技术领域
本发明涉及一种用于软组织伤口愈合的纳米纤维膜及其制备方法和用途，具体涉及一种新型的含有生物活性陶瓷磷酸二正硅酸钙颗粒(NAGEL)的静电纺丝材料及其制备方法和用途，属于生物材料技术领域。
背景技术
近年来，伴随着全球生活质量的提高，肥胖、糖尿病、营养失调等慢性疾病的发病率也逐年升高，其并发症诸如压力性溃疡、下肢静脉性溃疡以及糖尿病溃疡等慢性伤口的发生率也明显上升[Turner N J,et al,Advances in wound care,2015]。据估计，全球约有4亿人面临不同因素引起的伤口问题[Harding K,et al.,International woundjournal,2011]。仅在美国，就约有640万人受慢性伤口的困扰，相应的医疗支出费用高达250亿美元[Naves CCLM.Advances in wound care,2016]。糖尿病是一种全身性的代谢性疾病，在这些患者中大约有15％的人会发展成为糖尿病足，它是一种糖尿病最常见的并发症。而且会有6％的人需要接受终身治疗。糖尿病足是全世界花费最高的一种慢性疾病，患者截肢率也很高。
伤口根据其愈合的病理学过程和愈合时间不同可分为急性伤口和慢性伤口。
急性伤口被定义为可以在两到三个月内自行修复的伤口，比如手术切口、II度烧伤烫伤伤口、浅层皮外伤、皮肤急性放射性I度损伤，II度压疮等均为急性伤口。急性伤口的愈合遵循有序的病理学过程，一般包括炎症反应期、肉芽增生期和组织重塑期三个阶段[Ramasastry S S.Clinics in plastic surgery,2005]。在伤口形成初期，伤口处会迅速形成血栓防止血液流失，快速合成临时细胞外基质(ECM)并形成结痂，为伤口处细胞的生长和迁移提供良好的环境和支架；同时血小板会招募中性粒细胞和巨噬细胞到伤口处，吞噬伤口表面的微生物和基质碎片，防止感染，这个过程称为炎症阶段，炎症阶段大概持续一周左右，之后进入伤口愈合阶段。在愈合过程中，伤口处发生再上皮化，并生成新生血管为伤口修复提供营养供给，成纤维细胞发生迁移，并发生胶原沉积，直至伤口完全愈合[Nunan R,et al.,Disease Models and Mechanisms,2014]。
慢性伤口被定义为超过三个月机体无法修复的伤口。慢性伤口一般分为静脉性溃疡、动脉性溃疡、创伤性溃疡、压力性溃疡、糖尿病溃疡这五大类。糖尿病伤口作为一种典型的慢性伤口，其难以愈合的原因主要包括以下几点：(1)高血糖使白细胞吞噬细菌的能力减弱，使伤口处更易受细菌感染，炎症反应期延长；(2)外围神经病变和局部缺血使血管容易发生病变并且新生血管不足，使局部组织的修复能力减弱；(3)血管新生不足进一步导致伤口处的细胞生长、迁移受到破坏，表皮新生减少；(4)伤口处的炎症因子过量表达引起伤口处的基质金属蛋白酶表达升高，导致伤口处的细胞质基质过度破坏，胶原合成减少[Rask-Madsen C,et al.,Cell metabolism,2013]。糖尿病伤口的局部组织长期处于缺血，感染的状态，后期极易发展为坏疽，最终导致截肢甚至危及生命[Jeffcoate W J,et al.,The lancet,2003]。临床流行病学研究结果显示由糖尿病溃疡引发下肢截肢的风险高达80％以上，而且糖尿病溃疡即使治愈也极易复发[Reiber G E,et al.,Diabetes in America,1995]。因此，对于糖尿病伤口的控制和治疗有重大的临床意义。目前临床上控制并治疗糖尿病足的方法包括：减压疗法、手术清创、控制血糖、抗生素、促进血管新生药物或者生长因子[Jeffcoate W J,et al.,The lancet,2003]。对于糖尿病伤口的治疗，除了控制患者血糖之外，防止伤口处感染并且促进血管新生是促进伤口愈合的重要因素。
伤口敷料在伤口愈合方面的应用越来越广泛。理想的伤口敷料应具有预防感染，为创面提供湿润环境，吸收渗液，促进伤口愈合，良好的组织可吸收性和组织相容性，安全无毒无过敏原，透气并且容易制备，价格便宜等特点[Amin N,et al.,Worldjournal ofdiabetes,2016]。传统敷料如纱布虽然具有透气、吸收渗液的作用，但会导致伤口与敷料发生粘连，对患者造成二次伤害。若皮肤产生直径大于4cm的伤口，机体便不能自我修复，此时需要考虑自体移植和异体移植的治疗[MacNeil S.Materials today,2008]。目前，自体断层皮移植是临床上针对皮肤创伤公认的标准疗法，但对于大面积皮肤受损的患者，一方面患者需面临身体多处受伤，另一方面也面临供区皮肤不足的问题[S,et al.,Burns,2010]。异体皮肤移植也存在发生免疫排异反应以及感染病原微生物等风险。并且对于慢性伤口，往往选择比较保守的治疗手段，要保持伤口的湿润并且预防感染，保护并引导伤口处进行正常的修复过程。因此，开发一种理想的可以促进慢性伤口愈合的伤口敷料具有很大的临床价值和应用前景。
皮肤组织工程的发展为这一需要提供了新的思路。理想的皮肤组织敷料应具有可为皮肤损伤处细胞提供有利于其增殖和迁移的微环境，为细胞生长提供支架，促进伤口处成血管化，以及良好的生物可降解性，临床易操作性和价格合理等生物学特点[Metcalfe A D,et al.,Biomaterials,2007；Zahedi P,et al.,Polymers for Advanced Technologies,2010]。在结构上应具有三维支架结构和高孔隙率，为皮肤损伤处细胞生长提供支撑作用，引导皮肤组织再生。
近年来，静电纺丝技术的发展，为皮肤创伤修复提供了一个很好的选择。利用静电纺丝技术合成的生物支架，可以高度的模拟人体的细胞质基质结构，为细胞的粘附，生长，迁移提供了3D的支架。并且这一优势很多研究已经在动物体内证明。除了静电纺丝本身有利于伤口修复的优势以外，它作为细胞，药物或者生长因子载体，也被广泛的应用。细胞，药物或者生长因子这些添加物质可以作为伤口修复过程中其主要作用的活性成分。目前这一治疗方案提高了一定的治疗效果，但是它们也存在很多的缺点，药物的副作用，异体细胞很容易引起机体的排异反应，生长因子本身来源少，而且添加量控制不好可能引起肿瘤的发生。细胞和生长因子来源少，制备过程繁琐，保存条件要求高，这些因素制约了它们临床方面的发展。所以人们现在探索利用生物大分子自身刺激伤口处的细胞生长，迁移，并且刺激血管新生等。
目前，使用明胶静电纺丝工艺来制备纳米纤维成为研究创口包覆材料和止血敷料的热点。卢伟鹏等(《明胶科学与技术》，2013年第33卷第1期)报道了：利用明胶与聚己内酯静电纺丝制备纳米纤维。通过细胞培养实验，显示纤维能够促进细胞的粘附与增殖。将复合纤维与医用纱布作用在受伤白鼠的创面，证明明胶纤维具有更快的伤口愈合能力。
朱锐钿等(《材料导报》，2008年第22卷第5期)报道了：以聚己内脂和明胶在三氟乙醇中共混后，静电纺丝得到纳米敷料，可用于伤口愈合等组织工程领域。
生物活性陶瓷作为一种生物活性材料，可以释放出各种离子到细胞环境中刺激细胞分泌各种生长因子，调节细胞的生长和行为，预示着其可以用于生物组织工程的应用中。传统的研究中，生物陶瓷材料多与明胶通过静电纺丝，以制备用于骨组织(例如牙周组织)生成的再生材料，例如卢伟鹏等(《明胶科学与技术》，2013年第33卷第1期)报道了：利用静电纺丝技术，制备了β-磷酸三钙与明胶杂化的纳米纤维引导组织再生膜，这种明胶杂化膜可用于牙周组织的再生。朱锐钿等(《材料导报》，2008年第22卷第5期)报道了：将明胶与羟磷灰石共混后进行静电纺丝，得到用于引导骨质细胞再生的复合纳米纤维膜。鉴于生物活性陶瓷材料优越特性，因此引起了将其与明胶或聚己内脂进行静电纺丝制备生物材料膜的研究。
郑均元(《中国组织工程研究与临床康复》，2010年第14卷第16期)报道了：采用静电纺丝方法制备β-TCP/Gel引导组织再生膜后，其与已知生物相容性较好的聚乳酸(PLLA)膜、聚丙交酯/乙交酯(PLGA)膜进行比较，前者不仅在形态与成分上更加近似天然细胞外基质，同时又具有良好的生物相容性与生物活性。
然而，以上涉及明胶与生物陶瓷的静电纺丝生物膜，或聚己内脂与生物陶瓷的静电纺丝生物膜，其都是用于骨组织或硬组织形成的应用中，并不适合软组织伤口愈合、特别是糖尿病引起的皮肤或肌肉组织创伤的医用辅料。
因此，目前亟需一种能用于糖尿病伤口愈合的新型生物创伤敷料。
发明内容
本发明采用静电纺丝技术将明胶与聚己内酯混合，突破常规思路，引入现有技术中仅用于硬组织修复的生物活性陶瓷磷酸二正硅酸钙(NAGEL)颗粒，纺织出一种具有无序三维孔隙结构的薄膜。即，本发明用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜，所述复合纳米纤维膜为有机/无机复合的纳米纤维材料。当施用于软组织伤口时，随着伤口部位的生物活性陶瓷的降解，硅离子和钙离子会释放入细胞环境中，刺激促伤口愈合因子的释放，利用其本身的生物活性陶瓷的特性加速伤口愈合，而不需要额外添加促生长因子等。因此，本发明用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜可以协同静电纺丝和生物活性陶瓷促进糖尿病伤口愈合，尤其是促进糖尿病引起的软组织伤口的愈合。
本发明的目的之一是提供一种用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜的制备方法，将聚己内脂、明胶、磷酸二正硅酸钙通过电纺制备所述用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜。
本发明用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜的制备方法，所述方法包括：(1)将聚己内脂、明胶、磷酸二正硅酸钙溶于HFIP中，搅拌得到混合溶液；(2)将所述混合溶液进行电纺，收集得到纤维膜；(3)将所述纤维膜浸泡在戊二醛/乙醇溶液中进行固定，得到所述用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜。
具体地，所述方法包括以下步骤：
(1)将聚己内脂(PCL)、明胶(gelatin)、磷酸二正硅酸钙(NAGEL)以10-50：10-50：10-50的重量比，溶解于六氟异丙醇(HFIP)中，置于磁力搅拌器上以600rpm/min的转速常温搅拌6-18h得到均一的，质量浓度为10％-25％混合电纺溶液；
(2)将所制得均一的混合电纺溶液置于电纺丝装置上，以电压8-12Kv，流速0.01-0.04ml/min，间距为8-15cm，沉积时间为80-200min，为参数室温条件下进行电纺；并采用滚筒(100-1000r/min)进行收集；
(3)将电纺过程所收集的纤维膜浸泡在戊二醛/乙醇溶液(1:3-3:1,v/v)中进行交联固定，交联固定时间为3-6h，交联后的纤维膜用大量的去离子水冲洗；常温干燥；得到所述用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜。
其中，步骤(1)中，优选地，所述PCL：gelatin：NAGEL的重量比为30-50：30-50：10-50；进一步优选地，为50：50：10，50：50：30或50：50：50；更进一步优选地，为50：50：10或50：50：30。
其中，步骤(2)中，所述电纺过程所采用的电纺条件优选地为，常温条件下，电压10Kv，流速0.025ml/min，间距为12cm，沉积时间为150min；滚筒转速为300rpm/min。
其中，步骤(3)中，优选条件为戊二醛/乙醇溶液体积比1:1；交联时间3h。
固定后还可以包括步骤：固定后的纤维膜用大量去离子水冲洗，并且浸泡过夜，取出，常温干燥。
本发明中，所述用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜可直接作用于伤口上，促进伤口愈合。
本发明的另一个目的提供一种用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜，所述复合纳米纤维膜包含聚己内脂、明胶、磷酸二正硅酸钙。其中，所述复合纳米纤维膜通过对由聚己内脂、明胶、磷酸二正硅酸钙组成的混合溶液进行电纺制备而成。
本发明的另一个目的是提供一种通过上述方法制备得到的用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜，其可以用来制备用于促进软组织伤口愈合的敷料。
其中，所述用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜具有无序三维孔隙结构的薄膜；纤维呈现无序状态，NAGEL在共纺的条件下纺入到纤维内部，NAGEL在纤维内部均匀分布，所述用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜具有较高的亲水性。
本发明中，所述软组织伤口包括皮肤或肌肉的烧伤、手术或意外创伤等软组织伤口，或由疾病，例如糖尿病、癌症或肿瘤、溃疡引起的伤口，不包括硬组织伤口，例如骨组织及其附属细胞、粘膜，牙组织及其牙周细胞、粘膜的伤口。优选地，所述伤口是糖尿病引起的伤口，包括I型、II型糖尿病引起的伤口。
本发明中，所述用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜可以用于制备促进软组织伤口愈合的敷料。
本发明的另一个目的是提供一种用于促进软组织伤口愈合的敷料的制备方法，所述方法包括：
(a)按上述方法制备用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜；
(b)将所述用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜通过常规方法制备得到所述促进软组织伤口愈合的敷料。
本发明的另一个目的是提供一种由上述方法制备得到的用于促进软组织伤口愈合的敷料。
本发明中，所述敷料通过涂布、粘附、缝合、压制将所述纤维膜固定在支持载体上，可以以绒布、网或网眼样结构的形式存在。
本发明中，所述敷料以带、线、纤维、颗粒、滴剂或膏剂或糊剂或搽剂、网或网眼样结构、片、膜、箔或层压制件的形式存在。
本发明中，所述敷料包括创可贴、ok绷、止血绑带等。
本发明中，所述敷料可以接种治疗性药物；所述药物是促进伤口愈合的细胞、细胞因子、抗生素；所述细胞因子包括：白介素、生长因子、抗体。
本发明的另一个目的是提供由所述用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜或用于软组织伤口愈合敷料在制备促进软组织伤口愈合的医疗产品的用途。
在具体实施方案中，所述软组织伤口包括皮肤或肌肉的烧伤、手术损伤、意外创伤等软组织伤口，或由疾病，例如癌症或肿瘤、糖尿病、溃疡引起的伤口，不包括硬组织伤口，例如骨组织及其附属细胞、粘膜的伤口，牙组织及其牙周细胞、粘膜的伤口。在更具体的实施方案中，所述伤口是糖尿病引起的伤口，包括I型、II型糖尿病。
术语和定义
术语“磷酸二正硅酸钙”，是一种含有Ca、Si和P的三元组分的化合物，分子式为Ca7Si2P2O16，商品名为NAGEL。磷酸二正硅酸钙生物陶瓷采用溶胶-凝胶方法进行合成Ca7Si2P2O16粉体，并在1400℃下煅烧该粉体而制成该生物陶瓷，也通过直接购买市售的成品。研究证明，该生物活性陶瓷用作人体硬组织修复具有良好的生物活性，在模拟体液中有良好的诱导磷灰石矿化的能力，同时能够促进牙周膜细胞和骨髓基质干细胞的成骨分化，已经用于骨组织、牙组织等硬组织的修复和愈合。
术语“10-50：10-50：10-50的重量份比例”，指三种成分按所述重量份进行比较，因此凡是使用其他比例的形式，例如质量或重量含量百分比，体积百分比等，只要换算成重量份之后落入上述范围，这种其他比例的形式都与该术语的含义相同。
术语“医疗产品”是利用本发明所述用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜或其制备的辅料，再加工制成的各种常规的医用产品，例如医用止血工具包、器械等。
本发明的有益效果在于，本发明通过静电纺丝技术制备了用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜，所述复合纳米纤维膜为含磷酸二正硅酸钙(NAGEL)的生物陶瓷材料；通过系统研究，结果显示本发明复合纳米纤维膜具有良好的表面理化性质和成血管化能力，能够促进伤口愈合，促进表皮形成，减少炎症反应，增加胶原沉积，能够用于新型的创面修复敷料。所述复合纳米纤维膜能够显著缩短软组织慢性伤口尤其是糖尿病创伤的愈合时间，促进创伤区域的血管新生、表皮再生和胶原形成，并且减少慢性伤口处炎症反应，对软组织创伤修复具有很好的应用前景。
相比于现有技术中的只限于硬组织伤口修复的磷酸钙或硅酸钙的生物陶瓷材料，本发明制备的复合纳米纤维膜可广泛用于各类软组织的伤口愈合中，能够更快地降解，并促进伤口愈合，极大地扩展了生物陶瓷材料的应用范围，为国内相关研究和应用填补了空白，具有极好的市场应用前景。
附图说明
图1为实施例1中所制备得到的材料的电镜图；其中，图1A为PL组纳米纤维放大5000倍的图片扫描电镜图片；图1B为PL组纳米纤维透射电镜的图片；图1C为10NAG-PL组的纳米纤维放大5000倍的图片扫描电镜图片；图1D为10NAG-PL组纳米纤维透射电镜的图片；图1E为30NAG-PL组的纳米纤维放大5000倍的图片扫描电镜图片；图1F为30NAG-PL组纳米纤维透射电镜的图片。
图2为实施例1中所制备得到的材料的元素分析以及亲水性分析；图2A为PL组纳米纤维不含有Si和Ca元素；图2B为10NAG-PL组纳米纤维含有Si和Ca元素；图2C为30NAG-PL组纳米纤维含有Si和Ca元素，相对于10NAG-PL组元素含量明显升高了；图2D为PL组纳米纤维的亲水性分析，可以观察到材料亲水性比较差；图2E为10NAG-PL组纳米纤维亲水性检测，说明添加了NAGEL陶瓷的材料亲水性明显改善；图2F为30NAG-PL组纳米纤维亲水性检测，同样说明添加了NAGEL陶瓷的材料亲水性明显改善；
图3为实施例2中制备得到的材料促进人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)，人成纤维细胞(HSF)和角质形成细胞(HaCaT)的增殖；图3A为人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)在材料上增殖的实验结果统计图；图3B为人成纤维细胞(HSF)在材料上增殖的实验结果统计图；图3C为角质形成细胞(HaCaT)在材料上增殖的实验结果统计图。
图4为实施例3中制备得到的材料促进人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的迁移和粘附；图4A为人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)经过材料处理以后的Transwell小室的实验图片；图4B为A图片的数据统计图；图4C为人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)经过材料处理以后的划线实验图片；图4D为C图片的数据统计图；图4E为人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)在材料上生长的粘附效果(上)扫描电镜的图片(下)，可以观察细胞在材料上的伸展状态；图4F为人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)在材料上生长的粘附效果的细胞统计图。
图5为实施例4中制备得到的材料促进糖尿病小鼠的伤口愈合；图5A为不同组材料对糖尿病伤口小鼠的伤口愈合的效果；图5B为不同组材料对糖尿病伤口小鼠的伤口愈合的效果的模拟图；图5C为不同组材料对糖尿病伤口小鼠的伤口愈合的效果的面积统计图。
图6为实施例5中制备得到的材料促进糖尿病小鼠伤口的表皮再生；图6A为不同材料组的皮肤切片染色，主要展示材料促进表皮迁移的效果；图6B为不同材料组的皮肤切片染色，主要展示材料促进表皮增殖的效果；图6C为不同材料组的皮肤切片免疫组化图，主要展示材料促进表皮增殖的效果；图6D为图C的数据统计图；图6E为不同材料组的皮肤切片免疫荧光图，主要展示材料促进表皮分化的效果。
图7为实施例5中制备得到的材料促进糖尿病小鼠伤口的胶原累计；图7A为第7天的伤口处组织的I型胶原和III型胶原蛋白表达；图7B为第7天的伤口处组织的I型胶原和III型胶原基因表达；图7C为第7天的伤口处组织的III型胶原基因表达；图7D为第15天的伤口处组织的I型胶原基质金属蛋白酶的表达；图7E为Masson三色染色的效果图显示伤口处的胶原再生；图7F为图E的数据统计图。
图8为实施例5中制备得到的材料促进糖尿病小鼠伤口区域的血管新生；图8A为不同时间点对伤口处的皮肤进行取样观察伤口处的血管再生的情况；图8B为图A中第7天的血管数目统计图；图8C为图A中第11天的血管数目统计图；图8D为图A中第15天的血管数目统计图；图8E为第7天伤口处的皮肤切片进行CD31免疫荧光染色；图8F为图E中的血管数目的统计图图8G为第15天伤口处的皮肤切片进行CD31免疫荧光染色；图8H为图G中的血管数目的统计图。
图9为实施例6制备得到的材料具有良好的生物相容性和生物可吸收性；图9A为不同时间点对埋入皮肤下的材料进行取样观察材料的降解的情况；图9B为不同时间点对埋入皮肤下的材料进行Masson三色染色观察材料的降解。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：制备本发明用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜
将PCL、gelatin以及NAGEL同时溶解在适量的六氟异丙醇(10％-25％，m/v)溶剂中，三种组分的添加量如表1中各组所示，磁力搅拌转速600rpm/min，得到均一的混合电纺溶液，同时设立对照组A0，见表1。
表1
测试组 聚己内酯，wt％ 明胶，wt％ NAGEL，wt％ A0组(PL) 50％ 50％ 0 A1组(30NAG-PL) 50％ 50％ 30％ A2组(10NAG-PL) 50％ 50％ 10％
其中，所述PL是指不含NAGEL；
其中，所述10NAG-PL是指NAGEL的含量为10％。
其中，所述30NAG-PL是指NAGEL的含量为30％。
将所制得的混合电纺溶液进行电纺，电纺条件直流正高压10.0Kv，流速0.025ml/min，间距12cm，沉积时间150min，采用滚筒进行收集，滚筒转速300rpm/min。
将所收集的纤维膜浸泡在戊二醛/乙醇(1:1，v/v)溶液中进行固定，固定时间3h。固定后的纤维膜用大量去离子水冲洗，并且浸泡过夜，取出，常温干燥，得到所述用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜(静电纺丝生物材料)。
图1为所制备的用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜的电镜照片。
图1A-B为PL的扫描电镜图，图1C-D为10NAG-PL的扫描电镜图、图1E-F为30NAG-PL的扫描电镜图。
由图1可知，由于纤维呈现无序状态，NAGEL在共纺的条件下纺入到纤维内部。NAGEL为10％时，NAGEL分布更为均匀，因此10NAG-PL的纺织效果优于PL和30NAG-PL，并且可以预测随着NAGEL含量提高。
图2A～C为实施例1制备得到的材料元素含量的分析；图2D～图2F分别为PL、10NAG-PL、30NAG-PL的亲疏水性测试图。图2表明材料已经成功的制备，并且加入生物活性陶瓷的材料亲水性也明显得到了提高，并且可以预测随着NAGEL的含量加入材料的亲水性变好。
实施例2：研究本发明用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜对于伤口修复过程中细胞增殖的影响
将实施例1中制备的各组材料剪裁成Φ＝10mm的圆形片状，于75％的酒精中浸泡30min，灭菌的PBS清洗2次，放入48孔板中备用。分别将人脐静脉血管内皮细胞，人成纤维细胞，人角质形成细胞种植在样品表面，每孔6×103个细胞，使用的培养基分别为加有5％FBS以及生长因子的ECM培养基，10％FBS的DMEM培养基和10％FBS的1640培养基，培养温度为37℃，培养气氛为含5％CO2的空气，培养基每两天更换一次。用CCK8法来测试细胞在材料表面的增殖情况。细胞培养1、3、7天后，避光在48孔板中加入CCK8溶液，在37℃下再培养2-4h。用分光光度计在波长为450nm处测试溶液的吸光值。CCK8值用吸光度表示，吸光度与材料表面活细胞的数量成正比。
图3为三种细胞(人脐静脉血管内皮细胞HUVEC，人成纤维细胞HSF和角质形成细胞HaCaT)在不同类型生物陶瓷复合材料表面的增殖情况。
图3A-图3C结果显示，培养1，3，7天后，三种细胞在各组生物陶瓷复合材料表面的增殖能力良好，随着时间的延长，细胞数目也相应的增多，且相对于PL和30NAG-PL，三种细胞在10NAG-PL材料上的增殖能力最强。
图3的结果进一步验证了图1-2中扫描电镜所显示的10NAG-PL具有更好的亲水性效果，可以显著提高细胞的增殖能力，且具有显著提高的细胞相容性。
实施例3：研究本发明用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜对于人血管形成细胞的迁移、粘附的影响
将对数期的HUVEC细胞用胰酶进行消化，消化后，将细胞接种在24孔板中，待细胞密度为培养皿底部90％左右时，用无菌的中枪头轻轻划出一条直线，吸去培养基，PBS洗两次。24孔板的上部加上transwell小室，里面加入实施例1制备的材料，加满培养基将细胞置于5％CO2培养箱中培养。培养6-8小时在OLYMPUS显微镜下拍照，统计迁移细胞的数目。
向装有Boyden小室的24孔细胞培养板底部加入不同的材料小室下侧加入600μL含有10％血清的内皮细胞培养基。小室上侧接入100μL含有4×104个细胞的培养基不含血清，于37℃5％CO2培养箱中进行孵育，孵育时间为6-8小时。染色观察。
血管内皮细胞培养48小时，样品从培养基中取出，用浓度为4％的多聚甲醛溶液固定，PBS清洗后，用DAPI染料对细胞核染色。材料表面的细胞的粘附的数目显微镜观察。并且用扫描电镜观察血管内皮细胞在材料上铺展的形态。
图4显示的是本发明用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜可以促进血管内皮细胞的体内迁移。
图4A为细胞结晶紫染色结果，其中相对于空白对照(不添加任何辅料)、PL组、30NAG-PL组，10NAG-PL组呈现更加致密均匀的细胞迁移效果。
图4C显示内皮细胞划线实验迁移的效果，随着时间的增加，细胞逐渐向中间迁移，10NAG-PL组的细胞总体迁移的相对于其他组快。
图4E显示内皮细胞粘附在不同材料表面的静电扫描图，图中显示了内皮细胞的粘附形态，各组材料之间的伸展状态没有明显的差别。
由图4可以说明，相对于PL组和30NAG-PL组，10NAG-PL组可以显著促进内皮细胞的迁移和粘附。
当施用于组织伤口时，随着伤口部位的生物活性陶瓷的降解，硅离子和钙离子会释放进入细胞环境中，刺激促伤口愈合因子的释放，利用其本身的优势去加速伤口愈合，而不需要额外的添加促生长因子等。随着NAGEL含量的增加，30NAG-PL组在纤维的结构组成、亲水性以及伤口愈合能力等方面并没有显著优于10NAG-PL组，考虑到时间和生产成本，以10NAG-PL组为基础，对其其体内促进软组织伤口愈合的能力作进一步研究。
实施例4：体内全层创伤修复实验
用60mg/Kg的剂量对30只18g的雄性BALB/c实验鼠(国家啮齿类实验动物资源中心，中国上海分公司)进行诱导，连续诱导5天，测血糖，血糖值升高的数值达到300mg/dl既可说明小鼠被成功诱导为糖尿病小鼠，可以用于后续的实验。将小鼠背部区域的毛发去除后，建立一个完整的厚度伤口(直径为8mm)。将创面修复材料分别植入小鼠创伤区域，它们分别是：(1)空白对照组(Control)；(2)PL组；(3)10NAG-PL组。实验前，各组材料用75％的酒精浸泡灭菌30min，后用灭菌的PBS清洗2次。植入伤口部位后小鼠背部创伤区域用医用透明敷料固定。手术后，小鼠被分别关在SPF环境下，保证充足水以及食物。利用数码相机在固定的时间点(1，3，5，7，9，11，13天)固定的距离以及角度记录创伤区域的变化情况。
图5为空白对照组、PL组和10NAG-PL组的糖尿病小鼠背部创伤区域，创伤面积随时间的变化情况。
其中，图5A显示糖尿病小鼠创伤修复的效果，第七天时，10NAG-PL组糖尿病小鼠背部创伤面积减少了57％，对照组减少了18％，PL组减少了42％。第13天时，10NAG-PL组糖尿病小鼠背部创伤面积减少了94％，对照组减少了69％，PL组减少了82％。说明10NAG-PL组相对于PL组和空白对照组有明显促进伤口愈合的效果。
其中，图5B显示糖尿病小鼠创伤修复的模拟效果图，以更直观地反映伤口的愈合效率。
其中，图5C显示糖尿病小鼠创伤修复的统计图，从另一角度反应创伤修复的效果。
与空白对照组和PL组相比，10NAG-PL组糖尿病小鼠伤口愈合速度明显更快。
实施例5：研究本发明用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜对小鼠体内的创面修复质量的影响及其相关机理
5.1创伤区域组织形态分析
每组每次5只7天、11天、15天时处死，取出创伤区域周围的组织标本(2mm左右)进行组织分析。
将取得的组织标本用4％的多聚甲醛固定至少24h后，利用分级醇以及二甲苯脱水，并进行石蜡包埋，利用RM2155切片机切取5μm厚切片，采用苏木精和伊红对组织样本进行常规组织染色观察伤口处的表皮增殖情况。Masson三色染色用作观察创伤组织处胶原网络的形成以及表皮迁移情况。利用Image Pro Plus version 6.0(Media Cybernetics,Rockville,MD,USA)进行统计胶原形成量，其中蓝绿色表示胶原纤维。
图6A为7天、11天、15天后，三组动物(Control组，PL组，10NAG-PL组)伤口的Masson’s三色染色情况，其可以反应伤口处上皮组织的生长迁移情况，其中绿色的箭头显示表皮迁移的效果。结果显示，相对于Control组和PL组，10NAG-PL更利于伤口处表皮细胞的再生。
图6B和图6C显示表皮细胞增殖的效果，表明10NAG-PL可以明显促进表皮细胞的生长。
图6E显示角质形成细胞分化的标志物K10的组织免疫荧光的结果，表明15天后，三组糖尿病小鼠创伤区域组织的表皮细胞的分化情况。
图6结果显示，10NAG-PL处理的糖尿病小鼠，可以显著促进糖尿病小鼠表皮细胞的生长、迁移、增殖和分化。
5.2创伤区域胶原累计
第7天和第15天时，提取伤口处组织的蛋白进行免疫印迹分析(Western Blot)实验，分析材料对于伤口处蛋白变化的影响。
第7天和第15天时，提取伤口处组织的RNA，反转成cDNA进行实时-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测伤口处的胶原RNA的表达量。
第15天时，对伤口处组织进行Masson染色。结果图7所示：
图7A显示：提取第7天伤口处组织的蛋白进行免疫印迹分析(Western Blot)实验结果；结果显示10NAG-PL组伤口处的组织胶原表达量最高。
图7B-C：提取第7天伤口处组织的RNA，胶原相关基因的表达，10NAG-PL组的I型胶原和III型胶原的表达量明显升高。
图7D：提取第15天伤口处组织的蛋白进行免疫印迹分析(Western Blot)实验结果。结果显示，10NAG-PL组伤口处组织的基质金属蛋白酶MMP9/MMP2的表达量减少；基质金属蛋白酶抑制剂TIMP1的表达量升高，I型胶原的表达量升高。说明伤口处对细胞质基质ECM的降解减少了，并且细胞质基质ECM的合成开始增加，进一步促进细胞在伤口处的生长和粘附。
图7E：对15天后的伤口处组织进行Masson染色，同样显示了10NAG-PL可以明显增加伤口处组织的胶原合成。
图7的结果可以说明，相对于Control组和PL组，10NAG-PL处理的伤口处的胶原积累增多，而且胶原形态更加有序。
5.3免疫组织荧光染色分析
分别于第7天、第11天和第15天提取伤口部位的皮肤，利用体式显微镜对伤口部位进行拍照，观察伤口处血管新生的情况。将切片后的组织标本(5μm)经过脱蜡处理，在100℃的柠檬酸钠缓冲溶液中浸泡20min，冷却至室温1h，后在4℃下进行一抗(CD31，K10)孵化过夜。随后，将其浸泡在PBS中清洗，室温下进行2h小时的二抗孵化过程。最后，用DAPI对细胞核进行染色。利用荧光显微镜(Leica Confocal microscope)进行观察分析。
图8A为提取三组糖尿病小鼠(Control组，PL组，10NAG-PL组)第7天、第11天和第15天的创伤区域组织的血管新生情况，可以观察到10NAG-PL组的血管新生明显的比其他两组多，伤口处的血管更加密集。
图8B～图8D显示的是糖尿病小鼠在经过材料处理以后第7天，11天，15天的血管生成统计的结果。显示出10NAG-PL在这三个时间点都有明显的促进血管新生的效果。
图8E：显示的是7天伤口部位的血管生成的标志物CD31的组织免疫荧光的情况，结果显示10NAG-PL可以明显增加CD31的表达，进一步说明在7天的时候10NAG-PL可以增加血管生成量。
图8G：显示的是15天伤口部位的血管生成的标志物CD31的组织免疫荧光的情况，结果显示10NAG-PL可以明显增加CD31的表达，进一步说明在15天的时候10NAG-PL可以增加血管生成量。
以上结果显示，10NAG-PL组能够显著促进CD31的表达，即可以明显的增加创伤区域血管的新生。
5.4免疫组织染色分析
于15天的时候取得小鼠伤口处的皮肤，切片后的组织标本，经过脱蜡处理以后，在100℃的柠檬酸钠缓冲液中煮20min，拿出后在室温下放置大约1h冷却至室温，用用0.1％-3％的H2O2去除过氧化氢酶10min。封闭液抗原位点封闭20min，并用PBST清洗，一抗(Ki67,MMP2,α-SMA)孵育过夜。进行显色，然后染苏木精，经过分级脱水以后封片，待观察。
实施例6：研究本发明用于软组织伤口愈合的复合纳米纤维膜的体内降解
取6W左右大小的小黑鼠，将实施例1制备得到的10NAG-PL材料植入小鼠背部皮肤内侧，并将伤口缝合，待到7天，14天，28天的时候将小鼠解剖，观察材料的降解情况。
图9A：结果显示，7天时，10NAG-PL材料表面覆盖一层基膜，有微量的血管通过(图片中绿色箭头)，组织染色分析，材料内部组织浸润比较少。14天时，10NAG-PL材料表面具有明显的基膜覆盖，血管数目增多，并且小鼠组织有微量的浸润入材料。28天时，观察到10NAG-PL材料大部分已经降解，并且材料部位有很多的血管生成，
图9B：组织染色发现，10NAG-PL材料和组织已经融为一体，没有界限，并且降解实验结果和伤口处切片的基本保持一致。表明10NAG-PL材料能够较好地促进伤口愈合，并具有优异的体内降解效果。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。