2为颗粒状， 颗粒度为0.35 m， 淫羊藿苷2附着于SIS胶原纤维骨架1上， 淫羊藿苷 2的附着量为56.28.8 g/cm2。 0016 对于实施例一的淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片， 进行如下实验检测及性能验证： 0017 1、 微观结构 0018 将保存在PBS缓冲液中的实施例一的淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片取出， 置于通风 室温条件直至完全干燥， 用扫描电。
15、镜观察补片表面特征， 作为对比， 未加载药物的SIS胶原 纤维骨架作为空白对照组。 从实施例一的补片的SEM图片可见， 在SIS胶原纤维骨架上附着 了大量的药物分子， 即颗粒状的淫羊藿苷。 0019 2、 淫羊藿苷SIS补片的体外释放曲线 0020 将保存在PBS缓冲液中的实施例一的淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片取出并放入24 孔板， 加入400 L新鲜PBS缓冲液， 室温下震荡摇晃24h， 然后将补片取出置于新的孔中， 同时 重新加入400 L新鲜PBS缓冲液。 收集旧孔中PBS缓冲液并测定其体积(V1)， 用分光光度计在 268nm下测定吸收值， 并根据工作曲线计算其含有的淫羊藿苷浓度(C1)。
16、， 第一天释放的淫羊 藿苷量为C1V1。 在第2、 4、 6、 9、 12、 15、 18、 21、 24、 27、 30、 33、 38、 43和48天之内重复此过程， 将 第N天收集的PBS缓冲液的体积和淫羊藿苷浓度分别记为VN和CN， 这个时间段内释放的淫羊 藿苷量为CNVN， 累计释放量CNVN(N1、 2、 4、 6、 9、 12、 15、 18、 21、 24、 27、 30、 33、 38、 43、 48)， 形成的淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片的淫羊藿苷释放曲线见图2。 0021 由图2可见， 不同层数的淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片呈现类似的释放行为， 在前2 天药物有一个较高的释放。
17、量， 之后淫羊藿苷的释放趋于平缓， 并且此稳定释放行为能持续 50天左右。 单层补片的稳定药物释放量为0.30.4 g/cm2/day， 双层补片的稳定药物释放 量为0.60.8 g/cm2/day， 可见淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片的载药量稳定， 药物释放只和 补片的面积有关。 0022 3、 淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片体外生物学活性验证结果 0023 3.1、 细胞培养及传代： 准备含有510胎牛血清的 -MEM培养基作为培养液； 将 从小鼠颅顶前骨MC3T3-E1细胞系中分离的MC3T3-E1Subclone 14细胞置于5二氧化碳浓 度、 37的细胞培养箱中培养， 培养液的用量为200 。
18、L/cm2， 每隔48h弃去旧的培养液并加入 等量新的培养液， 确保培养液的用量为200 L/cm2， 当培养至MC3T3-E1Subclone 14细胞汇 合度大于90时进行细胞传代， 细胞传代的过程为： 弃去旧的培养液， 加入用量为200 L/ cm2的PBS缓冲液， 清洗23次； 然后加入用量为4050 L/cm2的0.25的胰酶， 在37下孵 育1min； 收集细胞并加入至离心管， 在1000rpm转速下离心2min； 弃去上清， 然后加入1mL培 养液重悬细胞， 得到细胞悬液， 对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度； 根据计算得到的细胞密度， 将细胞悬液以(12)104。
19、细胞/cm2的用量加入至新的细胞培养 瓶， 然后在该细胞培养瓶中加入5mL的培养液混匀， 置于细胞培养箱中培养； 重复上述细胞 传代过程直至获得足够量的MC3T3-E1Subclone 14细胞； 0024 3 .2、 取汇合度为7080的MC3T3-E1Subclone 14细胞， 加入至离心管， 在 1000rpm转速下离心2min， 弃去上清， 再加入1mL培养液重悬细胞， 得到细胞悬液， 对此细胞 说 明 书 3/4 页 5 CN 205235020 U 5 悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度， 然后根据计算得到的细胞密度将该细胞 悬液稀释至1105细胞/mL的终浓度， 即配制。
20、得到细胞悬液； 按5104细胞/孔的细胞密度将 配制得 到的稀释的细胞悬液均匀滴加在24孔板中， 完成细胞种植， 然后立即放入细胞培养 箱中孵育； 孵育46h后， 取出植有细胞的24孔板， 用12mL/cm2用量的培养液清洗23次， 除去表面未黏附的细胞， 之后以1mL/孔的用量加入新的培养液， 最后将该植有细胞的24孔 板置于细胞培养箱孵育； 0025 3.3、 淫羊藿苷-SIS补片活性测定： 植有细胞的24孔板于细胞培养箱孵育16h后， 从 细胞培养箱中取出， 弃去旧的培养液， 将所有孔分为4组， 分别加入培养基、 培养基+SIS补片 (transwell)、 培养基+淫羊藿苷-SIS补片。
21、(transwell)和含110-5M淫羊藿苷的培养基， 每 隔一天更换培养基。 培养3天后， 提取各组细胞的RNA， 利用real-time RT-PCR技术测定OCN 的表达量， OCN的表达越高说明成骨分化越强。 图3为淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片体外生物 学活性验证结果， 图3中， control： 对照培养基组； SIS： 对照培养基+SIS补片(transwell) 组； SIS+IC： 对照培养基+淫羊藿苷-SIS补片(transwell)组； IC： 含110-5M淫羊藿苷的培养 基组。 从图3可见， 单纯SIS组的OCN表达与对照组类似， 没有成骨促进作用， 载药补片组的 OC。
22、N表达与直接在培养基加入淫羊藿苷的效果类似， 有明显促成骨分化作用。 0026 4、 淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片在小鼠体内的成骨验证 0027 将实施例一的淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片具体应用于小鼠头盖骨缺失模型骨修 复， 具体实验过程为： 选择实验对象： 选取5只8周龄雄性C57BL/6小鼠作为实验对象， 建立头 盖骨缺失模型： 在小鼠头盖骨两侧部位用Miltex公司生产的Biopsy Punch设备移去直径为 4mm的骨组织， 然后在一侧缺失处植入淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片， 另一处植入空白作为 对照； 手术缝合后小鼠正常饲养8周后处死， 取得头盖骨组织进行如下体内成骨状况分析： 0028 。
23、4.1、 组织学结果： 对比无植入物的空白对照骨的HE染色结果和实施例一的载药补 片组的HE染色结果可见， 在空白对照骨缺失处， 8周后几乎没有新生骨， 而在植入本实用新 型复合工程骨的位置， 出现了较多的包含血管、 髓腔的成熟新生骨组织， 且骨桥几乎覆盖了 一半缺失区域； 0029 4.2、 统计学计算结果： 采用NIH软件Imagej对小鼠骨缺失处的新生骨面积比例进 行计算， 每个样品取5张不同截面的切片， 通过统计学分析发现空白组中新生骨面积比例为 4.75.9(MeanS.D.)， 而实验组中新生骨面积比例为29.916.4(Mean S.D.)， 两者具有显著差异(p0.001)， 证明本实用新型淫羊藿苷-小肠黏膜下层补片在体内 骨修复过程中效果显著。 说 明 书 4/4 页 6 CN 205235020 U 6 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 7 CN 205235020 U 7 图3 说 明 书 附 图 2/2 页 8 CN 205235020 U 8 。